في الوقت الحقيقي وتقنيات المعاوقة الكهربائية واستنادا لقياس غزو المونولاير خلية من خلايا سرطان بطانة

Rahim, S., Üren, A. A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells. J. Vis. Exp. (50), e2792, doi:10.3791/2792 (2011).

نشر المنتشر من الخلايا الخبيثة يتطلب تدهور الغشاء القاعدي ، الحجز على الخلايا السرطانية في بطانة الأوعية الدموية ، وتراجع من التقاطعات البطانية وأخيرا الغزو والهجرة من الخلايا السرطانية من خلال طبقة بطانة للدخول إلى مجرى الدم كوسيلة من وسائل النقل إلى مواقع بعيدة في البلدان المضيفة ^1-3. مرة واحدة في الدورة الدموية ، وسرطان الخلايا الشعرية التمسك الجدران ويتسرب الى الانسجة المحيطة بها لتشكيل الأورام النقيلي ^4،5. يمكن تكرارها مختلف مكونات الخلية السرطانية تفاعل الخلايا البطانية في المختبر من خلال تحدي أحادي الطبقة من الخلايا البشرية بطانة الوريد السري (HUVEC) مع الخلايا السرطانية. الدراسات التي أجريت مع الإلكترون وعلى النقيض من المرحلة المجهري تشير إلى أن المختبر في تسلسل الأحداث تمثل إلى حد ما في عملية المنتشر في الجسم الحي ^6. هنا ، نحن تصف تقنية المعاوقة الكهربائية ، التي تراقب وتقوم الكمي في الغزو في الوقت الحقيقي من الخلايا البطانية من قبل خلايا الورم الخبيث.

Giaever Keese ووصف لأول مرة تقنية لقياس التقلبات في مقاومة عند السكان من الخلايا تنمو على سطح الأقطاب ^7،8. الصك xCELLigence ، المصنعة من قبل شركة روش ، تستخدم تقنية مشابهة لقياس التغيرات في المعاوقة الكهربائية وخلايا نعلق وانتشار الثقافة في صحن مغطاة بالذهب والتي تغطي مجموعة microelectrode حوالي 80 ٪ من المساحة في أسفل البئر. كما نولي الخلايا وانتشارها على سطح القطب ، فإنه يؤدي إلى زيادة في المعاوقة الكهربائية ^12/09. يتم عرض مقاومة باعتبارها أبعاد المعلمة مؤشر يسمى خلية ، والذي يتناسب طرديا مع المساحة الإجمالية للثقافة النسيج جيدا أن الخلايا التي تغطيها. وبالتالي ، يمكن استخدام الخلية مؤشر لرصد خلية التصاق ، ونشر التشكل ، وكثافة الخلايا.

يستند مقايسة غزو الموضحة في هذه المقالة على التغيرات في المعاوقة الكهربائية في الطور البيني الكهربائي / خلية ، ويبلغ عدد سكانها غزو الخلايا الخبيثة من خلال HUVEC أحادي الطبقة (الشكل 1). تعطيل تقاطعات البطانية ، تراجع من أحادي الطبقة البطانية واستبدال الخلايا السرطانية التي تؤدي إلى تغييرات كبيرة في مقاومة. هذه التغييرات ترتبط مباشرة مع القدرة الغازية من الخلايا السرطانية ، أي غزو من قبل خلايا شديدة العدوانية تؤدي إلى تغييرات كبيرة في مقاومة الخلية والعكس بالعكس. هذا الأسلوب يوفر ميزة شقين على الطرق الحالية لقياس الغزو ، مثل غرفة بويدن والمقايسات matrigel : 1) الخلايا البطانية تفاعل الخلايا السرطانية بشكل وثيق في عملية يحاكي الجسم الحي ، و 2) يتم الحصول على البيانات في واقع والوقت هو أكثر سهولة للقياس الكمي ، في مقابل نقطة النهاية لتحليل أساليب أخرى.

1. إعداد

1. يجب أن يتم تنفيذ جميع الخطوات تحت ظروف معقمة في نسيج الثقافة هود.
2. يتم وضع المحطة في حاضنة xCELLigence 37 درجة مئوية في وجود 5 ٪ CO _2.
3. انخفاض استخدام الخلايا HUVEC مرور ، ويفضل أن لا يزيد مرور 6. أيضا ، تأكد من أن الخلايا ليست أكثر من 75 ٪ متكدسة في وقت الحصاد.
4. تزرع الخلايا في وسائل الإعلام HUVEC - 2 EGM المعاد EGM - 2 مع طقم رصاصة (Lonza العلوم البيولوجية) التي تحتوي على عوامل النمو ، وملاحق ، و 5 ٪ مصل بقري جنيني.
5. يجب إزالة جميع آثار التربسين من الايقاف الخلية بواسطة الخلايا في 200xg الغزل ، وغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني ، وإعادة التعليق عليها لكثافة الخلية المشار إليه.
6. معطف xCELLigence E - 16 صفيحة الجيلاتين مع 0.1 ٪ لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. غسل لوحة مع برنامج تلفزيوني وإضافة EGM - 2 المعاد 100μL وسائل الإعلام. إجراء قراءة فارغة على نظام لقياس المعاوقة xCELLigence الخلفية في غياب الخلايا.

2. توليد HUVEC المونولاير

1. حصاد قارورة شبه متموجة من الخلايا التي HUVEC trypsinization. Resuspend الخلايا في وسائل الإعلام EGM - 2 تشكيل لكثافة النهائي للخلايا 2.5 × ⁵ 10 / مل.
2. إلى كل بئر من خلفية معايرة E - صفيحة تحتوي على 100μL EGM - 2 وسائل الإعلام ، إضافة لتعليق 100μL الخلية HUVEC (2.5 × 10 ⁴ خلايا HUVEC).
3. تثبيت فورا E - بلايت في الصك xCELLigence.
4. برنامج حاسوبي لتنفيذ xCELLigence قراءات مقاومة في 10 دقائق.
5. السماح للخلايا بطانة الأوعية الدموية تنمو ل18-21 ساعة حتى تشكيل أحادي الطبقة ، كما يتضح من تسطيح مؤشر الخلية (الشكل 2).

3. بالإضافة إلى ذلك من غزو الخلايا وتطبيع البيانات.

1. مرة واحدة شكلت المونولاير HUVEC مستقرة ، والخلايا السرطانية عن طريق الحصاد trypsinization وresuspend إلى كثافة النهائي 1 × ⁵ 10 خلايا / مل في وسائل الإعلام التي تستخدم لزراعة الخلايا السرطانية (مثل RPMI أو وسائل الإعلام التي تحتوي على 10 ٪ DMEM FBS)
2. قراءات مقاومة قفة على البرنامج xCELLigence وإزالة E - اللوحة من المحطة.
3. إزالة EGM - 2 وسائل الاعلام التي كتبها الطموح. إضافة تعليق 100μL من ورم الخلايا التي تحتوي على 1 × 10 ⁴ الخلايا. عموما ، وهي نسبة 1:2.5 الخلايا السرطانية : الخلايا البطانية المصنف ، يعمل على نحو أفضل للمقايسة. ومع ذلك ، يمكن أن يكون الأمثل لخطوط نسبة الخلايا الفردية.
4. مكان E - وحة على النظام xCELLigence في الحاضنة ومواصلة مقاومة قراءات في 10 دقائق.
5. يمكن رصد الغزو في الوقت الحقيقي على مدى الساعات القادمة 12/06 وانخفاضا في مؤشر الخلية بسبب تراجع البطانية من التقاطعات والاختراق عن طريق غزو الخلايا السرطانية.
6. تطبيع النتائج إلى وقت بالإضافة إلى غزو الخلايا السرطانية. برنامج xCELLigence تصاريح التطبيع إلى أي نقطة زمنية ، ويمكن الاطلاع النتائج مباشرة في إطار البرنامج.

4. ممثل النتائج :

ويرد مثال لغزو من قبل خلايا المونولاير HUVEC النقيلي وغير المنتشر في الشكل 3. K7M2 خلية عظمية النقيلي الخط. هذه الخلايا التعبير عن مستويات عالية من بروتين رابط ezrin هيكل الخلية ، والتي تمثل خصائص الغازية من هذا الخط الخلية ^13،14. عندما يتم الطعن HUVEC الخلايا مع الخلايا K7M2 ، أن هناك انخفاضا في المقاومة الكهربائية في غضون 6 ساعات. هذا الانخفاض في المقاومة الكهربائية يمثل غزو المونولاير HUVEC من قبل خلايا الورم الغازية. في الخلية K12 الخط ، ومن ناحية أخرى ، ويعرب عن مستويات أقل بكثير من ezrin وبالتالي فهي أقل النقيلي ^13. تحدي المونولاير HUVEC مع نتائج K12 الخلايا في انخفاض حاد في أقل قدر من المقاومة لهذه الخلايا غير قادرة على الانضمام إلى غزو أو من خلال HUVEC أحادي الطبقة (الشكل 3).

الشكل 1. رسم تخطيطي للعملية تدفق العمل لغزو الخلايا البطانية من قبل خلايا الورم. ومطلي على الخلايا HUVEC الجيلاتين المغلفة لوحات الإلكترونية وسمحت لتشكيل المونولاير متموجة. تضاف الخلايا الخبيثة مرة واحدة في شكل أحادي الطبقة ويتم رصد الغزو في الوقت الحقيقي والمؤشر الخلية التغييرات الناجمة عن غزو أحادي الطبقة البطانية.

الشكل 2. HUVEC المونولاير التشكيل. التغيرات في مؤشر الخلية كخلايا HUVEC نعلق على الأقطاب وعلى انتشار الذهب الجيلاتين المغلفة. ويمثل تشكيل المونولاير متموجة من استقرار مؤشر الخلية بعد 18 ساعة.

الشكل 3. غزو ​​خلايا من خلايا عظمية HUVEC K7M2 وK12. انخفاض حاد في سلL - مؤشر يحدث في غضون بضع ساعات لإدخال الخلايا K7M2 المنتشر إلى حد كبير. K12 الخلايا ، ومن ناحية أخرى ، هي أقل النقيلي وغير قادر على اختراق أحادي الطبقة البطانية بكفاءة كما K7M2 الخلايا. ويمثل هذا الانخفاض أقل من حاد في مؤشر الخلية عندما يتم الطعن في المونولاير HUVEC مع K12 الخلايا. يمثل مقاومة السيطرة من المونولاير HUVEC في غياب الخلايا السرطانية. وأجريت التجارب في ثلاث نسخ.

الغزو HUVEC في الوقت الحقيقي هو فحص بسيط وسيلة قوية للغزو بعد الرصد. أنها توفر النتائج في الوقت الحقيقي ، الذي هو ميزة كبيرة على التقنيات التقليدية الأخرى التي تعتمد على تحليل نقطة النهاية. يمكن تعديل لفحص المخدرات اختبار ، والأجسام المضادة ، والبروتينات يغاندس باسم مثبطات أو التحفيز والتشجيع من ورم خبيث. ويمكن تقييم تأثير العوامل المختلفة على الخلايا البطانية / السرطان عبر الحديث كذلك. عند إدخال عوامل خارجية ، مثل عوامل النمو والمخدرات في وسائل الإعلام والثقافة ، فمن المهم للتأكد من أنها لا تؤثر على سلامة المونولاير HUVEC. ويمكن اختبار اضطراب أحادي الطبقة HUVEC من خلال إدخال وكيل الخارجية في غياب الخلايا الغازية ، والتأكد من أنه لا يوجد أي تغيير في مؤشر الخلية. وبالتالي ، ينبغي أن تدرج الضوابط المناسبة كجزء من التصميم التجريبي.

خلية مختلف خطوط مختلفة تظهر الخلايا مؤشر منحنيات كما أنها تشكل المونولاير متموجة. شكل المنحنى ، وكذلك الحد الأقصى خلية مؤشر تحقيقه ، هو الخلية من نوع معين. تظهر الخلايا HUVEC عابرة مميزة تسطيح مؤشر الخلية 4-6 بعد ساعات من البذر ، تليها أخرى لتحقيق الاستقرار في المؤشر أعلى خلية بعد 16-18 ساعة. وبالتالي ، فمن المهم للسماح للخلايا تشكيل المونولاير متكدسة على الأقل 18 ساعة قبل إضافة الخلايا السرطانية.

منذ مؤشر الخلية يعتمد على البيئة الأيونية في الطور البيني الكهربائي / الخلية ، وعوامل مختلفة مثل مورفولوجيا الخلايا ونوعية الخلايا خلايا التصاقات التأثير على مؤشر الخلية ، بالإضافة إلى منطقة أسفل جيدا تغطيتها. وبالتالي ، فإن الانخفاض في مؤشر الخلية ، والذي يحدث عند غزو الخلايا السرطانية ، هي وظيفة لعدة عوامل ، والتي تشمل تراجع من التقاطعات البطانية واللاحقة غزو الخلايا السرطانية.

يتم تصنيعها الصك xCELLigence في ثلاثة أشكال مختلفة : في الوقت الحقيقي الخلية محلل (RTCA) ليرة سورية ، النائب RTCA وموانئ دبي RTCA. الصك SP RTCA يحمل one 96 - E - وحة جيدا في حين أن النائب RTCA صك يمكن أن تعقد ما يصل إلى ست لوحات 96 - E - جيدا في نفس الوقت. وهذا يسمح للالإنتاجية العالية فحص الأدوية والمركبات. وتجرى التجارب في هذه المقالة باستخدام أداة موانئ دبي RTCA ، التي يمكن أن تعقد ثلاث 16 - E - جيدا لوحات. يمكن أن تكون كل محطة عقد E - وحة تعمل بشكل مستقل ، مما يسمح للمستخدمين متعددة لتشغيل التجارب في نفس الوقت. ويمكن أيضا الصك موانئ دبي RTCA أن تستخدم لدراسة الهجرة CIM باستخدام لوحات. هذه هي 16 لوحات جيدة مع الغرف العلوية والسفلية مفصولة terephtalate البولي البولي إثيلين (PET) الغشاء مع حجم المسام وسيطة من 8um. توجد أجهزة الاستشعار الالكترونية على الجانب السفلي للغشاء يسهل اختراقها للغرفة العليا. مجلس النواب بمثابة خزان للجاذب كيميائي للخلايا في مجلس الشيوخ. ومع ذلك ، ميزة كبيرة للمقايسة غزو HUVEC خلال لوحات CIM هو أن لا يقتصر على غزو الخلايا السرطانية في السابق عن طريق حجم المسام ، وغزو الخلايا البطانية يعتمد على الحديث المتبادل بين الورم والخلايا البطانية.

يمكن أيضا فحص غزو HUVEC سيتم تنفيذه على صك Z ECIS ، المصنعة من قبل الفيزياء الحيوية التطبيقية (تروي ، نيويورك). الصك Z ECIS تستخدم تقنية مماثلة في الصك xCELLigence ، مع وجود اختلافات في الصفيف والتشكيلات الكهربائي. لقد أجرينا بنجاح فحوصات غزو HUVEC باستخدام المصفوفات ECIS - 8 أيضا. ومن المهم أن نلاحظ أن مساحة جيدة أسفل أكبر في صفائف ECIS ، الأمر الذي يتطلب عددا أكبر من الخلايا البطانية والورم لتكون مطلية : 2.5 × 10 ⁵ و 1 × 10 ⁵ الخلايا على التوالي.

ويعود الفضل في نشر عن تكلفة هذه المخطوطة من قبل شركة روش العلوم التطبيقية.

وأيد هذا العمل بسخاء من أموال من مؤسسة سرطان الأطفال (بالتيمور ، ماريلاند) ، وبراندون لي كارينغتون مؤسسة (سيلفر سبرينغ ، ماريلاند) ، وزارة الدفاع (W81XWH - 10 - 1-0137) ، والمعاهد الوطنية للصحة (R01CA108641).

نود أن نشكر الدكتور انطون Wellstein وأعضاء مختبره لتبادل خبراتهم ومساعدتنا على تحسين أساليب تقديمها.

1. Klein, C.A. Cancer. The metastasis cascade. Science 321, 1785-1787 (2008).
2. Chiang, A.C.& Massague, J. Molecular basis of metastasis. N Engl J Med 359, 2814-2823 (2008).
3. Orr, F.W., Wang, H.H., Lafrenie, R.M., Scherbarth, S. & Nance, D.M. Interactions between cancer cells and the endothelium in metastasis. J Pathol 190, 310-329 (2000).
4. Bacac, M. & Stamenkovic, I. Metastatic cancer cell. Annu Rev Pathol 3, 221-247 (2008).
5. Christofori, G. New signals from the invasive front. Nature 441, 444-450 (2006).
6. Kramer, R.H. & Nicolson, G.L. Interactions of tumor cells with vascular endothelial cell monolayers: a model for metastatic invasion. Proc Natl Acad Sci U S A 76, 5704-5708 (1979).
7. Giaever, I. & Keese, C.R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proc Natl Acad Sci U S A 81, 3761-3764 (1984).
8. Giaever, I. & Keese, C.R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proc Natl Acad Sci U S A 88, 7896-7900 (1991).
9. Tiruppathi, C., Malik, A.B., Del Vecchio, P.J., Keese, C.R. & Giaever, I. Electrical method for detection of endothelial cell shape change in real time: assessment of endothelial barrier function. Proc Natl Acad Sci U S A 89, 7919-7923 (1992).
10. Whipple, R.A., et al. Epithelial-to-mesenchymal transition promotes tubulin Detyrosination and Microtentacles that enhance endothelial engagement. Cancer Res 70, 8127-8137 (2010).
11. Boyd, J.M., et al. A cell-microelectronic sensing technique for profiling cytotoxicity of chemicals. Anal Chim Acta 615, 80-87 (2008).
12. Khanna, C., et al. The membrane-cytoskeleton linker ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis. Nat Med 10, 182-186 (2004).
13. Ren, L., et al. The actin-cytoskeleton linker protein ezrin is regulated during osteosarcoma metastasis by PKC. Oncogene 28, 792-802 (2009).

0 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.