उपन्यास विरोधी कैंसर औषधि सर्जिकल नमूने के ट्यूमर Explants का उपयोग विकास के लिए विधि

Joshi, K., Demir, H., Yamada, R., Miyazaki, T., Ray-Chaudhury, A., Nakano, I. Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens. J. Vis. Exp. (53), e2846, doi:10.3791/2846 (2011).

घातक glioma के लिए वर्तमान उपचार केवल उपशामक प्रभाव है. चिकित्सकीय विकास के लिए एक बाधा प्रभावकारिता की विसंगति वर्तमान दवा प्रभावकारिता परीक्षण और मरीजों पर प्रभावकारिता द्वारा निर्धारित है. इस प्रकार, दवा प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए उपन्यास और विश्वसनीय तरीके पूर्व नैदानिक ​​चरण में warranted रहे हैं. सेल लाइनों सहित ट्यूमर ऊतकों, इन विट्रो संस्कृति में कैंसर कोशिकाओं के पर्याप्त प्ररूपी, आनुवंशिक और epigenetic परिवर्तन सेल संस्कृति के कृत्रिम वातावरण की वजह से है, जो बगल में मूल ट्यूमर के जीव विज्ञान को प्रतिबिंबित नहीं कर सकते हैं. Immunodeficient चूहों के साथ xenograft मॉडल भी सीमाएं हैं, यानी, प्रतिरक्षा प्रणाली की कमी और microenvironment में आनुवंशिक और epigenetic विसंगतियों interspecies. यहाँ, हम undissociated ट्यूमर ब्लॉक के रूप में घातक glioma की शल्य चिकित्सा नमूनों का उपयोग कर उपचार के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए एक उपन्यास विधि प्रदर्शित करता है. इस विधि को मान्य करने के लिए, वर्तमान पहली पंक्ति chemotherapeutic एजेंट, temozolomide (TMZ), के साथ डेटा का वर्णन कर रहे हैं.

हम हौसले से हटा दिया हमारे प्रयोगों के लिए घातक glioma की शल्य नमूना इस्तेमाल किया. हम TMZ या अन्य दवा उम्मीदवारों, और शल्य चिकित्सा के नमूनों पर ऊष्मायन विश्लेषण द्वारा पीछा intratumoral इंजेक्शन प्रदर्शन किया. यहाँ, हम उपन्यास विरोधी कैंसर उपचार की प्रभावकारिता निर्धारित करने के लिए एक मंच के रूप में इतना है कि हम कम से कम, वर्तमान सीमाओं में से कुछ पर काबू पाने और वर्तमान प्रयोगात्मक बीच मौजूदा खाई को भरने में सक्षम हो सकता है एक ट्यूमर ऊतक explant विधि स्थापित करने की मांग की डेटा और एक वास्तविक रोगी की ट्यूमर पर प्रभावकारिता. इस विधि के लिए ठोस कैंसर के इलाज के लिए उपन्यास chemotherapeutic एजेंट की पहचान में तेजी लाने की क्षमता हो सकती है.

1. मीडिया की तैयारी

1. DMEM/F-12 में (1X), तरल 01:01 (10565-042 - Invitrogen) - मीडिया 10% FBS (GIBCO 16140-071) का उपयोग कर तैयार किया गया था शुद्ध 0.6% अग्रवाल समाधान के साथ, दानेदार (1.01614.1000 - ईएमडी ). बाँझ शर्तों प्रयोग भर में बनाए रखा गया.
2. FBS की मीडिया 5ml की तैयारी के लिए (16140-071 - GIBCO) 45mL DMEM/F-12 (1X) जोड़ा गया है, तरल (10565-042 - Invitrogen) 01:01 50ml के अंतिम मात्रा बना. तैयार मीडिया पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस तापमान पर रखा गया था.
3. अगर समाधान गर्मी माइक्रोवेव पद्धति का उपयोग करके तैयार किया गया था. 0.3 ग्राम दानेदार अगर 50ml आसुत माइक्रोवेव का उपयोग कर पानी में भंग कर दिया गया था. अगर समाधान शांत पानी के स्नान में रखकर 37 डिग्री सेल्सियस तापमान था.
4. हम 1.2 और 1.3 कदम और तैयार स्टॉक समाधान से मीडिया के बराबर मात्रा का इस्तेमाल किया. 0.6% (0.5ml) अगर और 10% FBS-D-MEM/F-12 मीडिया (0.5ml) के अनुपात 01:01 था, 6 अच्छी तरह से प्लेटों के प्रत्येक अच्छी तरह से में एक एमएल की कुल मात्रा बनाने.

2. ऊतक प्रसंस्करण

1. Glioblastoma मल्टीफार्मी (जीबीएम) ऊतकों पैथोलॉजी विभाग से सर्जरी के बाद तुरंत प्राप्त हुए थे. ऊतक जीबीएम के रूप में पैथोलॉजी विभाग से वर्गीकृत किया गया है.
2. ऊतक संदंश का उपयोग सावधानी patri प्लेट को हस्तांतरित किया गया और 3 बार के लिए ठंडा 5ml 1XPBS के साथ धोया.
3. एक शल्य चिकित्सा (पंख २,९७६ 10 #) ब्लेड और forcep (फिशर वैज्ञानिक) के साथ ट्यूमर ब्लॉक (व्यास में लगभग 10 मिमी) बनाने के नमूनों की सीरियल वर्गों dissected नमूने से काट रहे थे.
4. ब्लॉक 6 अच्छी तरह से थाली में स्थानांतरित कर दिया गया. मीडिया के प्रत्येक अच्छी तरह से युक्त था 1ml 1.4 चरण में उल्लेख है. ऊतक हवा करने के लिए पर्याप्त जोखिम ऊतक व्यवहार्य रखने था.
5. ट्यूमर ब्लॉक तो या तो DMSO (5%) या TMZ (2.5 एनएम) के साथ अंतःक्षिप्त थे और 37 में 16 घंटे के लिए incubated डिग्री सेल्सियस humidified 5% सीओ 2 युक्त हवा में. DMSO के 0.1mL (5%) या TMZ लगातार इलाज के लिए विभिन्न स्थानों पर ट्यूमर ब्लॉकों में 3 बार इंजेक्ट किया गया था. दवा इंसुलिन सिरिंज 28G1 / 2 0.37X12.7mm 1ml (सुविधा बिंदु - 26,027) का उपयोग कर इंजेक्ट किया गया था.
6. 16 घंटे के बाद ब्लॉक 3 बार के लिए 5 एमएल 1XPBS साथ धोया गया. ब्लॉक धोने के बाद 10 v / v 24 घंटे के लिए 50 एमएल ट्यूबों में formalin% (Ricca रासायनिक कंपनी) (Basix 5,539,802) 10ml के साथ तय किए गए और एम्बेडेड आयल 4μm वर्गों के लिए कार्रवाई की जाती है.
7. formalin तय अनुभाग बीकर में हलचल प्लेट पर रखा गया था "सं हिट" के साथ और प्रत्येक समाधान में 30 मिनट के लिए निम्नलिखित समाधान के माध्यम से संसाधित. 30% इथेनॉल, 50% इथेनॉल, 75% इथेनॉल, 80% इथेनॉल, 95% इथेनॉल इथेनॉल 100%, और Xylene.
8. ऊतक कागज तौलिए पर blotted किया गया था और पिघल आयल में 30 मिनट के लिए (58 से 60 डिग्री सेल्सियस, फिशर Paraplast आयल) रखा.
9. ऊतक Surgipath ब्लू रिबन आयल का उपयोग molds में एम्बेडेड था, ऊतक एम्बेडेड कमरे के तापमान पर ठंडा किया गया था.
10. आयल एम्बेडेड 4μm ऊतक वर्गों लिया और फिशर प्लस स्लाइड्स पर रखा गया.

3. Immunohistochemistry

Immunohistochemistry के रूप में पहले वर्णित प्रदर्शन किया था ^1.

1. Deparaffinization और पुनर्जलीकरण प्लेस एक रैक में स्लाइड्स और निम्न चरणों का पालन. Xylene 3x5 मिनट (5 मिनट के लिए 3 बार), 3x5 मिनट के लिए 100% इथेनॉल, 1x5 मिनट के लिए 95% इथेनॉल, 1x5 मिनट के लिए 70% इथेनॉल के लिए, 3 मिनट के लिए नल का पानी चला में कुल्ला.
2. गर्मी प्रेरित 1X साइट्रेट (थर्मो वैज्ञानिक - AP9003-500) बफर एक गिलास बीकर में आसुत पानी में पतला में मिलान पुनर्प्राप्ति विसर्जित स्लाइड्स के साथ एंटीजन पुनर्प्राप्ति. एक गर्म थाली (यकीन है कि वर्गों डॉन "टी बंद स्लाइड गिर) पर 15 मिनट के लिए उबाल लें 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्म, सेक्सी समाधान. 1X पीबीएस के साथ 3x5 मिनट के लिए स्लाइड्स कुल्ला.
3. आंतरिक पेरोक्साइड के निषेध मेथनॉल में स्लाइड्स (फिशर साइंटिफिक-A-452-4) 0.3% 15 मिनट के लिए एक गिलास बीकर में हाइड्रोजन पेरोक्साइड (फिशर आसुत जल में वैज्ञानिक - BP2633-500-पतला) के साथ विसर्जित कर दिया. 3x5 मिनट के लिए 1X पीबीएस में कुल्ला.
4. कवर 10% सामान्य बकरी सीरम के साथ ऊतकों अवरुद्ध. एक नम बॉक्स में स्लाइड्स स्थानांतरण और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते हैं. 1X पीबीएस के साथ 3x5 मिनट के लिए स्लाइड्स का धो लें.
5. विशिष्ट मानव - कस्पासे 3 (1:1,000, अनुसंधान एवं विकास प्रणाली, AF835), Ki67 (1:1, Dako, 15,626) 1X पीबीएस साथ पतला: प्राथमिक एंटीबॉडी धारा रात 4 बजे डिग्री सेल्सियस प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ निम्नलिखित सांद्रता में incubated रहे थे. अगले दिन पर 1X पीबीएस 3x10 मिनट में स्लाइड्स कुल्ला.
6. माध्यमिक एंटीबॉडी प्रतिक्रिया एचआरपी लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी के 2-3 बूँदें (प्रणाली कल्पना) के साथ ऊतकों को कवर. एक नम बॉक्स में स्लाइड्स रखो और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते हैं. 3x10 मिनट के लिए 1X पीबीएस के साथ धोएं.
7. Chromogen थपका किट (वेक्टर 4100-प्रयोगशालाओं - एसके) के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के निर्माता प्रोटोकॉल के बाद पता लगाने के लिए जांच का विकास.
8. काउंटर धुंधला hematoxylin के साथ स्लाइड्स विसर्जित (10-15 एस econds, यकीन है कि डॉन "टी उग आया थपका संकेत बनाने के लिए) 3 मिनट के लिए नल का पानी चलाने के साथ कुल्ला..
9. निर्जलीकरण विसर्जित निम्नलिखित क्रम में स्लाइड्स, 5 मिनट, 5 मिनट के लिए 95% इथेनॉल, 3x5 मिनट के लिए 100% इथेनॉल, 3x5 मिनट के लिए Xylene के लिए 70% इथेनॉल.
10. Permount बढ़ते अभिकर्मक (फिशर वैज्ञानिक-सपा 15-100) के साथ स्लाइड पर्ची कवर.
11. छवियाँ ओलिंप प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी (DP-72) .3.11) का उपयोग कर ले जाया गया. सभी प्रयोगों में, विशिष्ट लेबलिंग प्राथमिक एंटीबॉडी के बिना नकारात्मक नियंत्रण के द्वारा पुष्टि की गई.

4. प्रतिनिधि परिणाम:

हम glioblastoma मल्टीफार्मी (जीबीएम) के शल्य चिकित्सा नमूने एकत्र. रोगियों (TMZ) temozolomide सहित पूर्व chemotherapies बिना पहली सर्जरी. चित्रा-1a में Gadolinium वृद्धि के साथ T1 भारित एमआरआई की छवि सर्जरी से पहले सही ललाट लोब में एक बढ़ाया ट्यूमर का प्रदर्शन किया. पश्चात छवि (चित्रा 1b) सर्जरी के बाद घाव के उप - योग हटाने की पुष्टि की. शल्य चिकित्सा के ऊतकों नैदानिक ​​निदान के उद्देश्य के लिए पैथोलॉजी विभाग के लिए भेजा गया था, और शेष नमूनों स्वीकृत संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) ओहियो स्टेट यूनिवर्सिटी मेडिकल सेंटर में प्रोटोकॉल के तहत ऊतक खरीद करने के लिए प्रोसेस किया गया. Hematoxylin और Eosin धुंधला (एच एंड ई) परिगलन की उपस्थिति, pseudopallisading कोशिकाओं, और microvascular प्रसार (चित्रा 1 - ग) का प्रदर्शन किया. इस प्रकार, इन ट्यूमर histopathologically जीबीएम के रूप में निदान किया गया. ध्यान से, ट्यूमर TMZ के बिना 48 घंटे के लिए ऊष्मायन निम्नलिखित explants जीबीएम की cytoarchitecture बनाए रखा इसके विपरीत, 72 घंटे या उससे अधिक समय के लिए ऊष्मायन के साथ, हम नमूनों में गाढ़ा नाभिक की संख्या में वृद्धि देखा, ट्यूमर कोशिकाओं के कुछ करने के लिए शुरू सुझाव है. apoptosis से गुजरना. नतीजतन, अब ऊष्मायन के बाद ट्यूमर ऊतकों बद क्षेत्रों है कि ट्यूमर कोशिकाओं, जो preferentially और परिगलित क्षेत्रों (नहीं दिखाया डेटा) के आसपास मनाया गया खो दिया होता है.

आदेश में जांच के लिए यदि इन ट्यूमर explant नमूने मज़बूती से दवा प्रभावकारिता परीक्षण के प्रयोजन के लिए उपयोग किया जा सकता है, हम TMZ उपचार के प्रभाव का परीक्षण किया. चित्रा-2 इस अध्ययन में प्रयोगों के प्रवाह का प्रतिनिधित्व करता है. हाल ही में एक अध्ययन में संकेत दिया है कि TMZ के intratumoral इंजेक्शन इस दवा ^के दो प्रणालीगत प्रशासन के तुलना में घातक glioma के विकास के नियंत्रण पर अधिक शक्तिशाली प्रभाव पड़ता है. 16 घंटे के लिए ऊष्मायन के बाद, इन explants आयल और धारावाहिक वर्गों धुंधला के लिए तैयार थे के साथ एम्बेडेड थे. TMZ का इलाज जीबीएम ऊतकों की immunohistochemistry नियंत्रण के नमूनों के साथ तुलना में बान की 67 पॉजिटिव ट्यूमर कोशिकाओं की पर्याप्त कमी का प्रदर्शन किया. बारी में, एक apoptosis मार्कर, कस्पासे-3, के साथ immunohistochemistry TMZ का इलाज glioma नमूनों और नियंत्रण के नमूने (चित्रा 3) के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर उपज नहीं था.

TMZ के साथ उपचार के प्रभाव को आगे इस explant परख या तो इन विट्रो संस्कृति या प्रवाह cytometry में के साथ के साथ संयोजन द्वारा विशेषता थी. विशेष रूप से, हम स्टेम सेल की तरह ट्यूमर कोशिकाओं (SCLTC) पर प्रभाव को निर्धारित करने की मांग की. इसलिए, TMZ के साथ intratumoral उपचार के बाद, हम क्षेत्र बनाने परख और इन ट्यूमर explants के प्रवाह cytometry प्रदर्शन किया. TMZ - इलाज नमूनों व्यक्तिगत एकल कक्षों में अलग थे और इन एकल कक्षों के एक कम घनत्व में वरीयता प्राप्त थे सीरम मुक्त bFGF और EGF साथ पूरक मध्यम में 96 अच्छी तरह प्लेटें में (1 microliter प्रति कक्ष या कम). नियंत्रण समूह में, ट्यूमर explants से ट्यूमर क्षेत्रों के गठन के बाद 7 दिन ऊष्मायन मनाया गया. यह देखते हुए कि क्षेत्र ^{गठन SCLTC} 3, 4 के एक संपत्ति है, एक नशीली दवाओं के उपचार द्वारा ट्यूमर क्षेत्रों की संख्या में परिवर्तन SCLTC पर प्रभाव को इंगित करता है. इसी तरह, एक कोशिका की सतह मार्कर, CD133 के साथ अलग ट्यूमर explants के प्रवाह cytometry, SCLTC पर प्रभाव को सत्यापित किया गया. यदि जीबीएम में विषम ट्यूमर कोशिकाओं में SCLTC चुनिंदा एक नशीली दवाओं के उपचार द्वारा नाश कर रहे हैं, एक की भविष्यवाणी सकता है कि उपचार (नहीं दिखाया डेटा) प्रवाह cytometry द्वारा CD133 पॉजिटिव अंश की कमी का पता लगाने चाहिए.

एक रोगी जीबीएम की Figure.1 चुंबकीय अनुनाद (एमआरआई) छवियों पूर्व ऑपरेशन चित्रा-1a और बाद ऑपरेशन चित्रा 1b के प्रतिनिधि के आंकड़े. चित्रा -1 सी ताजा जीबीएम ऊतक नमूने के एच एंड ई धुंधला हो जाना है. मूल आवर्धन, 40x.

चित्रा. 2 ब्लॉक संस्कृति प्रयोग के प्रयोगात्मक प्रवाह चित्रा - 2a. विकृति विज्ञान के विभाग से प्राप्त ताजा शल्य जीबीएम की छवि. चित्रा-2b ट्यूमर ब्लॉक की मदद सर्जिकल ब्लेड के साथ 10mm छोटे टुकड़ों में विच्छेदन से पता चलता है. चित्रा - 2c ट्यूमर इंसुलिन सिरिंज का उपयोग कर ब्लॉक के नशीली दवाओं के उपचार (TMZ) है.

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चित्रा. जीबीएम ऊतक सक्रिय कस्पासे-3 और Ki67 के साथ DMSO या TMZ साथ इंजेक्शन ब्लॉक के 3 immunohistochemistry. Immunohistochemistry . Hematoxylin परमाणु धुंधला के लिए इस्तेमाल किया गया था. मूल आवर्धन, 40x.

वर्तमान पूर्व नैदानिक ​​प्रयोगात्मक मॉडल में दवा की प्रभावकारिता और रोगियों में प्रभावकारिता के बीच एक अंतर है. अधिक विशेष रूप से, ब्रेन ट्यूमर अनुसंधान के क्षेत्र में, उपन्यास और विश्वसनीय तरीके के लिए आवश्यक है कि मौजूदा तरीकों के साथ दवा मूल्यांकन और रोगियों में प्रभावकारिता के बीच मौजूदा अंतर को भरने में मदद मिलेगी. इस अध्ययन में वर्णित परख एक अतिरिक्त संपत्ति है, अगर नहीं एक समाधान है, प्रभावित रोगियों की प्रयोगात्मक डेटा और परिणाम की विसंगति को भरने की सुविधा है.

इन विट्रो सेल संस्कृतियों में preferentially कुछ ट्यूमर कोशिका प्रकार संस्कृति शर्तों की परवाह किए बिना विस्तार, और इसके अलावा में केवल पूरे ^{ट्यूमर का} एक subpopulation 5. प्रतिनिधित्व करते हैं, कृत्रिम सेल विस्तार के आनुवंशिक और प्ररूपी परिवर्तन होता है और लंबी अवधि के सेल संस्कृतियों के साथ अनिवार्य है . प्रमुख बाधाओं के लिए घातक glioma का इलाज ट्यूमर कोशिकाओं, दोनों एक ही ट्यूमर के ^भीतर और ^{ट्यूमर 6} नमूने, 7 के बीच की विविधता है. इसलिए, चयनात्मक संवर्धन, ट्यूमर कोशिकाओं का एक निश्चित आबादी का एक प्रकार या किसी अन्य की परवाह किए बिना, एक उपयुक्त विषम ट्यूमर कोशिकाओं पर कोई chemotherapeutic एजेंट की प्रभावकारिता निर्धारित ^{करने का} मतलब 8 9 ब्रेन ट्यूमर का कोई भी पशु मॉडल की एक subpopulation से प्राप्त नहीं किया जा सकता है ट्यूमर कोशिकाओं को एक subpopulation पर दवा की प्रभावकारिता पर रोशनी, शेड बल्कि पूरे ट्यूमर नहीं है.

कई सीमाओं, दूसरे हाथ पर, अभी भी इस ट्यूमर explant विधि में रहते हैं. ऐसा ही एक सीमा के इलाज के अपेक्षाकृत छोटी अवधि है. घातक ट्यूमर कोशिकाओं के बाद से सबसे करने के लिए प्रतिरोध हासिल करने के लिए, नहीं तो सब, समय पर चिकित्सा, अल्पकालिक ट्यूमर कोशिकाओं के विकास के प्रारंभिक नियंत्रण रोगी लंबी अवधि के पूर्वानुमान के द्वारा नहीं किया जा परिलक्षित हो सकता माना जाता है, के रूप में हाल ही में एक विरोधी के साथ सूचित किया गया था angiogenic एजेंट, ¹⁰ bevacizumab. इस प्रकार, इस explant परख करने के लिए एक लंबी अवधि के लिए ऊतकों के संरक्षण के लिए प्रोटोकॉल के सुधार से आगे की जांच के साथ आवश्यक है. एक अन्य सवाल SCLTC पर ट्यूमर में एक दवा परीक्षण के एक विशिष्ट प्रभाव है. यह देखते हुए कि SCLTC अपेक्षाकृत घातक glioma, उपन्यास विरोधी कैंसर दवाओं है कि potently उन्मूलन SCLTC warranted है की पहचान के लिए वर्तमान उपचार के लिए प्रतिरोधी रहे हैं. इस संबंध में, हम वर्तमान के बाद के साथ neurosphere बनाने परख (नहीं दिखाया डेटा है) के रूप में इन विट्रो प्रयोगों में इस explant परख गठबंधन चाहते हैं. हम प्रभाव के बारे में और अधिक जानने के SCLTC पर इन संयुक्त assays के माध्यम से दवा उम्मीदवार की अगर कोई है, उम्मीद है. अन्त में, ट्यूमर के नमूनों के छोटे ब्लॉकों का उपयोग कर पूरे ट्यूमर सेल आबादी को प्रतिबिंबित नहीं, के रूप में पारंपरिक ट्यूमर सेल लाइनों या शल्य चिकित्सा के नमूनों से प्राथमिक संस्कृतियों के साथ मामला है. ये अलग मुद्दों, ट्यूमर संवहनी आला सहित stroma, के संरक्षण ट्यूमर कोशिकाओं के लिए पर्यावरणीय कारकों निस्र्पक में सहायक है. इसलिए, इस परख के लिए एक और अधिक physiologically प्रासंगिक शर्त के तहत किसी भी चिकित्सात्मक रणनीतियों का मूल्यांकन करने की क्षमता हो सकती है.

यहाँ, हम जीबीएम की शल्य चिकित्सा नमूनों की explants के साथ दवा प्रभावकारिता परीक्षण के लिए एक परख की स्थापना की. वास्तव में, परीक्षण शल्य चिकित्सा नमूनों के साथ, हमने पाया है कि TMZ के एक प्रत्यक्ष इंजेक्शन जीबीएम नमूनों में प्रसार को कम कर देता है. इस ऊतक explant विधि सैद्धांतिक रूप से अन्य ठोस कैंसर के लिए लागू है और परिसंपत्ति प्रदान करता है एक मरीज के ट्यूमर पर दवा प्रभावकारिता, जो उम्मीद है कि हमें नैदानिक ​​परीक्षणों में कैंसर के लिए एक और विफलता से बचने में मदद मिलेगी निर्धारित है.

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

अमेरिकन कैंसर सोसायटी (MRSG-08-108-01), विन्सेन्ट जे Sgro / अमेरिकी ब्रेन ट्यूमर एसोसिएशन, और मैं Nakano के लिए खान परिवार फाउंडेशन.

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