मॉरिस जल सीखने और स्मृति घाटे के लिए भूलभुलैया टेस्ट अल्जाइमर रोग मॉडल चूहे में

Bromley-Brits, K., Deng, Y., Song, W. Morris Water Maze Test for Learning and Memory Deficits in Alzheimer's Disease Model Mice. J. Vis. Exp. (53), e2920, doi:10.3791/2920 (2011).

मॉरिस पानी भूलभुलैया (MWM) पहली बार 1981 में न्यूरोसाइंटिस्ट रिचर्ड जी मॉरिस द्वारा स्थापित किया गया था क्रम में hippocampal निर्भर स्थानिक memoryand ^लंबी अवधि के एक स्थानिक स्मृति के अधिग्रहण सहित सीखने का परीक्षण. MWM एक अपेक्षाकृत सरल प्रक्रिया आम तौर पर छह दिन परीक्षण, मुख्य स्थानिक मंच (छिपा हुआ) के बीच भेदभाव किया जा रहा लाभ और गैर स्थानिक ^{(दिखाई} मंच) 04/02 शर्तों के निर्वाचकगण है. इसके अलावा, MWM परीक्षण पर्यावरण गंध निशान ⁵ हस्तक्षेप कम कर देता है. इस कार्य के लिए बड़े पैमाने पर तंत्रिका जीव विज्ञान और स्थानिक सीखने और स्मृति के neuropharmacology के अध्ययन में इस्तेमाल किया जा नेतृत्व किया गया है. MWM ⁶ अल्जाइमर ^{रोग, 7} जैसे neurocognitive विकारों के लिए कृंतक मॉडल के सत्यापन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. इस प्रोटोकॉल में हम परीक्षण सीखने और स्मृति और डेटा विश्लेषण सामान्यतः अल्जाइमर रोग के ट्रांसजेनिक मॉडल चूहों में प्रयोग किया जाता के लिए MWM के ठेठ प्रक्रिया पर विचार - विमर्श किया.

1. तैयार

1. यंत्र की तैयारी
   1. 150cm की एक व्यास और 50cm (1 छवि) की गहराई के साथ एक परिपत्र पूल प्राप्त करते हैं. काले चूहों का उपयोग कर यदि एक सफेद पूल का इस्तेमाल किया जाना चाहिए, अगर सफेद चूहों का उपयोग कर, एक काले पूल का इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
   2. ऐसी है कि परीक्षण किया जा रहा पशु परीक्षण के दौरान experimenter नहीं देख सकते हैं कमरे की व्यवस्था करो. इस पर्दे या कमरे डिवाइडर के साथ पूरा किया जा सकता है.
   3. कमरे के बारे में उच्च विपरीत स्थानिक cues के प्लेस, और / या जो पानी की सतह से ऊपर होगा एक स्थान पर पूल के इंटीरियर पर.
   4. एक सफेद पूल, एक काले पूल के लिए स्पष्ट plexiglass के लिए सफेद - पूल में एक 10cm व्यास मंच रखें. पानी के साथ पूल भरें जब तक मंच पानी की सतह के ऊपर 1cm है. चलो कमरे के तापमान (22 डिग्री सेल्सियस) पानी के लिए संतुलित. पानी के तापमान के आधार पर एक से तीन दिन ले, या वैकल्पिक रूप से गर्म पानी करने के लिए संतुलन की गति जोड़ा जा सकता है.
2. सॉफ्टवेयर की तैयारी
   1. कंप्यूटर सॉफ्टवेयर में पूल जांचना ताकि कैमरा पिक्सेल आधारित जानकारी से भौतिक दूरी जानकारी बना सकते हैं. पूल 4 quadrants में फूट डालो. एक चर क्षेत्र है जो प्रत्येक परीक्षण के साथ बदल सकते हैं के रूप में मंच क्षेत्र निर्दिष्ट करें. प्रत्येक चक्र में, एक और एक पूल के केंद्र में - 5 मंच subzones बनाएँ. अंशांकन सहेजें और शेष दिनों के लिए परीक्षण में उपयोग करें. (उदाहरण अंजीर देखें 2.).
   2. अधिकतम 60 सेकंड के रूप में परीक्षण के समय सेट. यदि इस समय से पहले माउस मंच पाता है, सॉफ्टवेयर प्रोग्राम करने के लिए परीक्षण को रोकने जब मंच पाया जाता है.
   3. प्रोग्राम स्वचालित रूप से ट्रैकिंग शुरू करने के लिए, जब experimenter बाहर निकलता है परीक्षण क्षेत्र निर्दिष्ट करें. किसी भी "प्रतिबिंब" न्यूनतम विकल्प आपके सॉफ्टवेयर संकुल प्रदान करता है उपयोग.
   4. पथ लंबाई, बच विलंबता, और समय प्रत्येक चक्र में खर्च को ट्रैक करें.

2. दिन 1: दर्शनीय प्लेटफार्म

1. कंप्यूटर प्रोग्राम
   1. पूल अंशांकन ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर में लोड.
   2. 5 परीक्षण एक अंतर परीक्षण अपने प्रयोग के लिए उपयुक्त अंतराल के साथ बनाएँ. मंच स्थान और शुरू करने के लिए प्रत्येक परीक्षण के साथ अलग दिशा के कार्यक्रम. एक उदाहरण प्रोटोकॉल के लिए देखें तालिका 1.
2. प्रक्रिया परीक्षण
   1. उनके आवास की सुविधा से व्यवहार कमरे में चूहों स्थानांतरण. एक क्षेत्र है जहां वे पूल या स्थानिक cues नहीं देख सकते हैं में चूहों रखें. परीक्षण से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए उन्हें नए वातावरण को समायोजित.
   2. एक झंडा करने के लिए अपने दृश्यता को बढ़ाने के मंच पर रखें.
   3. परीक्षण शुरू करने के लिए, पूंछ के आधार द्वारा माउस घर के पिंजरे से उठा. समर्थन माउस के रूप में आप यह परीक्षण क्षेत्र में लाना. पूंछ के आधार द्वारा माउस भारोत्तोलन, धीरे पानी में माउस जगह है, पूल के किनारे का सामना करना पड़ रहा है. जल्दी से परीक्षण क्षेत्र छोड़ दें.
   4. यदि 60 सेकंड से पहले माउस मंच पाता काट, माउस मंच पर 5 सेकंड के लिए रहने के लिए अनुमति देते हैं तो यह अपने घर पिंजरे के लिए वापस. यदि माउस मंच नहीं मिल रहा है, मंच पर माउस जगह है और यह 20 सेकंड के लिए यह अपने घर पिंजरे लौटने से पहले वहाँ रहने के लिए अनुमति देते हैं.
   5. निशान में सभी चूहों के लिए दोहराएँ. एक अलग मंच स्थान और दिशा शुरू के साथ प्रत्येक बाद परीक्षण शुरू करो, के रूप में आप अपने सॉफ्टवेयर में क्रमादेशित है.
   6. जब परीक्षण पूरा हो गया है, उनके आवास की सुविधा के लिए चूहों वापसी. चूहे से सूख रहे हैं और normothermia पहले पशु की सुविधा के लिए लौटने का आश्वासन दिया है.
   7. अगले दिन के लिए तैयार करने में, मंच से ध्वज को हटा दें और पूल करने के लिए अतिरिक्त पानी जोड़ने के लिए सतह के नीचे 1cm के लिए मंच डूब.

3. 2-5 दिन: छुपे हुए प्लेटफार्म

1. कंप्यूटर प्रोग्राम
   1. पूल अंशांकन ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर में लोड.
   2. 5 परीक्षण एक अंतर परीक्षण अपने प्रयोग के लिए उपयुक्त अंतराल के साथ बनाएँ. कार्यक्रम मंच सभी परीक्षणों और दिन भर में एक ही स्थिति में रहने का स्थान, लेकिन शुरू दिशा प्रत्येक परीक्षण के साथ प्रत्येक दिन अलग है,.
2. प्रक्रिया परीक्षण
   1. काले चूहों के लिए, पूल करने के लिए गैर विषैले, सफेद, पाउडर तापमान रंग जोड़ने और मिश्रण अच्छी तरह से. पर्याप्त ऐसी है कि जलमग्न मंच पानी की सतह से दिखाई नहीं है पेंट का प्रयोग करें. सफेद चूहों के लिए, साफ पानी और एक स्पष्ट plexiglass मंच के साथ एक काले पूल का इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
   2. 2.2.6 के लिए 2.2.3 चरणों का पालन करें.

4. दिन 6: जांच परीक्षण

1. कंप्यूटर प्रोग्राम
   1. पूल अंशांकन ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर में लोड.
   2. कोई मंच क्षेत्र के साथ 1 परीक्षण है, और एक शुरुआत दिशा बनाएँ. दिशा मंच दिनों 2-5 पर इस्तेमाल किया वृत्त का चतुर्थ भाग से दूर शुरू की पसंद है. निशान लंबाई 60 सेकंड के लिए सेट करें.
2. प्रक्रिया परीक्षण
   1. पूल से मंच निकालें.
   2. 2.2.6 के लिए 2.2.3 चरणों का पालन करें.

5. डेटा विश्लेषण

1. प्रत्येक दिन और प्रत्येक माउस औसत के लिए 5 परीक्षण प्रत्येक विषय की परीक्षा के लिए एक एकल पथ लंबाई और भागने विलंबता देने के लिए. उचित संयुक्त त्रुटि की गणना. 6 दिन के लिए, बस पथ लंबाई, बच विलंबता, और समय प्रत्येक माउस के लिए मंच वृत्त का चतुर्थ भाग में खर्च इकट्ठा.
2. यदि कोई 1 दिवस पर समूहों के बीच मतभेद मौजूद हैं, यह संभावना सीखने और स्मृति के बजाय दृष्टि के साथ एक समस्या है. केवल विश्लेषण के साथ आगे बढ़ना अगर कोई मतभेद 1 दिन पर देखा जाता है.
3. सीखने curves अपने डेटा सेट के लिए उपयुक्त आँकड़ों का उपयोग कर के लिए 2-5 दिन की तुलना करें. एक steeper वक्र तेजी से कार्य अधिग्रहण का प्रतिनिधित्व करता है, एक shallower वक्र कार्य अधिग्रहण में कमी का प्रतिनिधित्व करता है. 5 दिन 2 दिन से ANOWA डेटा विश्लेषण का उपयोग कर रहे हैं.
4. 6 दिन के लिए, पहले सीखा मंच वृत्त का चतुर्थ भाग में बिताए, अपने डेटा सेट के लिए उपयुक्त आंकड़े का उपयोग कर समय के प्रतिशत की तुलना करें. मंच वृत्त का चतुर्थ भाग में बिताए समय के एक उच्च प्रतिशत स्मृति प्रतिधारण के एक उच्च स्तर के रूप में व्याख्या की है.

6. प्रतिनिधि परिणाम

हम मॉरिस पानी भूलभुलैया ई. (7) रोगजनन और valproic एसिड (Vpa) ट्रांसजेनिक ई. मॉडल चूहों में ई. उपचार (6) के लिए दवा क्षमता पर hypoxia के प्रभाव की जांच परीक्षण का इस्तेमाल किया है. चित्रा 3 प्रतिनिधि परिणाम हम APP23 ई. माउस मॉडल (6) में Vpa स्मृति घाटे पर प्रभाव पर हमारे अध्ययन में बताया है. 1 दिन (दिखाई मंच परीक्षण), वहाँ इलाज Vpa और नियंत्रण समूहों (छवि 3A) विलंबता में और पथ लंबाई (छवि 3A) यह दर्शाता है कि दोनों समूहों के समान मोटर और दृश्य क्षमताओं के बीच कोई अंतर नहीं है. हम इस से लगता है चूहों मंच झंडी दिखाकर रवाना किया और आसपास के वातावरण में cues देखने के लिए सक्षम हैं, और acceptably तैर कर सकते हैं. 2-5 दिनों के लिए (4 से छिपा मंच परीक्षण के दिन 1) उदाहरण के भागने विलंबता (छवि -3 सी) और समूहों के बीच पथ लंबाई (चित्र 3 डी) में एक अंतर से पता चलता है, सुझाव है कि Vpa इलाज चूहों नियंत्रण की तुलना में काफी बेहतर प्रदर्शन किया समय के साथ. पिछले दिन (6 दिन) दिखाने पर जांच के निशान परिणाम है कि बार की संख्या है, चूहों तीसरे वृत्त का चतुर्थ भाग है, जहां छिपा मंच पहले रखा गया था में कूच काफी Vpa नियंत्रण (3E छवि) की तुलना में उपचार के साथ अधिक से अधिक था. इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि Vpa उपचार काफी स्मृति APP23 चूहों में देखा घाटे में सुधार है.

चित्रा 1. मॉरिस पानी भूलभुलैया दिखाई मंच परीक्षण दिन के लिए उपकरण सेटअप. पूल कमरे experimenter का उपयोग डिवाइडर से परिरक्षित है . स्थानिक cues के दीवारों पर स्थित हैं, और शायद पूल के इंटीरियर पर रखा है, पानी की सतह से ऊपर, अगर वांछित. पूल साफ पानी से भरा है, सतह के ऊपर 1cm स्थित मंच के साथ. एक ध्वज दृश्यता को बढ़ाने के मंच पर रखा गया है.

चित्रा 2. कोई भूलभुलैया ™ वीडियो ट्रैकिंग प्रणाली पूल अंशांकन प्रदर्शन से स्क्रीन पर कब्जा पूल ऊपर से एक RTV24 digitizer के साथ एक काले और सफेद अनुरूप ट्रैकिंग कैमरे द्वारा देखा जाता है. कई क्षेत्रों के सॉफ्टवेयर के भीतर परिभाषित कर रहे हैं और कुल पूल 4 quadrants में विभाजित है. एक पांचवें, मंच क्षेत्र में प्रवेश किया है जो परीक्षण भर में पांच संभावित स्थानों के साथ भिन्न हो सकते हैं: NW, पूर्वोत्तर, दप, एसई, या केंद्र. एक अंशांकन लाइन (केंद्र में ticked लाइन) भौतिक दूरी पिक्सेल दूरी में परिवर्तित करने के लिए सॉफ्टवेयर की अनुमति देने के लिए जोड़ा जाता है.

चित्रा 3. मॉरिस पानी भूलभुलैया के लिए प्रतिनिधि का परिणाम है. 7 महीने APP23 ट्रांसजेनिक मानव स्वीडिश उत्परिवर्ती एपीपी जीन ले चूहों दैनिक Vpa (n = 30 चूहों) या वाहन समाधान इंजेक्शन (n = 30 चूहों) के एक महीने के बाद के दौरान (ए) परीक्षण किया गया . दिखाई मंच परीक्षण के पहले दिन, इलाज Vpa और APP23 चूहों पर नियंत्रण के मंच पर दिखाई बचने के लिए एक समान विलंबता प्रदर्शन किया. पी> 0.05 टी परीक्षण छात्र द्वारा (बी) Vpa का इलाज और नियंत्रण APP23 चूहों दिखाई मंच परीक्षण में दिखाई मंच पर भागने से पहले इसी तरह तैराकी दूरी थी . पी .05> द्वारा छात्र टी परीक्षण (सी) छिपा मंच परीक्षणों में, Vpa इलाज APP23 चूहों एक छोटा करने के लिए 3 ^Rd और 4 ^वें दिन, पी पर छिपा मंच पर <एनोवा द्वारा 0.001 बच विलंबता दिखाया (डी). Vpa - इलाज APP23 चूहों 3 ^Rd और 4 ^वें दिन, पी पर छिपा मंच पर एनोवा द्वारा 0.01 <भागने से पहले एक छोटा स्विमिंग लंबाई था (ई) 6 दिन जांच परीक्षण में, Vpa इलाज APP23 चूहों कूच . में तीसरे वृत्त का चतुर्थ भाग है, जहां छिपा मंच पहले रखा गया था नियंत्रण की तुलना में काफी अधिक बार. * पी <, 0.005 छात्र के टी - परीक्षण द्वारा. (रूपांतरित और प्रायोगिक चिकित्सा 205, 2781-2789, 2008, रॉकफेलर यूनिवर्सिटी प्रेस, मूलतः मेड doi जे ऍक्स्प में प्रकाशित जर्नल से reprinted.. 10.1084/jem.20081588) (6).

तालिका 1. नमूना पानी भूलभुलैया प्रोटोकॉल *
* नोट कैसे दोनों मंच की स्थिति और 1 दिन पर दिशा बदलने के लिए शुरू, जबकि 2-5 दिनों पर मंच की स्थिति निरंतर बनी हुई है जबकि शुरू दिशा परिवर्तन. 6 दिन पर, वहाँ कोई मंच और एक एकल परीक्षण है. 6 दिन के लिए शुरू दिशा पिछले मंच स्थान (SW) से दूर इतना है कि चूहों पहले सीखा मंच वृत्त का चतुर्थ भाग में प्रवेश करने से पहले कुछ दूरी की यात्रा करना चाहिए.

आयु, लिंग, प्रजातियों, और तनाव मतभेद MWM (8) प्रदर्शन प्रभावित करते हैं. अध्ययन से संकेत मिलता है कि आयु वर्ग के चूहों MWM में खराब प्रदर्शन किया है, जबकि पुरुष कृन्तकों महिलाओं की तुलना में बेहतर प्रदर्शन, अतिरिक्त, फ्लोटिंग (9, 10) चूहों की तुलना में चूहों में और अधिक स्पष्ट है. इसलिए, इन तत्वों के सभी परीक्षणों भर में बराबर होना चाहिए. सबूत भी पता चलता है कि जोर दिया पशुओं MWM (11) में और अधिक खराब प्रदर्शन है, इस प्रकार जो पर्यावरणीय कारकों जैसे तापमान, प्रकाश और शोर तनाव, कारण हो सकता है, और निगरानी की जानी चाहिए कार्य पर स्थिर रखा है.

सभी प्रयोगों के ब्रिटिश कोलंबिया पशु की देखभाल और उपयोग समिति और CIHR दिशानिर्देशों के विश्वविद्यालय के अनुसार में आयोजित की गई.

यह काम स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान कनाडा (CIHR), टाउनसेंड परिवार, और जैक ब्राउन और परिवार अल्जाइमर रिसर्च फाउंडेशन (करने के लिए किया गया था) द्वारा समर्थित किया गया. अल्जाइमर रोग में कनाडा अनुसंधान चेयर की धारक है. पीएल NSERC अलेक्जेंडर ग्राहम बेल कनाडा ग्रेजुएट छात्रवृत्ति डॉक्टरेट अनुसंधान पुरस्कार और स्वास्थ्य अनुसंधान के वरिष्ठ स्नातक छात्रावस्था के लिए माइकल स्मिथ फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया.

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