JoVE   
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Biology

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Neuroscience

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Immunology and Infection

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Clinical and Translational Medicine

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Bioengineering

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Applied Physics

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Chemistry

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Behavior

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Environment

|   

JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms I

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms II

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Automatic Translation

This translation into Arabic was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Biology

دراسة السن التي تعتمد على عدم الاستقرار الجيني باستخدام س. خميرة يفسبن الزمني النموذجي

1, 1, 1

1Andrus Gerontology Center, Department of Biological Sciences, Department of Molecular and Computational Biology, University of Southern California, Los Angeles

Article
    Downloads Comments Metrics
     

    Summary

    نحن هنا وصف مجموعة من فحوصات الحمض النووي الطفرة التي يمكن دمجها مع نموذج الخميرة عمر زمني لدراسة الجينات / المسارات التي تنظم أو تساهم في عدم الاستقرار الجيني DNA أثناء الشيخوخة.

    Date Published: 9/29/2011, Issue 55; doi: 10.3791/3030

    Cite this Article

    Wei, M., Madia, F., Longo, V. D. Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model. J. Vis. Exp. (55), e3030, doi:10.3791/3030 (2011).

    Abstract

    وقد كشفت الدراسات باستخدام نموذج الجعوية السكيراء مسارات عمر الشيخوخة التنظيمية التي يتم حفظها جزئيا في أعلى حقيقيات النوى 1-2. ويمكن أيضا البساطة وقوة النموذج الخميرة الشيخوخة يمكن استكشافها لدراسة الحمض النووي من التلف والصيانة الجينوم فضلا عن مساهماتها في الأمراض أثناء الشيخوخة. هنا ، نحن تصف نظام لدراسة الطفرات الحمض النووي التي تعتمد على سن ، بما في ذلك استبدال القاعدة ، والطفرات الإطار التحول ، إعادة ترتيب الكروموسومات الإجمالي ، ومثلي / homeologous إعادة التركيب ، فضلا عن النشاط النووي إصلاح الحمض النووي من خلال الجمع بين الحياة تمتد زمنيا الخميرة مع الحمض النووي بسيطة الضرر والمقايسات الطفرة. وينبغي أن الأساليب المذكورة هنا تسهيل التعرف على الجينات / المسارات التي تنظم عدم الاستقرار الجيني والآليات التي تكمن وراء الطفرات الحمض النووي التي تعتمد على العمر والسرطان في الثدييات.

    Protocol

    نموذجين عمر قد تستخدم لدراسة الشيخوخة في S. البيرة : وRLS CLS. يستند تمتد تنسخي الحياة (الناشئين) (RLS) على الملاحظة أن خلايا الخميرة الأم الخضوع لعدد محدود من الانقسامات 3-6. سوف نركز على عمر زمني (CLS) ، وهو نموذج يقوم على بقاء الزمني لعدم تقسيم الخميرة في الثقافة أو في لوحات 7-11. نوع الخميرة البرية تنمو لمدة 10-12 ساعة في المتوسط ​​الدكستروز الاصطناعية (SDC) كاملة . عندما يخفض مستوى السكر ، ومفاتيح من الخميرة تخمر لتنفس ، ووصف عملية التحول ثنائي خطوات النمو. الخلايا تستمر في الانقسام ببطء خلال مرحلة ما بعد ثنائي خطوات النمو لنحو 48 ساعة قبل دخول G 0 الاعتقال. معدل الأيض من الخلايا لا يزال مرتفعا حتى اليوم 5-6 (0 اليوم هو يوم التلقيح). يمكن الوصول إلى بقاء الخلية على مر الزمن من خلال النسبة المئوية للخلايا زمنيا الشيخوخة ، وعينات من كل يومين ، والتي يمكن الخروج G 0 اعتقال وشكل مستعمرات على لوحات YPED الغنية.

    1. الخميرة عمر زمني (CLS) في الثقافة السائل

    1. تلقيح مستعمرة واحدة في 1 مل الاصطناعية المتوسطة الجلوكوز كاملة (SDC ، الجدول 1) ، واحتضان بين عشية وضحاها مع اهتزاز (220 دورة في الدقيقة) حتى 30 درجة مئوية. وينبغي إعداد اللقاح ثلاث من المستعمرات مستقلة عن كل الضغوط لتوفير النسخ المتماثلة البيولوجية.
    2. تمييع الثقافة بين عشية وضحاها الى مركز ايداع الاوراق المالية متوسطة جديدة (عادة 10 مل) إلى OD ،05-0،1 = (~ التخفيف 1:100) ، واحتضان مع اهتزاز (220 دورة في الدقيقة) حتى 30 درجة مئوية. وتعتبر هذه النقطة مرة 0 يوم من الشيخوخة الزمني. الحفاظ على نسبة 01:05 للثقافة / دورق حجم (10 مل الثقافة في 50 مل ، أو للتجارب أطول / كبير 25 مل ثقافة في 125 مل) لضمان التهوية السليمة.
    3. بدءا من اليوم 3 ، 2 إزالة aliquots من 10 ميكرولتر من القارورة ، تمييع 10،000 مرات في الماء تعقيمها ، 10 ميكرولتر الثقافة المخفف (أي 10 4 -10) على YEPD (1 خلاصة الخميرة ٪ و 2 ٪ bacto ببتون ، الدكستروز 2 ٪ و 2 ٪ أجار) لوحات ، واحتضان عند درجة 30 ل48-72 ساعة قبل أن يتم فرز تشكيل مستعمرة توحيد (كفو).
    4. ويعتبر يوم 3 CFU بقاء 100 ٪. وينبغي تعديل عوامل التخفيف من ثقافة الشيخوخة في الأيام اللاحقة وفقا لذلك لضمان ~ 2-10 المستعمرات في مقايسة CFU (على سبيل المثال ، 10 4 -10 ، -30 10 4 ، 10 3 -10 ، الخ). لخلايا النوع البري في الخلفية DBY746 ، وتصل إلى CLS بقاء نحو 1 ٪ اليوم 11.

    اختلافات في جدوى الفحص الموقعي ما يلي :

    • الحد من السعرات الحرارية (CR) بالتقادم الجلوكوز. التخفيف من الثقافة بين عشية وضحاها في المتوسط ​​الجلوكوز SC محدودة (مثل 0.5 أو 0.05 ٪ بدلا من الجلوكوز القياسية 2 ٪) يؤدي عادة إلى انخفاض الكثافة السكانية التشبع في اليوم 3 ، لكنها مددت يعني الكثير والقصوى (10 ٪ بقاء على قيد الحياة) عمر 12.
    • لCR المدقع / التجويع ، ويغسل في اليوم 3 ثقافة المرحلة الثابتة (عادة 10 مل ، كما في الخطوة 3 أعلاه) مع الماء تعقيمها (خلايا resuspend في حجم مساو من الماء وتدور إلى أسفل في 2500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق ، كرر 3 مرات). Incubationof الخلايا في الماء يحاكي حالة المجاعة التي قد تواجهها الخميرة في البرية. كل يومين في وقت لاحق ، يجب غسلها بالماء ثقافة الشيخوخة تعقيمها ومعلق في حجم مساو من الماء لإزالة أي المغذيات سراحهم من الخلايا الميتة lysed. إجراء فحص العينات التي جدوى ثقافة الشيخوخة على النحو المبين أعلاه. وأدى هذا الشرط إلى مضاعفة حجم المجاعة تقريبا CLS يعني في السلالة البرية DBY746 نوع 12.

    2. البقاء في فحص الموقع

    في ثقافة السائل ، وهو جزء صغير من الخلايا على قيد الحياة قد عادت إلى دورة الخلية وينمو استخدام المواد المغذية الباقية أو تلك شكل سراح lysed الخلايا الميتة في المتوسط ​​، وهو النمط الظاهري يسمى إعادة نمو / 13 يلهث. قمنا بتطوير نظام السلامة على اساس واحد لوحة التي تستخدم auxotrophy من سلالة DBY746 (trp1) للتحايل على إعادة نمو / يلهث المشكلة والسماح أيضا اختبار تأثير التعرض المستمر أو الحرمان من المواد الغذائية المختلفة أو المثيرات الخارجية على الخميرة CLS 11. في هذا الموضع مقايسة جدوى أيضا نموذج يحاكي عمر تنسخي ان هذه الخلايا تتعرض باستمرار إلى وفرة المواد الغذائية لمدة التحليل العمر.

    1. تلقيح مستعمرة واحدة في 1 مل الاصطناعية المتوسطة الجلوكوز كاملة (SDC) ، واحتضان بين عشية وضحاها مع اهتزاز (220 دورة في الدقيقة) حتى 30 درجة مئوية. وينبغي إعداد اللقاح لا يقل عن ثلاثة من المستعمرات مستقلة عن كل الضغوط لتوفير النسخ المتماثلة البيولوجية.
    2. السماح للثقافة أن تنمو الخلايا إلى ~ 8 10 / مل (OD 600 = ~ 10) ، ويخفف من المياه لتعقيمها culturewith 100-200 cell/10 ميكرولتر (عادة 10 4 أضعاف تمييع) و1000 cells/10 ميكرولتر (10 3 اضعاف اضعاف).
    3. لوحة two aliquots من 10-30 ميكرولتر الثقافة المخفف على أحد التربتوفان وحة SDC التسرب. إلىص كل سلالة ، وإعداد مجموعة من 8-20 لوحات وصفت وفقا لكثافة الطلاء (على سبيل المثال ، 10 4 أضعاف المخفف ، لوحة 10 أو 10 ميكرولتر 4 -10 ، -30 10 4 ، 10 3 -10 ، -30 10 3 ، الخ) ، والتي تضمن يمكن الاعتماد 1-10 مستعمرات تحسبا للبقاء انخفضت خلال الشيخوخة.
    4. احتضان لوحة وضعت في 30 درجة مئوية لمدة التحليل العمر.
    5. في يوم من الطلاء ، وبعد ذلك كل يوم 2 ، إزالة واحد لوحة وإسقاط الحكيم إضافة 0.5 مل تريبتوفان (2 ملغ / مل) للسماح للخلايا قابلة للحياة في النمو. احتضان لوحة عند درجة 30 ل48-72 ساعة إضافية. عد CFU عن الجدوى يوم بالإضافة التربتوفان. يعتبر CFU يوم طلي بقاء 100 ٪.

    اختلافات في جدوى الفحص الموقعي ما يلي :

    • عمر الخلايا على لوحات أجار (المدقع حالة المجاعة). YPED إضافة 1 مل 2X بدلا من التربتوفان في أيام لاحقة للسماح للنمو وCFU عدد 14.
    • عمر الخلايا على لوحات متوسطة مع التربتوفان التسرب كاملة الاصطناعية مع مختلف مصادر الكربون ، وتركيزات مختلفة مثل الجلوكوز (تقييد السعرات الحرارية بالتقادم الجلوكوز) ، ومصادر مختلفة مثل الكربون الإيثانول ، الجلسرين وحمض الخليك 14. إضافة 1 الجلوكوز مل / حل التربتوفان (الجلوكوز 20 ٪ والتربتوفان 1mg/ml) للسماح للنمو والعد كفو.
    • التلاعب المغذيات الأخرى ، مثل النيتروجين.

    3. الحمض النووي من التلف وتيرة الطفرة خلال الشيخوخة الزمني

    Canavanine المقاومة (هل ص) وتسلسل can1
    ويمكن تقييم عفوية تردد طفرة من خلال قياس وتيرة المقاومة canavanine (هل ص) في الثقافات زمنيا الشيخوخة. طفرات في الجين (YEL063) CAN1 التي بترميز أرجينين بيرمياز البلازما ، ويمكن أيضا تقديم خلايا مقاومة للمستعمرات التماثلية أرجينين L - R canavanine.Can جمعها في نقطة زمنية مختلفة يتم حفظها لاستخراج الحمض النووي والتسلسل الجيني لاحقة من CAN1 الجينات ، والتي يمكن أن توفر البيانات الطيف الطفرة (مساح مع الطفرة ، SoftGenetics).

    استبدال قاعدة (التربتوفان reversions +)

    سلالات مع 289 trp1 تحتوي على طفرة العنبر (C403T) في تسلسل TRP1 الترميز. قياس تواتر 289 trp1 إلى الارتداد + 15 التربتوفان يسمح تقدير معدل استبدال قاعدة أثناء الشيخوخة الزمني الخميرة.

    الإطار تحول الطفرات

    واليس -- سلالة EH150 (ماتا ، lys2ΔBglII ، trp1 - Δ ، his3 - Δ200 ، ura3 - 52 ، ade2 - 1o) المرافئ طفرة lys2ΔBgl الثاني الذي تم بناؤه عن طريق إدراج 4 النيوكليوتيدات لإنشاء تقييد الثاني BGL موقع الانزيم في الجين LYS2 . الناتج +4 التحول في إطار قراءة نتائج مفتوحة في auxotrophy ليسين التي يمكن تغييره عن طريق الطفرات الإدراج / حذف الصغيرة 16-17.

    إعادة ترتيب الكروموسومات الإجمالي (GCRs)

    للكشف عن إعادة ترتيب الكروموسومات الإجمالي (GCRs) ، ولدت لدينا سلالة متحولة ، الذي HXT13 (YEL069) ، ترميز نقل هيكسوز زائدة للغاية ، وقد تعطلت بسبب شريط URA3 18. HXT13 يقع 7.5 كيلوبايت telomeric لCAN1 على الكروموسوم خامسا الطفرات في الجينات وCAN1 URA3 كلا تجعل الخلايا المقاومة للL - 5 - canavanine وfluoroorotic حمض (5FOA) ، على التوالي. النظر في وتيرة منخفضة من الطفرات النقطة التي تحدث في كل من الجينات ، وتحليل الترددات يمكن ص ص 5FOA يوفر تقدير GCRs التي تؤدي إلى فقدان كل من الجينات.

    مثلي وhomeologous تأشب

    لرصد مستوى مماثل (100 ٪) وإعادة التركيب homeologous (91 ٪) خلال الشيخوخة الزمني ، ولدت لنا المسوخ التي البلازميدات خطي (HIS3 : إنترون - IR - URA3) تحمل إما 100 ٪ يكرر مقلوب مثلي (IRS) (pSR406 ) أو 91 ٪ homeologous المستقلين (pSR407) في موضع HIS3 19. تأشب بين المستقلين يسمح للتعبير عن بروتين His3 الوظيفية.

    1. في موازاة فحص صلاحية العادية (كما هو موضح أعلاه) ، وإزالة مبلغ مناسب من الخلايا من الشيخوخة الثقافة ،
      1. لطفرة ص ، هل تبدأ الخلايا 2x10 7 ~ (200 ميكرولتر من الثقافة لمدة 3 أيام) ؛
      2. لانعكاس + الحزب ، تبدأ الخلايا ~ 8 10 (500-1000 ميكرولتر من الثقافة لمدة 3 أيام) ؛
      3. اليس لطفرة الإطار + التحول ، وتبدأ مع خلايا ~ 8 10 (500-1000 ميكرولتر من الثقافة لمدة 3 أيام) ؛
      4. لGCRs ، وتبدأ مع خلايا 8 2 - 3x10 (2-3 مل من الثقافة لمدة 3 أيام) ؛
      5. لإعادة التركيب وhomeologous مثلي ، وتبدأ مع وتيلدا؛ 5x10 7 الخلايا (200-500 ميكرولتر من الثقافة لمدة 3 أيام) ؛
      ضبط كمية الطلاء وفقا للانخفاض في مجموع الجدوى وزيادة في وتيرة الطفرة خلال الشيخوخة الزمني (الجدول 2). في حالة من التوتر مع النمط الظاهري hypermutator (مثل تلك التي مع أوجه القصور في إصلاح الحمض النووي) ، تقليل كمية العينات وفقا لذلك.
    2. بيليه الخلايا مع المقعد العلوي آلة طرد مركزي (6000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق).
    3. Resuspend الخلايا في الماء 1 مل تعقيمها ، وبيليه الخلايا مرة أخرى.
    4. Resuspend الخلية بيليه في 100 ميكرولتر من المياه. لوحة الخلايا ،
      1. هل يمكن لطفرة ص ، على الآرجنين - التسرب الاصطناعية لوحات متوسطة كاملة (SDC - الارجنتين ، على أن تستكمل مع 60 سلفات L - canavanine ميكروغرام / مل) ؛
      2. لانعكاس + الحزب ، على التربتوفان - التسرب لوحات (SDC - TRP) ؛
      3. اليس لطفرة الإطار تحول + ، على يسين - التسرب لوحات (SDC - ليز) ؛
      4. لGCRs ، على الآرجنين التسرب ، لوحات (SDC - الارجنتين) تستكمل مع 5FOA (1 ملغ / مل) ، وL - canavanine سلفات (60 ميكروغرام / مل) ؛
      5. لإعادة التركيب وhomeologous مثلي ، على الحامض الاميني ، لوحات التسرب تستكمل مع اللبن (2 ٪).
    5. العد CFUs بعد حضانة 3-4 أيام "في 30 درجة مئوية. هو تطبيع وتيرة التحول إلى عدد من الخلايا قادرة على البقاء.

    مكمل لفحص صلاحية في الموقع ، التي تعتمد على سن التربتوفان + الارتداد ، اليس + يمكن أيضا الإطار تحول الطفرة ، إعادة التركيب ، أو يمكن أن يكون درس في ص الذين تتراوح أعمارهم بين الخلايا على طبق من ذهب.

    1. خلايا لوحة (~ 10 8 خلايا / لوحة) إلى التربتوفان ، اليس ، صاحب التسرب ، أو L - canavanine الاصطناعية لوحات متوسطة كاملة (كما هو موضح أعلاه).
    2. كل يومين (أو في نقطة زمنية من الفائدة) ، والنتيجة المستعمرات الناشئة حديثا.
    3. وتقدر وتيرة الطفرة التي تطبيع المستعمرات الناشئة حديثا العدد الكلي للخلايا قابلة للحياة في يوم معين.

    4. توليف Translesion (TLS)

    قد تحور وتيرة العصر التي تعتمد على زيادة إشراك جزيء زيادة الضرر ، وحماية الخلوية تقلصت / إصلاح ، وزيادة الخاطئة إصلاح الحمض النووي (مثل Polζ التي تعتمد على التوليف translesion ، TLS) خلال الشيخوخة. على سبيل المثال ، طويلة الأمد sch9 المسوخ Δ المعرض مرتفعة من SOD2 التعبير ، وانخفضت التعبير عن انزيم عرضة للخطأ إصلاح الحمض النووي Rev1 20. نحن هنا وصفا للمقايسة الجمع معطوب القالب واستخراج الحمض النووي النووية كلها لتقييم TLS في المختبر.

    1. يعد استخراج النووية كما وصفها وانغ وآخرون 21 ؛ قياس تركيز البروتين مقايسة BCA (بيرس).
    2. إضافة 0 ، 5 ، 10 أو 20 ميكروغرام من مقتطفات النووية إلى 50 ردود فعل (الحجم النهائي) ميكرولتر TLS العازلة التي تحتوي على (20 ملي HEPES ، 7 ملم MgCl 2 ، 1 ملم DTT ، 25 مم كلوريد الصوديوم ، ودرجة الحموضة 7.8) ، μMdNTPs 200 و 100 نانومتر 5' - 32 P - 12 - المسمى مير التمهيدي (5' - CGA TGG GGA TAC - 3 ') إلى قالب صلب 48 سورمير تحتوي على الحمض النووي من التلف من الفائدة (5' - ATA TCG CTG GTA CTA ATG ATT AAC GAC TXA AGC ACG TCC GTA CCA TCG - 3 "، الذي X هو الموقع المتضرر ، على سبيل المثال ، abasic الموقع ، أوكسو 8 - G ، الخ).
    3. احتضان الخليط حتى 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، أن ينهي تفاعل مع إضافة 2.5 EDTA ميكرولتر (20 ملم) و 2 ميكرولتر من بروتين K (10 ملغ / مل).
    4. تنقية استخراج الحمض النووي مع الفينول وهطول الأمطار الايثانول.
    5. Resuspend الحمض النووي في 50 ميكرولتر من العازلة تحميل هلام (98 formamide ٪ ، 20 ملي EDTA ، وصبغة).
    6. لحل هذه المنتجات على تجميع المواد الهلامية translesion بولي أكريلاميد 19 ٪.
    7. كميا باستخدام TLS phosphorimaging (الشكل 1).

    5. ممثل النتائج

    كنا عادة بحساب CFU في اليوم 3 والبقاء على قيد الحياة بنسبة 100 في المئة في تحليل السائل CLS القياسية. يمكن تركيبها على بقاء النسبة في الأيام التالية لحساب الوسط (50 ٪ بقاء على قيد الحياة) والحد الأقصى (10 ٪ بقاء على قيد الحياة) الحياة يمتد 12. النتائج مدى الحياة في الحصول عليها من فحص صلاحية الموقع بشكل عام بما يتفق مع تلك التي تستخدم في فحص السائل CLS ، ولكن مع تخفيض متوسط ​​العمر الافتراضي ، والذي يرجع جزئيا إلى حقيقة أن تتعرض باستمرار إلى الخلايا المغذية. وجود السكر يثبط النشاط الحماية الخليوي على النحو الذي أظهر انخفاض transactivation الاستجابة للضغط النفسي عامل النسخ مثل Msn2 / 4 و 12 Gis1.

    عصر الطفرة التي تعتمد على تردد يختلف إلى حد كبير على خلفية توتر ، والتلاعب الجيني ، والظروف والثقافة ، والعمر. ويبين الجدول 2 النتائج التي تم الحصول عليها نموذجية في السلالة البرية من نوع (DBY746).

    مكون ز / L
    D - غلوكوز 20
    كبريتات الامونيوم 5
    قاعدة النيتروجين (-AS/-AA) 1.8
    NaH2PO4 1.4
    ملغم / لتر
    الأدينين 80
    L - ارجينين 40
    L - حمض الأسبارتيك 100
    L - حمض الجلوتاميك 100
    الحامض الأميني L - 80
    L - آيسولوسين 60
    L - يسين 120
    L - يسين 60
    L - الميثيونين 80
    L - فينيلالاناين 60
    L - سيرين 400
    L - ثريونين 200
    تريبتوفان L - 80
    L - التيروسين 40
    L - حمض أميني أساسي 150
    اليوراسيل 80

    الجدول 1. الاصطناعية المتوسطة الجلوكوز كاملة ، ومركز ايداع الاوراق المالية (تعديل الرقم الهيدروجيني إلى 6.0 مع هيدروكسيد الصوديوم). 4 أضعاف الفائض من الحامض الاميني ، يتم تضمين يسين ، التريبتوفان ، واليوراسيل لتعويض auxotrophy من سلالة DBY746.

    اليوم 3 (يعني ± SEM) حتى (خلال الشيخوخة)
    يمكن ص 1،76 ± 0،12 X10 -6 6-8 -6 X10
    TRP + انعكاس 6،60 ± 1،70 X10 -8 1،60 X10 -6
    LYS + الإطار تحول تحور 3،00 ± 0،78 X10 -8 0،70 X10 -6
    GCRs 0،62 ± 0،10 X10 -8 0،30 X10 -6
    تأشب مثلي 5،55 ± 2،74 X10 -6 27.00 X10 -6
    Homeologous تأشب 0،12 ± 0،04 X10 -6 0،48 X10 -6

    الجدول 2. الترددات طفرة نموذجي نوع من الخلايا البرية (DBY746) أثناء الشيخوخة الزمني.

    الشكل 1
    الشكل 1. النتيجة توليف translesion (TLS) 20. وحضنت مقتطفات النووية من مرحلة اليوم من العمر 3 ثابتة من النوع البري (DBY746) والخلايا sch9 Δ متحولة مع التالفة أو abasic قوالب موقع المحتوية على الحمض النووي لمدة 30 دقيقة في 30 درجة مئوية. يشار إلى المنتجات التي TLS الصلبة (مع قالب تالفة) أو منقط (مع قالب معطوب) خطوط. لم يكن هناك أي التوليف translesion لوحظ في استخراج النووية من المسوخ Δ sch9. يشار الاشعال مجانا من السهم مفتوحة.

    Discussion

    السائل ثقافات الشيخوخة في وقت ما يحمل إعادة نمو / النمط الظاهري يلهث 13 ، مما يعقد التحليل CLS. إعادة نمو يحدث عادة عندما يكون أكثر من 90-99 ٪ من السكان قد فقدت قدرتها على البقاء. وكثيرا ما يرتبط هذا النمط الظاهري مع الاكسدة زيادة و / أو حماية انخفض في الخلية. على سبيل المثال ، وتواتر هذا النمط الظاهري أكثر من الضعف في الخلايا التي تفتقر عصاري خلوي ديسموتاز الفائق ويقلل إلى حد كبير في المسوخ طويلة الأمد (على سبيل المثال ، أو sch9 Δ Δ ras2) أو المسوخ overexpressing الفائق dismutases 22. في الممارسة العملية ، نحدد إعادة النمو وزيادة في البقاء أو تحقيق الاستقرار في البقاء لمدة 3 عينات متتالية في مرحلة الشيخوخة وفيات مرتفعة خلال الزمني.

    السن التي تعتمد على ترددات مختلفة من الطفرات الحمض النووي اعتمادا كبيرا على خلفية توتر ، والتلاعب الجيني ، والظروف والثقافة ، فضلا عن إعادة نمو يلهث / والبقاء على قيد الحياة ضئيلة جدا. وينبغي القيام بها قبل التجارب في نقطة زمنية مثل يعني بقاء والحد الأقصى لكثافة مع الطلاء المختلفة لفحوصات لتحديد الطفرة طفرة مدى التردد قبل تحليل performingthe النطاق الكامل مدى الحياة. وينبغي دائما نوع السلالة البرية ستدرج في فترة الطفرة الحياة أو تردد في دراسة موازية لأية معاملة أو متحولة الوراثية ، بحيث يمكن أن تمثل ما بين التجربة ، عن الاختلافات. وينبغي أن تدرج المقلدة بيولوجية متعددة في الدراسة ؛ والسائل على حد سواء ، والبقاء في المقايسات / الطفرة الموضع ينبغي القيام بها لتأكيد النتائج.

    بدلا من التركيز على نوع واحد محدد من تحور الحمض النووي ، والتنميط من عدم الاستقرار الجيني العمرية التي تعتمد على استخدام فحوصات متعددة في تركيبة ، قد تسلط الضوء على أضرار الحمض النووي DNA محددة ونظام إصلاح الأضرار (ق) التي تسهم في عدم الاستقرار الجيني التي تعتمد على سن. على سبيل المثال ، يلاحظ وجود زيادة كبيرة في إعادة ترتيب الكروموسومات الإجمالي (GCRs) ، بالمقارنة مع تلك الطفرات الحمض النووي الأخرى ، ونوع الخميرة البرية يشير إلى وجود كسر elevationof حبلا ضعف و / أو الانخفاض. مثلي في غير الغاية الانضمام (NHEJ) خلال الخميرة ترتيب زمني الشيخوخة (الجدول 2). اقترح الطيف طفرة can1 (تسلسل الجين CAN1) تم الحصول عليها في الشيخوخة الخميرة البرية من نوع زيادة في الضرر التأكسدي خلال الشيخوخة الزمني وعرضة للخطأ إصلاح الحمض النووي ، في حين أنه ، في المدى عاش المسوخ Δ sch9 ، الحمض النووي من التلف التأكسدي وأقل ولوحظ انخفاض كبير في التوليف عرضة للخطأ translesion 20.

    يمكن أن الأساليب المذكورة هنا أنفق إجراء مزيد من الدراسة التي تعتمد على سن عدم الاستقرار الجيني. على سبيل المثال ، يمكن عزل الخلايا هادئة وغير هادئة ، من ثقافات ثابتة المرحلة الخميرة باستخدام أسلوب التدرج الكثافة التي وصفها آخرون ألين 23. جنبا إلى جنب مع الطفرة المقايسات وصفها هنا ، لقد ذكرت لنا أن جزءا كبيرا من العمر التي تعتمد على الطفرات تنشأ من خلايا هادئة ، بدلا من الخلايا ، وتقسيم التالفة أو أفكارك 20،24.

    Disclosures

    الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

    Acknowledgements

    نشكر S. جينكس روبرتسون وHeidenreich هاء لتوفير البلازميدات وسلالات الخميرة ؛ لمساعدة مقايسة TLS withthe P. فام غودمان والقوة المتعددة الجنسيات. وأيد هذا العمل ، في جزء منه ، من قبل الاتحاد الاميركي لبحوث الشيخوخة ومنحة المعاهد الوطنية للصحة AG20642 ، AG025135.

    References

    1. Longo, V.D. & Finch, C.E. Evolutionary medicine: from dwarf model systems to healthy centenarians? Science. 299, 1342-1346 (2003).
    2. Fontana, L., Partridge, L. & Longo, V. D. Extending healthy life span--from yeast to humans. Science. 328, 321-326 (2010).
    3. Mortimer, R.K. & Johnston, J.R. Life span of individual yeast cells. Nature. 183, 1751-1752 (1959).
    4. Muller, I., Zimmermann, M., Becker, D., & Flomer, M. Calendar life span versus budding life span of Saccharomyces cerevisiae. Mech. Ageing Dev. 12, 47-52 (1980).
    5. Jazwinski, S.M., Egilmez, N.K., & Chen, J.B. Replication control and cellular life span. Exp. Gerontol. 24, 423-436 (1989).
    6. Pohley, H.J. A formal mortality analysis for populations of unicellular organisms (Saccharomyces cerevisiae). Mech Ageing Dev. 38, 231-243 (1987).
    7. Longo, V.D., Gralla, E.B., & Valentine, J.S. Superoxide dismutase activity is essential for stationary phase survival in Saccharomyces cerevisiae. Mitochondrial production of toxic oxygen species in vivo. J Biol Chem. 271, 12275-12280 (1996).
    8. Longo, V. The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae. Studies of superoxide dismutase, Ras and Bcl-2. Thesis, University of California Los Angeles. (1997).
    9. Fabrizio, P., Pozza, F., Pletcher, S.D., Gendron, C.M., & Longo, V.D. Regulation of longevity and stress resistance by Sch9 in yeast. Science. 292, 288-290. (2001).
    10. Fabrizio, P. & Longo, V.D. The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae. Aging Cell. 2, 73-81 (2003).
    11. Madia, F., Gattazzo, C., Fabrizio, P. & Longo, V.D. A simple model system for age-dependent DNA damage and cancer. Mech Ageing Dev. 128, 45-49 (2007).
    12. Wei, M., et al. Life span extension by calorie restriction depends on Rim15 and transcription factors downstream of Ras/PKA, Tor, and Sch9. PLoS Genet. 4, e13 (2008).
    13. Fabrizio, P., et al. Superoxide is a mediator of an altruistic aging program in Saccharomyces cerevisiae. J Cell Biol. 166, 1055-1067 (2004).
    14. Wei, M., et al. Tor1/Sch9-regulated carbon source substitution is as effective as calorie restriction in life span extension. PLoS Genet. 5, e1000467, DOI:10.1371/journal.pgen.1000467 (2009).
    15. Capizzi, R.L. & Jameson, J.W. A table for the estimation of the spontaneous mutation rate of cells in culture. Mutat Res. 17, 147-148 (1973).
    16. Heidenreich, E., Novotny, R., Kneidinger, B., Holzmann, V., & Wintersberger, U. Non-homologous end joining as an important mutagenic process in cell cycle-arrested cells. Embo J. 22, 2274-2283 (2003).
    17. Heidenreich, E. & Wintersberger, U. Replication-dependent and selection-induced mutations in respiration-competent and respiration-deficient strains of Saccharomyces cerevisiae. Mol Gen Genet. 260, 395-400 (1998).
    18. Chen, C. & Kolodner, R.D. Gross chromosomal rearrangements in Saccharomyces cerevisiae replication and recombination defective mutants. Nat Genet. 23, 81-85 (1999).
    19. Datta, A., Adjiri, A., New, L., Crouse, G.F., & Jinks Robertson, S. Mitotic crossovers between diverged sequences are regulated by mismatch repair proteins in Saccaromyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 16, 1085-1093 (1996).
    20. Madia, F., et al. Oncogene homologue Sch9 promotes age-dependent mutations by a superoxide and Rev1/Polzeta-dependent mechanism. J Cell Biol. 186, 509-523 (2009).
    21. Wang, Z. Controlled expression of recombinant genes and preparation of cell-free extracts in yeast. Methods Mol Biol. 313, 317-331 (2006).
    22. Fabrizio, P., Pletcher, S.D., Minois, N., Vaupel, J.W., & Longo, V.D. Chronological aging-independent replicative life span regulation by Msn2/Msn4 and Sod2 in Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett. 557, 136-142, DOI:S0014579303014625 [pii] (2004).
    23. Allen, C., et al. Isolation of quiescent and nonquiescent cells from yeast stationary-phase cultures. J Cell Biol. 174, 89-100 (2006).
    24. Madia, F., et al. Longevity mutation in SCH9 prevents recombination errors and premature genomic instability in a Werner/Bloom model system. J Cell Biol. 180, 67-81 (2008).

    Comments

    0 Comments

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter