Separation av enda DNA, dubbel-strängat DNA och RNA ur miljösynpunkt Viral gemenskapen med hjälp av hydroxyapatit Kromatografi

1. Beredning av lösningar

Innan du utför hydroxyapatit kromatografi måste fosfat buffertar vara förberedd och hydroxyapatit måste vara ordentligt släckt.

1. 1M Fosfat, pH 6,8: I en 1L flaska löses 119.98g av natrium monobasiskt i 1L sterila, DEPC behandlade H ₂ O. Förbered en 1M Dinatriumvätefosfat lösning i en 1L flaska genom att lösa 141.96g av Dinatriumvätefosfat i 1L sterila, DEPC behandlade H ₂ O. Kombinera mono-och di-lösningar i förhållandet 1:1. Placera kolven på en uppståndelse tallrik och blanda med hjälp av en magnetisk omrörare. Justera pH till 6,8 genom tillsats av natriumhydroxid (för att höja pH-värdet) eller fosforsyra (för att minska pH).
2. 0.12M fosfatbuffert: I en 500 ml flaska, kombinera 30ml 1 M Fosfat Solution, 6,8 pH, 2,5 ml av 10% natriumdodecylsulfat (SDS) och 5 ml 0,5 M EDTA. Tillsätt steril, DEPC behandlade H2O till en volym på 225ml. Justera pH till 6,8. Tillsätt steril, DEPC behandlade H2O till 250ml. Autoklav.
3. 0.18M fosfatbuffert: I en 500 ml flaska, kombinera 45 ml 1 M Fosfat Solution, 6,8 pH, 2,5 ml av 10% natriumdodecylsulfat (SDS) och 5 ml 0,5 M EDTA. Tillsätt steril, DEPC behandlade H ₂ O till en volym på 225ml. Justera pH till 6,8. Tillsätt steril, DEPC behandlade H ₂ O till 250ml. Autoklav.
4. 0.20M fosfatbuffert: I en 500 ml flaska, kombinera 50 ml 1M Fosfat Solution, 6,8 pH, 2,5 ml av 10% natriumdodecylsulfat (SDS) och 5 ml 0,5 M EDTA. Tillsätt steril, DEPC behandlade H ₂ O till en volym på 225ml. Justera pH till 6,8. Tillsätt steril, DEPC behandlade H ₂ O till 250ml. Autoklav.
5. 0,40 M fosfatbuffert: i en 500 ml kolv, kombinera 100 ml 1M Fosfat Solution, 6,8 pH, 2,5 ml av 10% natriumdodecylsulfat (SDS) och 5 ml 0,5 M EDTA. Tillsätt steril, DEPC behandlade H ₂ O till en volym på 225ml. Justera pH till 6,8. Tillsätt steril, DEPC behandlade H ₂ O till 250ml. Autoklav.
6. "1,00 m fosfatbuffert" (verklig koncentration av fosfat i denna lösning är 0,91 M): I en 500 ml flaska, kombinera 30ml 1 M Fosfat Solution, pH6.8, 2,5 ml av 10% natriumdodecylsulfat (SDS) och 5 ml 0,5 M EDTA. Tillsätt steril, DEPC behandlade H2O till en volym på 225ml. Justera pH till 6,8. Tillsätt steril, DEPC behandlade H ₂ O till 250ml. Autoklav.
7. Hydroxyapatit hydrering: Vikt ut 1g av hydroxyapatit och lägga till en 50ml tub. Tillsätt 6 ml av 0.12M fosfatbuffert till hydroxyapatit och invertera att blanda. Före användning föra temperaturen till 60 ° C och blanda väl. Store för längre tid vid 4 ° C.
8. Före användning, balansera alla fosfat buffertar och släckt hydroxyapatit i 60 ° C.

2. Beredning av Econo-kolumn

1. Stäng vattenkranen. Skölj kolonnen flera gånger med avjoniserat H ₂ O genom att upprepade gånger vända kolumnen och dekantering.
2. Ta bort kranen från Econo-kolumnen och autoklav kolumnen att sterilisera.
3. Byt ut och stänga vattenkranen. Tillsätt 1 ml Sigmacote den sterila Econo-kolumnen och päls alla glasytor. Öppna kranen och dekantera.
4. Fäst kolumn i en cirkulerande vatten bad och inställda temperaturen till 60 ° C. För att einsure minsta värmeförlusten över kolumnen inslagning kolumnen i en isolerande agent exempelvis aluminiumfolie eller skum rörisolering rekommenderas.
5. Skölj Econo kolumner två gånger med sterilt, RNas-fria H ₂ O sedan två gånger med sterilt, RNas-fria 0.12M fosfatbuffert.

3. Hydroxypaptite Chromotography

1. Att se kranen är stängd, långsamt lägga 2 ml förberedda, återsuspenderade hydroxyapatit till botten av Econo-kolonnen med en steril 2ml serologisk pipett.
2. Låt hydroxyapatit att lösa under gravitationskraften i 30 minuter.
3. Töm buffert från kolumn och stäng vattenkranen. Kombinera nukleinsyror med 0.12M fosfatbuffert i en slutlig volym på 500 l och inkubera vid 60 ° C i 10 minuter i ett värmeblock eller vattenbad.
4. Snabbt tillämpa nukleinsyror upprättats i 0.12M fosfatbuffert till hydroxyapatit med hjälp av en 2ml serologisk pipett och se till att inte störa kolumnen.
5. Låt nukleinsyror att binda till hydroxyapatit i 30 minuter.
6. Placera en 15ml tub i kolumnen, öppna kranen och samla de första prov som innehåller ssDNA. Stäng vattenkranen.
7. Tillsätt 6 ml av 0.12M fosfatbuffert till hydroxyapatit att se till att inte störa kolumnen, öppna kranen, och samla enda DNA i 15ml tub från föregående steg. Stäng vattenkranen.
8. Tillsätt en volym av en fenol: kloroform: Isoamyl alkohol (25:25:1 v / v / v) lösning till röret, blanda omsorgsfullt och centrifugera vid 3500 xg under 15 minuter. Överför supernatanten som innehåller ssDNA till en ny 15ml tub.
9. Upprepa 3,76 och 3,87 med hjälp av 6 ml av 0.20M fosfatbuffert till eluta och rena RNA från kolumnen var noga med att använda en ny 15ml tub för indrivning.
10. Upprepa 3,76 och 3,87 med hjälp av 6 ml av 0,40 m fosfatbuffert för att eluera och rena dsDNA från kolumnen var noga med att använda en ny 15ml tub för indrivning.
11. Upprepa 3,76 och 3,87 med hjälp av 6 ml av 1,00 m fosfatbuffert att beröva den kolumn av eventuella resterande dsDNA var noga med att använda en ny 15ml tub för indrivning.

4. Avsaltning nukleinsyra Prover

1. Överföring 4-5 ml prov till en Amicon Ultra-4 centrifugal filterapparat utrustad med en 30.000 molekylvikt avskurna Ultracel membran.
2. Koncentrera prov <500μl genom att snurra på 6000 xg, 30 ° C, 5 minuter (eller tills koncentrerad volym uppnås) i en fast vinkel rotor. Kasta passera.
3. Tillsätt resten av provet (s) till Amicon Ultra-4 centrifugal filterapparat och ta upp volymen till 4-5ml med RNas gratis 1X TE buffert.
4. Koncentrera prov <500μl genom att snurra på 6000 xg, 30 ° C, 5 minuter (eller tills koncentrerad volym uppnås) i en fast vinkel rotor. Kasta passera.
5. Lägg till 4-5 ml RNas gratis 1X TE bufferten till Amicon Ultra-4 centrifugal filterapparat. Koncentrera prov <500μl genom att centrifugera vid 6000 xg, 30 ° C, 5 minuter (eller tills koncentrerad volym uppnås) i en fast vinkel rotor. Kasta passera.
6. Upprepa steg 4,5 ytterligare 5 gånger för att helt AVSALTA nukleinsyran prov (er).
7. Överföring återstående prov (er) till en steril 1,7 ml Eppendorf-rör. Lägg 1:10 volym 3M natriumacetat, pH 7,0, två volymer på 100% etanol, och 1μl av Glycoblue. Blanda väl genom att vortexa.
8. Centrifugera vid 28.000 xg, 4 ° C, 60 minuter. Dekantera att se till att inte störa pelleten. Tillsätt 300μl av 70% etanol. Snurra på 28.000 xg, rumstemperatur i 10 minuter. Dekantera, torr och återsuspendera varje fraktion i lämplig volym av RNase-fria TE buffert.

5. Representativa resultat:

Figur 1 sammanfattar de metoder som presenteras för att använda hydroxyapatit kromatografi till fraktioneras ssDNA, dsDNA och RNA nukleinsyror från en blandad virus assemblage. Denna metod utnyttjar avgiften samspelet mellan negativt laddade fosfat ryggraden i nukleinsyror och de positivt laddade Ca ^{2 +} joner som finns i hydroxyapatit och möjliggör en effektiv fraktionering av nukleinsyra subtyper (ssDNA, dsDNA och RNA) med ökande koncentrationer fosfatbuffert ^12.

Hydroxyfosfaten fraktionering av ett in vitro "community" av kända ssDNA (M13mp18), dsDNA (lambda) och RNA (MS2 och phi6) är virala genomet illustreras i figur 2. Den nukleinsyror kombinerades i lika stora koncentrationer, tillämpas på hydroxyapatit kolonnen och var elueras med en ökande koncentration av fosfat buffert. Varje nukleinsyra subtyp eluerar oberoende av de andra med mindre än 9% överföring från en bråkdel till nästa.

Tillämpningen av denna teknik för att nukleinsyror isolerade från en viral gemenskap samlas in från Chesapeake Bay visas i figur 3. Den totala nukleinsyra avkastningen isolerade från renat virus tillämpades på hydroxyapatit kolumnen. Genomiskt material bestående av ssDNA, RNA och dsDNA blev självständigt elueras med 0.12M, 0.20M och 0.40M/1.00M koncentrationer av fosfatbuffert respektive. Dubbelsträngat DNA elueras vid fosfat koncentrationer av 0,40 m och 1,00 m och i detta fall, dominerar denna virala samhället jämfört med ssDNA och RNA genotyper. Denna observation är förenlig med den förväntade virus gemenskap sammansättning av marina och miljöer flodmynningar där majoriteten av återvinningsvärdet nukleinsyror är dsDNA ^13.

Figur 1. Flödesschema av hydroxyapatit kromatografi metod för fraktionering av nukleinsyror. En blandning av ssDNA, dsDNA och RNA upprättats i 0.12M fosfatbuffert värms till 60 ° C och appliceras på ett hydroxyapatit kolumn hålls på en konstant 60 ° C med en cirkulerande vattenbad. Nukleinsyror (ssDNA, RNA och dsDNA) elueras från hydroxyfosfaten med ökande koncentrationer av ett fosfat som innehåller buffert. Denna siffra har återgivits med tillstånd från American Society of Microbiology och var ursprungligen presenterades i Andrews-Pfannkoch et al. 2010 ^12.

Figur 2. Separering av kända virus nukleinsyror med hjälp av hydroxyapatit kromatografi. Lika koncentrationer av M13mp18 ssDNA, MS2 ssRNA, phi6 dsRNA och lambda dsDNA (körfält 2-5, respektive) slogs ihop (Lane 6) och tillämpas på ett hydroxyapatit kolumn. Single-strängat DNA (M13mp18), RNA (MS2/phi6) och dsDNA (lambda) var oberoende elueras från hydroxyfosfaten kolumn med 0.12M (Lane 8), 0.18M (Lane 9) och 0.40M/1.00M (Lane 10) . En 1KB stege (körfält 1, 7) har använts för att bekräfta arvsmassa storlekar. Denna siffra har återgivits med tillstånd från American Society of Microbiology och var ursprungligen presenterades i Andrews-Pfannkoch et al. 2010 ^12.

Figur 3. Separering av viral nukleinsyra isolerat från en gemenskap inom Chesapeake Bay. Nukleinsyror var isolerade och tillämpas på ett hydroxyapatit kolumn. ssDNA (Lane 0.12M), RNA (Lane 0.20M) och dsDNA (körfält 0.40M/1.0M) var självständigt elueras med halter fosfat buffert av 0.12M, 0.20M och 0.40M/1.00M, respektive. Hej Mass DNA stege (Lane L1) och 1KB Ladder (Lane L2) användes för att visuellt bekräfta ungefärlig molekylvikt och massa av nukleinsyror. Denna siffra har återgivits med tillstånd från American Society of Microbiology och var ursprungligen presenterades i Andrews-Pfannkoch et al. 2010 ^12.

Hydroxyfosfaten kromatografi metoden som presenteras här är ett mycket effektivt och robust verktyg för fraktionering av nukleinsyror från blandade virus assemblage, när målet är att studera den totala nukleinsyra sammansättningen av samhället. I allmänhet kommer ssDNA, RNA och dsDNA rinna genom kolonnen Pho fosfatbuffert högre koncentrationer än cirka ~ grundljusnivån från 0 0,40 m respektive. Däremot kan varje beredning av hydroxyapatit har en något annorlunda sammansättning och elueringstid profil så det är viktigt att testa varje preparat med hjälp av kända nukleinsyror (t.ex. från en odlad virus beredning). Detta gör det möjligt för användaren att fastställa specifika koncentrationer av fosfat-innehåller buffert som behövs för att eluera önskad nukleinsyror.

En begränsande faktor för denna teknik är mängden tillgänglig Ca ^{2 +} joner som finns i hydroxyapatit som kan binda fosfat ryggraden i nukleinsyror. Den capacityamount av hydroxyapatit i kolumnen kan skalas upp eller ner för att kolumnen (som bestäms av storleken på vattenmantlad kolumn och mängden använt hydroxyapatit) och volymen av buffertar som används för eluering kan skalas upp eller ner för att rymma mycket små eller mycket stora mängder indata nukleinsyror, men ytterst begränsas av storleken på vattenmantlad kolumn.

Dessutom är ett parti teknik där nukleinsyror, hydroxyapatit, och fosfat som innehåller buffertar kombineras i en tub, blandat och centrifugeras vid låg hastighet ett alternativt sätt att isolera riktade nukleinsyror. Denna strategi kan vara till nytta i vissa fall, men är inte lika tillförlitliga som de kromatografiska metoder som är mer exakt och ge bättre fraktionering av nukleinsyror.