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 JoVE Neuroscience

टी भूलभुलैया मजबूर प्रत्यावर्तन और वाम सही काम कर रहे हैं और चूहे में संदर्भ मेमोरी का आकलन करने के लिए भेदभाव कार्य

1,2, 1, 3, 1,2,3, 1,2,3

1Division of Systems Medical Science, Institute for Comprehensive Medical Science, Fujita Health University, 2Japan Science and Technology Agency, Core Research for Evolutionary Science and Technology (CREST), 3Center for Genetic Analysis of Behavior, National Institute for Physiological Sciences, National Institutes of Natural Sciences

Article
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    Summary

    इस लेख टी भूलभुलैया परीक्षण चूहों में सीखने और स्मृति समारोह का आकलन करने के लिए एक संशोधित स्वचालित तंत्र का उपयोग की प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है.

    Date Published: 2/26/2012, Issue 60; doi: 10.3791/3300

    Cite this Article

    Shoji, H., Hagihara, H., Takao, K., Hattori, S., Miyakawa, T. T-maze Forced Alternation and Left-right Discrimination Tasks for Assessing Working and Reference Memory in Mice. J. Vis. Exp. (60), e3300, doi:10.3791/3300 (2012).

    Abstract

    जबरिया प्रत्यावर्तन और बाएँ सही भेदभाव कार्यों टी भूलभुलैया का उपयोग व्यापक रूप से किया गया है के लिए काम कर रहे हैं और संदर्भ स्मृति का आकलन करने के लिए, क्रमशः कृन्तकों में प्रयोग किया जाता है. हमारी प्रयोगशाला में, हम अनुवांशिक इंजीनियर चूहों के 30 से अधिक उपभेदों इस तंत्र के स्वचालित संस्करण का उपयोग कर में स्मृति के दो प्रकार का मूल्यांकन किया गया. यहाँ, हम संशोधित टी भूलभुलैया एक प्रणाली वीडियो ट्रैकिंग और एक फिल्म के प्रारूप में हमारे प्रोटोकॉल के साथ एक कंप्यूटर द्वारा संचालित तंत्र मौजूद है. तंत्र टी - भूलभुलैया दरवाजे कि स्वचालित रूप से नीचे खोल सकते हैं, एक शुरुआत के बॉक्स के साथ एक, एक टी के आकार गली, बॉक्स के एक पक्ष में दो स्वचालित गोली dispensers के साथ बक्से, और दो एल के आकार गलियों फिसलने से विभाजित रनवे के होते हैं . प्रत्येक एल के आकार गली शुरू बॉक्स से जुड़ा है इतना है कि चूहों प्रारंभ बॉक्स में, जो माउस व्यवहार पर शामिल experimenter के प्रभाव से निपटने के लिए लौट सकते हैं. इस उपकरण में भी एक फायदा है कि vivo में इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी में vivo microdialysis, और optogenetics techn मेंiques टी भूलभुलैया प्रदर्शन के दौरान किया जा सकता है क्योंकि दरवाजे के फर्श में नीचे जाने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं. चूहों, जो आठ हाथ रेडियल भूलभुलैया काम में स्मृति घाटे काम दिखाने के लिए रिपोर्ट कर रहे हैं इस फिल्म लेख में, हम टी भूलभुलैया स्वचालित तंत्र और α-CaMKII + / टी भूलभुलैया प्रदर्शन का उपयोग कर कार्यों का वर्णन. हमारे आंकड़ों से संकेत दिया कि α-CaMKII / चूहों काम कर रहे एक स्मृति घाटा, लेकिन संदर्भ स्मृति की कोई हानि से पता चला है, और पिछले आठ हाथ रेडियल भूलभुलैया काम है, जो हमारे प्रोटोकॉल की वैधता का समर्थन करता है का उपयोग निष्कर्षों के साथ संगत कर रहे हैं. इसके अलावा, हमारे आंकड़ों से संकेत मिलता है कि म्यूटेंट सीखने घाटे उलट प्रदर्शन खड़ा है, सुझाव है कि α-CaMKII कमी के कारण कम व्यवहार लचीलापन. इस प्रकार, टी - भूलभुलैया परीक्षण संशोधित स्वचालित तंत्र का उपयोग कर काम कर रहे हैं और संदर्भ स्मृति और चूहों में व्यवहार में लचीलापन आकलन करने के लिए उपयोगी है.

    Protocol

    1. तंत्र की स्थापना

    1. स्वचालित तंत्र संशोधित टी भूलभुलैया (O'Hara एंड कंपनी, टोक्यो, जापान) 25 सेमी उच्च एक दीवारों के साथ सफेद प्लास्टिक रनवे का निर्माण किया है. भूलभुलैया बंद 6 क्षेत्रों (A1, A2, S1, S2, P1, P2) में दरवाजे स्लाइडिंग (s1, s2, s3, a1, a2, P1, P2) (चित्रा 1) है कि स्वचालित रूप से नीचे खोला जा सकता है के द्वारा विभाजित है. टी स्टेम S2 के क्षेत्र से बना है (13 x 24 सेमी) और टी के हथियार क्षेत्रों A1 और A2 (11.5 x 20.5 सेमी) शामिल है. क्षेत्रों P1 और P2 शुरू डिब्बे क्षेत्र (S1) हाथ (क्षेत्र A1 या A2) से जोड़ने के मार्ग शामिल हैं.
    2. प्रत्येक हाथ के अंत में एक गोली निकालने की मशीन है कि स्वचालित रूप से एक इनाम के रूप में sucrose गोली (20 मिलीग्राम, फॉर्मूला 5 TUT, TestDiet, में, संयुक्त राज्य अमेरिका रिचमंड) प्रदान करता है के साथ सुसज्जित है. माउस द्वारा गोली का सेवन अवरक्त संवेदक द्वारा पता लगाया है और स्वचालित रूप से एक कंप्यूटर के द्वारा दर्ज की गई है.
    3. प्रभारी युग्मित डिवाइस (सीसीडी) कैमरा उपकरण के ऊपर माउस & # की निगरानी के लिए मुहिम शुरू की हैx2019, व्यवहार, और तंत्र और माउस की छवियों को कंप्यूटर के द्वारा कब्जा कर रहे हैं.
    4. Soundproof कमरे में (170 x 210 x 200 सेमी, O'Hara एंड कंपनी, टोक्यो, जापान) संभव के रूप में टी भूलभुलैया में उपकरण रखें. तंत्र फ्लोरोसेंट रोशनी से हमारी प्रयोगशाला में लक्स 100 पर प्रकाशित है. प्रकाश की तीव्रता इस लक्स स्तर की तुलना में कमजोर हो सकता है, लेकिन सभी प्रयोगों के दौरान एक निरंतर स्तर पर आयोजित किया जाना चाहिए सकता है.

    2. पशु तैयारी

    1. घर में दो से चार एक कमरे के तापमान नियंत्रित पिंजरे प्रति चूहों के बारे में (23 2 ± ° C) 12 घंटे चक्र / प्रकाश अंधेरे 7:00 AM पर रोशनी के साथ मार्गदर्शन और स्थानीय पशु की देखभाल के द्वारा स्थापित प्रोटोकॉल के अनुसार, और समिति का प्रयोग करें.
    2. Soundproof कमरे में चूहों आवास के कमरे से कम से कम 30 मिनट से युक्त पहला परीक्षण से पहले शुरू होता है पिंजरों का स्थानांतरण.
    3. सभी प्रयोगों हमेशा से एक ही समय अवधि के दौरान (जैसे, 9:00 6:00 AM) किया जाना चाहिए. परीक्षण पे के दौरानriod, counterbalanced क्रम में प्रत्येक जीनोटाइप या प्रयोगात्मक हालत से विषयों परीक्षण किया जाना चाहिए, क्योंकि वहाँ एक दिन में एक समय के संभावित कार्य के प्रदर्शन पर प्रभाव हो सकता है.

    3. खाद्य प्रतिबंध

    1. प्रयोग की शुरुआत तक, चूहों के लिए मानक गोली चाउ करने के लिए स्वतंत्र उपयोग और पानी दे.
    2. 1 सप्ताह पूर्व प्रशिक्षण सत्र के पहले से, चूहों दैनिक तौलना और मानक गोली चाउ के साथ उन्हें खिलाने के लिए 80% करने के लिए प्रयोग भर में 85% उनके शरीर मुक्त खिला वजन को बनाए रखने.
    3. दैनिक माउस प्रति आठ में sucrose के छर्रों के अलावा उनके घर पिंजरे में मानक गोली चाउ के साथ प्रदान करने के लिए पूर्व प्रशिक्षण सत्र की शुरुआत तक sucrose के छर्रों के लिए आदत डालना.

    4. उपकरण और पूर्व प्रशिक्षण के लिए habituation

    1. जगह हैनौ माउस प्रति खाद्य dispensers के प्रत्येक ट्रे में तंत्र के छह डिब्बों, और जमा एक गोली के हर एक के केंद्र में sucrose के छर्रों.
    2. तंत्र में एक पिंजरे में सभी चूहों प्लेस और उन्हें स्वतंत्र रूप से सभी 30 मिनट के लिए खुले दरवाजे के साथ तंत्र का पता लगाने के लिए अनुमति देते हैं.
    3. 1 दिन से अभ्यस्तता के बाद, चूहों दैनिक पूर्व प्रशिक्षण के अधीन हैं. के साथ सभी दरवाजे बंद कर दिया और गोली भोजन, A1: क्षेत्र में जगह माउस ट्रे में जमा है. अगर माउस गोली या 5 मिनट बीत जाना खपत, क्षेत्र A2 के लिए माउस स्थानांतरण और पूर्व प्रशिक्षण फिर से शुरू. इस तरह के प्रशिक्षण एक दिन में पांच बार दोहराया है, और जारी रखा जब तक चूहों छर्रों का 80% से अधिक की खपत.
    4. पूर्व प्रशिक्षण सत्र के बाद पूरा कर रहे हैं, चूहों या तो एक मजबूर प्रत्यावर्तन कार्य या छोड़ दिया सही भेदभाव के कार्य करने के लिए अधीन हैं.

    5. मजबूर प्रत्यावर्तन कार्य

    1. मजबूर प्रत्यावर्तन कार्य में, प्रत्येक परीक्षण एक मजबूर पसंद रन fol के होते हैंएक स्वतंत्र चुनाव रन से इजाजत दे दी है.
    2. कार्य की शुरुआत के लिए आवेदन प्रोग्राम चलाएँ (छवि टीएम), और शुरू बॉक्स (क्षेत्र S1) में एक माउस जगह है.
    3. प्रारंभ बटन क्लिक करें, और एक मजबूर पसंद रन शुरू होता है. इस दौड़ शुरू बॉक्स (s2 दरवाजा) और या तो क्षेत्र (दरवाजा A1) A1 या क्षेत्र A2 (दरवाजा A2) के दरवाजे खोल रहे हैं और एक sucrose गोली स्वचालित रूप से खुले दरवाजे के साथ क्षेत्र के भोजन की थाली के लिए दिया . माउस क्षेत्र में प्रवेश करने के लिए और गोली उपभोग की अनुमति दी है. जब माउस गोली खाया है, हाथ है कि माउस वर्तमान में रहता है (या तो दरवाजा p1 या p2) की भोजन की थाली के पास दरवाजा खोला है. फिर, माउस (या तो s1 या s3) दरवाजा शुरू बॉक्स पड़ोसी, दृष्टिकोण और या तो दरवाजा p1 या p2 बंद है और दरवाजा s1 (या s3) खोला है कि माउस प्रारंभ बॉक्स में लौट सकते हैं. अगर माउस के लिए 30 सेकंड के भीतर गोली खाने के लिए विफल रहता है, एक "चूक त्रुटि" प्रतिक्रिया के रूप में दर्ज की गई है. तो, गोली स्वचालित रूप से भोजन की थाली और टी से निकाल दिया जाता हैवह हाथ से दरवाजा है कि चूहों रुके थे (या तो p1 या p2), खोला है, और तब माउस प्रारंभ बॉक्स में लौट सकते हैं.
    4. मजबूर विकल्प चलाने के बाद, मुक्त विकल्प रन स्वचालित रूप से शुरू होता है. दरवाजा s2 और दोनों दरवाजे A1 और A2 खोल रहे हैं. माउस के दो हथियार के बीच चुनने की अनुमति दी है. अगर माउस विपरीत हाथ कि यह करने के लिए मजबूर पसंद रन में चुनने के लिए मजबूर किया गया था में प्रवेश करती है, इसकी प्रतिक्रिया "सही" माना जाता है और माउस एक sucrose गोली प्राप्त है. अगर माउस के लिए 30 सेकंड के भीतर गोली खाने के लिए विफल रहता है, प्रतिक्रिया एक "चूक त्रुटि" के रूप में दर्ज की गई है, और गोली स्वचालित रूप से भोजन की थाली से हटा दिया जाता है. अगर माउस के रूप में एक ही हाथ से चला जाता है कि मजबूर चुनाव कार्य में दौरा किया है, माउस क्षेत्र के भीतर एक दंड ("त्रुटि" प्रतिक्रिया) के रूप में 10 सेकंड के लिए ही सीमित है. फिर, p1 के दरवाजे या (s1) और p2 (या s3) खोल रहे हैं और माउस प्रारंभ बॉक्स में लौट सकते हैं.
    5. एक माउस के प्रति एक सत्र में लगातार 10 परीक्षणों के अधीन हैदिन (cutoff के समय, 50 मिनट). नियंत्रण चूहों के एक सत्र में 80% सही जवाब के एक समूह के औसत तक पहुंचने के लिए दैनिक प्रशिक्षित किया जाता है. सही प्रतिक्रिया के समूह के औसत प्रत्येक समूह में एक सत्र में प्रत्येक माउस% सही प्रतिक्रिया औसत से गणना की है.
    6. के बाद नियंत्रण और / या प्रयोगात्मक चूहों कसौटी के लिए प्रशिक्षित किया जाता है, तो आप आगे 3 डालने में देरी प्रत्यावर्तन कार्य में चूहों का परीक्षण कर सकते हैं, 10 -, 30 -, या पसंद मजबूर किया और मुक्त चुनाव के बीच 60 है देरी चलाता है.
    7. प्रत्येक सत्र के बाद, उनके घर पिंजरे में चूहों लौटने के लिए, और, सुपर hypochlorous पानी (6-7 पीएच) के साथ तंत्र घ्राण संकेत के आधार पर एक पूर्वाग्रह को रोकने के साफ.

    6. वाम सही भेदभाव कार्य

    1. बाएं सही भेदभाव कार्य में, 10 या 20 प्रत्येक माउस परीक्षण के एक मुक्त पसंद रन दिया जाता है. Sucrose गोली हमेशा हथियारों की, अर्थात्, लक्ष्य हाथ के भोजन की थाली के लिए दिया जाता है. चूहे करने के लिए लक्ष्य हाथ में प्रवेश सीखना है. लक्ष्य का स्थानहाथ परीक्षण और सत्र में अविकारी है, और नियंत्रण और प्रयोगात्मक चूहों भर में counterbalanced है.
    2. कार्य की शुरुआत के लिए आवेदन प्रोग्राम चलाएँ (छवि टीएम), और शुरू बॉक्स (क्षेत्र S1) में एक माउस जगह है.
    3. प्रारंभ बटन क्लिक करें, और एक मुक्त पसंद रन शुरू होता है. इस दौड़ में, s2 दरवाजा और दोनों दरवाजे A1 और A2 में खोला है, और एक गोली निकालने की मशीन स्वचालित रूप से लक्ष्य हाथ के भोजन की थाली के लिए एक गोली बचाता है. माउस को स्वतंत्र रूप से छोड़ दिया और सही हथियार के बीच चयन करने की अनुमति है. जब माउस लक्ष्य हाथ में प्रवेश करती है, यह एक सही जवाब माना जाता है. अगर माउस गोली या 30 सेकंड बीतना, दरवाजा p1 (या p2) खाता खोला है. जब माउस क्षेत्र P1 के (या P2) के माध्यम से गुजर से शुरू बॉक्स दृष्टिकोण है, दरवाजा s1 (या s3) खोला है कि माउस प्रारंभ बॉक्स में लौट सकते हैं.
    4. माउस आमतौर पर 10 से 20 प्रति दिन एक सत्र (cutoff के समय, 50 मिनट) में लगातार परीक्षण के अधीन है. चूहों पर नियंत्रण दैनिक प्रशिक्षित किया जाता है 80% corr के एक समूह के औसत तक पहुंचएक सत्र में प्रतिक्रिया ect. सही प्रतिक्रिया के समूह के औसत प्रत्येक समूह में एक सत्र में प्रत्येक माउस% सही प्रतिक्रिया औसत से गणना की है.
    5. के बाद चूहों कसौटी तक पहुँचने के लिए, आप अतिरिक्त सत्र चूहों को भी देने के लिए सत्र के बीच कई सप्ताह की देरी डालने से प्रतिधारण स्मृति और relearning का आकलन करने के लिए या विपरीत में इनाम रखकर व्यवहार लचीलापन का आकलन कर सकते हैं, पहले unbaited हाथ (यानी उलटा ) के रूप में आवश्यक है, सीखने.
    6. प्रत्येक सत्र के बाद, उनके घर पिंजरे में चूहों लौटने के लिए, और, सुपर hypochlorous पानी (6-7 पीएच) के साथ तंत्र घ्राण संकेत के आधार पर एक पूर्वाग्रह को रोकने के साफ.

    7. छवि विश्लेषण

    1. टी भूलभुलैया उपकरण में व्यवहार एक कंप्यूटर से जुड़ा है और छवि एक झगड़ा प्रारूप में संग्रहीत किया जाता है एक वीडियो कैमरा के द्वारा दर्ज की गई हैं. आवेदन प्राप्त करने और विश्लेषण व्यवहार डेटा (छवि टीएम) के लिए इस्तेमाल सार्वजनिक डोमेन छवि जम्मू (द्वारा विकसित कार्यक्रम पर आधारित हैवेन Rasband मानसिक स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान में और पर उपलब्ध http://rsb.info.nih.gov/ij/ ), जो Tsuyoshi Miyakawa (में O'Hara एंड कंपनी, टोक्यो, जापान के माध्यम से उपलब्ध है) के द्वारा संशोधित किया गया था.
    2. छवि टीएम प्रोग्राम स्वचालित रूप से सही जवाब के प्रतिशत के लिए पाठ फ़ाइलें, विलंबता (सेकंड) उत्पन्न करने के लिए एक सत्र पूरा, दूरी सत्र के दौरान यात्रा, और सत्र में चूक त्रुटियों की संख्या. इसके अलावा, माउस, कच्चे स्थिति डेटा है, और प्रत्येक भाग में कच्चे प्रतिक्रिया डेटा (सही, चूक, या त्रुटि) का पता लगाने छवियों का उत्पादन कर रहे हैं और बचाया.

    8. सांख्यिकीय विश्लेषण

    (प्रायोगिक (जैसे, जीनोटाइप) हालत एक्स सत्र या प्रयोगात्मक हालत एक्स देरी) दो तरह दोहराया विचरण के उपाय विश्लेषण द्वारा प्रत्येक व्यवहार डेटा का विश्लेषण.

    9. प्रतिनिधि परिणाम

    मा - α - CaMKII / टी भूलभुलैया प्रदर्शन का एक उदाहरणले चूहों और उनके जंगली प्रकार के नियंत्रण littermates (C57BL/6J पृष्ठभूमि) (11-18 सप्ताह पुराने, n = मजबूर प्रत्यावर्तन या छोड़ दिया सही भेदभाव कार्य के लिए समूह प्रति 10) 2-4 आंकड़े में दिखाया गया है. क्योंकि α-CaMKII / चूहों पिंजरे 2,3 साथी की ओर आक्रमण के उच्च स्तर प्रदर्शन, दोनों म्यूटेंट और नियंत्रण चूहों के अकेले दूध छुड़ाने का वायु के बाद एक प्लास्टिक पिंजरे (22.7 32.3 x x 12.7 सेमी) में रखे थे. प्रयोगों संस्थागत पशु की देखभाल और Fujita स्वास्थ्य विश्वविद्यालय का प्रयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया.

    मजबूर प्रत्यावर्तन कार्य में, नियंत्रण चूहों तेजी से करने के लिए सही विकल्प बनाने के लिए सीखना होगा, और आमतौर पर एक मतलब के बारे में 1 से 2 सप्ताह (2A चित्रा) में 80% सही जवाब की कसौटी तक पहुँच सकते हैं. कम (विलंबता जीनोटाइप: एफ (1,18) = 8.88 नियंत्रण चूहों की तुलना में, α-CaMKII / चूहों सही प्रतिक्रियाओं का एक काफी कम प्रतिशत (एफ (1,18) = 29.04, पी .०,००१ <जीनोटाइप) से पता चला है , 0.008 = पी, जीनोटाइप x सत्र: एफ (9162) = 2.24, पी .0218 =) और एक छोटी घ कूचistance (जीनोटाइप: एफ (1,18) = 8.67, पी = 0.००८६, जीनोटाइप x सत्र: एफ (9162) 3.19 =, = पी ०.००१४) नियंत्रण चूहों (चित्रा 2A, बी, और सी) की तुलना में. जीनोटाइप का कोई महत्वपूर्ण प्रभाव चूक त्रुटियों (चित्रा 2 डी) में पाया गया था. देरी एफ (1,18): 38.781 = p 0.०००१ <इसके अलावा, प्रत्यावर्तन कार्य में देरी, α-CaMKII + / सही पसंद प्रतिशत चूहों किसी देरी के समय (जीनोटाइप प्रकार के जंगली चूहों की तुलना में काफी कम थे (3,54) एफ 8.074 =, = पी .0002; एक्स जीनोटाइप देरी: एफ (3,54) = 0.223, पी 0.88 =; चित्रा 3). इन परिणामों से संकेत मिलता है कि म्यूटेंट करने के लिए चूहों पर नियंत्रण हालांकि उत्परिवर्ती चूहों कार्य नियंत्रण की तुलना में तेजी से करने के लिए, हो सकता है सुझाव है कि α-CaMKII कमी के एक काम स्मृति घाटा लाती है की तुलना में ख़राब प्रदर्शन का प्रदर्शन किया.

    बाएं सही भेदभाव कार्य में, α-CaMKII के सही विकल्प प्रतिशत + / - म्यूटेंट सत्र, चूहों (चित्रा -4 ए) को नियंत्रित करने के समान भर में धीरे - धीरे वृद्धि हुई. इसके अलावा, जब एक 1 महीने की देरी सत्र के बीच में डाला गया थाउत्परिवर्ती और नियंत्रण चूहों के बीच सही प्रतिशत में कोई महत्वपूर्ण मतभेद थे. मजबूर प्रत्यावर्तन कार्य में α-CaMKII + / - म्यूटेंट एक काफी कम विलंबता से पता चला है एक सत्र को पूरा करने के लिए (जीनोटाइप: एफ (1,18) = 12.12, = पी .००२७) और कम दूरी की एक सत्र के दौरान तंत्र में कूच (जीनोटाइप एफ (1,18) = 25.08, पी <0.०००१, जीनोटाइप X सत्र: एफ (15,270) = 2.83, पी = 0.0004 प्रशिक्षण सत्र के पार नियंत्रण चूहों (चित्रा 4 बी और सी) की तुलना में). इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि α-CaMKII कमी खुराक को प्रभावित के रूप में इस कार्य के द्वारा मूल्यांकन नहीं संदर्भ स्मृति. एफ (5,90) =:; जीनोटाइप X सत्र एफ (1,18) = 10.92, = पी .0039: - उलट सीखने सत्र में, तथापि, α-CaMKII / म्यूटेंट सही प्रतिक्रियाओं का एक काफी कम प्रतिशत (जीनोटाइप पता चला नियंत्रण चूहों की तुलना में चित्रा 4D): 17.12 =, = पी .0006, 5.54, पी 0.०००२ = 4A चित्र) और अधिक चूक त्रुटियों ((1,18 एफ जीनोटाइप) था. ये निष्कर्ष बताते हैं कि α-CaMKII / - उत्परिवर्ती चूहों के व्यवहार में लचीलापन कम कर दिया है.

    <पी वर्ग = "jove_content"> चित्रा 1
    चित्रा 1 (ए) मजबूर प्रत्यावर्तन और बाएँ सही भेदभाव कार्यों के लिए टी भूलभुलैया तंत्र. आंकड़ा Takao एट अल (2008) से उद्धृत है. (बी) छवि एक सीसीडी कैमरा तंत्र ऊपर घुड़सवार द्वारा कब्जा कर लिया था. टी - भूलभुलैया से 6 क्षेत्रों (A1, A2, S1, S2, P1, P2) में दरवाजे स्लाइडिंग (S1, S2, S3, a1, a2, P1, P2) द्वारा विभाजित है. (सी) और एक soundproof कमरे में तंत्र और अतिरिक्त उलझन संकेत के विन्यास अभिविन्यास. दो apparatuses एक ध्वनिरोधी कमरे में एक दीवार है, और वस्तुओं, जैसे कमरे के दरवाजे की ओर एक ही दिशा का सामना करना पड़ रहा है रखा जाता है, छत पर फ्लोरोसेंट रोशनी, कमरे की दीवारों, apparatuses के सीसीडी कैमरों, और रैक माउस को समायोजित करने के लिए पिंजरों सेट कर रहे हैं.

    चित्रा 2
    चित्रा 2. टी भूलभुलैया प्रत्यावर्तन कार्य मजबूर. चूहे प्राप्त sessio 10 प्रतिशत दैनिक परीक्षणएन. सही प्रतिक्रियाओं का प्रतिशत (ए) के डेटा, (बी) विलंबता (सेकंड), (सी) (सेमी) दूरी कूच, और चूक के दो सत्रों के प्रत्येक ब्लॉक के लिए मानक त्रुटियों के साथ साधन के रूप में मौजूद त्रुटियों की संख्या (डी), और थे एक दो तरह से दोहराया उपायों एनोवा द्वारा विश्लेषण. α-CaMKII + / - चूहों सही प्रतिक्रियाओं का प्रतिशत कम (<पी. 0.०,००१) और एक कम विलंबता (0.008 = पी) से पता चला है, और सत्र के पार नियंत्रण चूहों की तुलना में एक कम दूरी (पी .००८६ =) कूच.

    चित्रा 3
    चित्रा 3. टी भूलभुलैया की देरी 3, 10, 30, और 60 सेकंड के साथ प्रत्यावर्तन कार्य के लिए मजबूर है. अंतिम प्रशिक्षण सत्र के बाद लगभग 24 घंटे, चूहों पांच देरी सत्र के के अधीन थे. प्रत्येक देरी के लिए सही प्रतिक्रियाओं का प्रतिशत मानक त्रुटियों के साथ साधन के रूप में प्रतिनिधित्व किया है, और एक दो तरह से दोहराया उपायों एनोवा द्वारा विश्लेषण किया गया. α-CaMKII + / - चूहों पर नियंत्रण चूहों की तुलना में किसी भी देरी सही प्रतिक्रियाओं का प्रतिशत कम दिखायासमय (पी <०.०००१).

    चित्रा 4
    चित्रा 4. टी भूलभुलैया भेदभाव बाएँ - सही कार्य. चूहे दैनिक एक सत्र में 10 या 20 परीक्षणों प्राप्त किया. सही प्रतिक्रियाओं का प्रतिशत (ए) के डेटा, (बी) (सेकंड) विलंबता, (सी) (सेमी) दूरी कूच, और (डी) चूक त्रुटियों की संख्या 20 परीक्षण के प्रत्येक ब्लॉक के लिए मानक त्रुटियों के साथ साधन के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं, जो एक दो तरह से दोहराया उपायों एनोवा द्वारा विश्लेषण किया गया. उत्परिवर्ती और नियंत्रण चूहों के प्रारंभिक प्रशिक्षण और अंतिम प्रशिक्षण सत्र के बाद 1 महीने सत्र relearning सत्र के दौरान, सही प्रतिक्रियाओं का प्रतिशत काफी α-CaMKII + / के बीच अलग नहीं था. उत्परिवर्ती चूहों, तथापि, उलट सीखने सत्र (पी 0.०,०३९ =) के दौरान सही प्रतिक्रियाओं का नियंत्रण चूहों की तुलना में काफी कम प्रतिशत से पता चला है.

    Discussion

    जबरिया प्रत्यावर्तन और बाएँ सही भेदभाव कार्यों टी भूलभुलैया का उपयोग करने के लिए काम कर रहे हैं और संदर्भ स्मृति का आकलन करने के लिए, क्रमशः 4,5 कृन्तकों में बड़े पैमाने पर उपयोग किया जाता है. टी भूलभुलैया कार्य में, यह ज्ञात है कि rodents विभिन्न रणनीतियों का उपयोग करने के लिए अतिरिक्त उलझन संकेत, कमरे के संकेत के विन्यास, भूलभुलैया के उन्मुखीकरण, और इतने पर जैसे कार्य, स्थानिक और गैर स्थानिक संकेत पर आधारित है, प्रदर्शन कर सकते हैं 6,7,8. एक कमरा और इसकी स्थिरता का अभाव, या कमरे में संकेत के ध्रुवीकरण की उपस्थिति में भूलभुलैया के ओरिएंटेशन, और कृन्तकों कमरे में संकेत देखने की क्षमता रणनीतियों को प्रभावित कर सकता है. इस प्रकार, शोधकर्ताओं ने एक प्रयोग और व्यवहार डेटा की व्याख्या करने में एक कमरे में विन्यास और तंत्र और संकेत के उन्मुखीकरण पर विचार करने की आवश्यकता है. हमारी प्रयोगशाला में, हम एक ही दिशा में एक soundproof कमरे और सेट वस्तुओं में एक ऐसे कमरे के दरवाजे, छत पर फ्लोरोसेंट रोशनी, कमरे की दीवारों, सीसीडी कैमरों के रूप में, दीवार की ओर दो तंत्र का सामना करना पड़ जगहapparatuses, और रैक माउस पिंजरों समायोजित करने के लिए, कि चूहों के लिए अतिरिक्त भूलभुलैया स्थानिक संकेत (चित्रा 1C देखें) के रूप में सेवा कर सकता है.

    कई मामलों में, टी भूलभुलैया परीक्षण मैन्युअल रूप से किया गया है के रूप में एक मानव प्रयोगकर्ता के द्वारा आयोजित: प्रत्येक परीक्षण में, प्रयोगकर्ता के भोजन की थाली पर एक sucrose गोली स्थानों, और परीक्षण शुरू करने के लिए तंत्र के गिलोटिन दरवाजे खोलता है. तब, जब एक माउस या तो हथियारों के प्रवेश करती है, प्रयोगकर्ता के दरवाजे, रिकॉर्ड माउस व्यवहार बंद कर देता है, और हाथ से हाथ से प्रारंभ बॉक्स माउस स्थानान्तरण. माउस जीनोटाइप या प्रयोगात्मक हालत के साथ बातचीत से निपटने के संभव confounding चर टी भूलभुलैया प्रदर्शन को प्रभावित कर सकता है. पिछले एक दशक के दौरान, एक सतत प्रत्यावर्तन कार्य है कि लक्ष्य हाथ से इस विषय के मैनुअल हस्तांतरण प्रारंभ बॉक्स में वापस शामिल नहीं करता है के लिए संशोधित टी भूलभुलैया परीक्षण किया गया है. इस्तेमाल किया गया है 9-11 यहां तक कि जब तंत्र, प्रोटोकॉल, और परीक्षण कई पर्यावरण चर सख्ती स्टेशन बराबर कर रहे हैंndardized व्यवहार परीक्षण हमेशा अलग 12,13 प्रयोगशालाओं में इसी तरह के परिणाम के उपज नहीं है. विशिष्ट परीक्षण प्रदर्शन प्रयोगकर्ताओं प्रत्येक प्रयोगशाला के लिए अद्वितीय हो सकता है और भी चूहों के व्यवहार को प्रभावित कर सकते हैं हो सकता है. इसके अलावा, एक मानव प्रयोगकर्ता के आम तौर पर एक sucrose गोली misplacing, खोलने या परीक्षण संख्या और timekeeping पर नज़र रखने में अन्य दरवाजे, के रूप में अच्छी तरह से गलतियों बंद के रूप में ऐसी त्रुटियों, के लिए उपयुक्त है. Confounding चर और मानवीय त्रुटियों की घटना के प्रभाव को कम करने के लिए, हम विकसित किया है और स्वचालित टी भूलभुलैया छवि टीएम कार्यक्रम के साथ एक वीडियो ट्रैकिंग प्रणाली द्वारा नियंत्रित उपकरण का इस्तेमाल किया. सुधार टी भूलभुलैया तंत्र भी लाभ है कि हमें टी भूलभुलैया प्रदर्शन के दौरान microdialysis, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, और optogenetics तकनीक के उपयोग करने के लिए क्योंकि दरवाजे के फर्श में नीचे जाने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं की अनुमति है. इस प्रकार, स्वचालित तंत्र के लिए काम कर रहे हैं और कृन्तकों में संदर्भ स्मृति के तंत्रिका जीव विज्ञान के अध्ययन की सुविधा के लिए एक उपयोगी उपकरण है.

    एक सत्र में परीक्षण की एक श्रृंखला के स्वचालित और लगातार निष्पादन को सक्षम करने के लिए, हमारे प्रोटोकॉल के कुछ संभावित कमियां हैं. उदाहरण के लिए, मजबूर प्रत्यावर्तन कार्य में, समय चूहों के लिए वापस S1 के लिए A1 या A2 संभवतः उनके प्रदर्शन को प्रभावित कर सकता है से जाने के लिए. यह एक गंभीर समस्या नहीं है, हालांकि, हो सकता है के बाद से रहने P1 या p2 के क्षेत्र में ही एक स्थानिक क्यू और मजबूर पसंद रन में किसी भी क्षेत्र में लंबे या छोटे रहने बदल नहीं सकता है एक स्मृति लोड किया जा सकता है. एक अन्य संभावित समस्या है कि गंध चूहों द्वारा किए गए निशान है, बजाय स्थानिक काम स्मृति, इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, कुछ परीक्षणों के बाद, गंध ट्रेल्स अधिलेखित कई बार हो सकता है और संकेत के रूप में उपयोग किया जा मुश्किल हो सकता है. इसके अलावा,, बाएं प्रकाश भेदभाव कार्य में गंध ट्रेल्स चूहों लगातार परीक्षण भर में एक इनाम के स्थान खोजने के लिए घ्राण संकेत के रूप में सेवा कर सकता है. संकेत परीक्षणों में एक सत्र में सीखने और स्मृति की प्रक्रिया को प्रभावित कर सकता है जो संभवतः एक समस्या हो सकती है. हालांकि,चूहों के एक सत्र में बहुत पहले परीक्षण में गंध निशान रणनीति का उपयोग नहीं है और इसलिए पहले परीक्षण के प्रदर्शन के एक सूचकांक कि गंध निशान रणनीति की क्षमता का उपयोग से रहित है के रूप में काम करेगा कर सकते हैं.

    जैसा प्रतिनिधि परिणामों में दिखाया गया, का नियंत्रण C57BL/6J चूहों प्रतिशत सही प्रतिक्रिया धीरे - धीरे दोनों कार्यों में सत्र के पार वृद्धि हुई है. निष्कर्षों की पुष्टि कि C57BL/6J चूहों संशोधित टी भूलभुलैया स्वचालित में सही विकल्प बनाने के लिए सीख सकते हैं. इस अध्ययन में, चूहों 80% के आसपास के सही विकल्प पर रुके थे और नहीं भी अधिक गहन प्रशिक्षण के बाद (चित्रा 2A देखें). यह देखते हुए कि वे प्रशिक्षण में कुछ चूक त्रुटियों को दिखा रखने, उनकी प्रेरणा चूहों के लिए इतना उच्च नहीं हो सकता है के रूप में प्रदर्शन के उच्च स्तर तक पहुँचने के लिए हो सकता है. मजबूर प्रत्यावर्तन कार्य में α-CaMKII / चूहों सही प्रतिक्रियाओं का नियंत्रण चूहों की तुलना में एक प्रतिशत कम दिखाया. इस प्रकार, उत्परिवर्ती चूहों इस टा में नियंत्रण चूहों की तुलना में ख़राब प्रदर्शन का प्रदर्शनएस के. इस परिणाम पिछले आठ बांह रेडियल भूलभुलैया 2,14 परीक्षण में प्राप्त निष्कर्षों के साथ संगत है, आगे सबूत है कि α-CaMKII कमी के काम स्मृति में घाटा लाती है और स्वचालित तंत्र टी भूलभुलैया में मजबूर प्रत्यावर्तन कार्य सही पता लगाता है कि उपलब्ध कराने उत्परिवर्ती चूहों की स्मृति घाटे काम कर रहा है. बाएं सही भेदभाव कार्य में, परिणामों से संकेत मिलता है कि α-CaMKII कमी खुराक संदर्भ स्मृति को प्रभावित नहीं है. जैसा उलट सीखने सत्र के परिणामों में दिखाया गया है, तथापि, α CaMKII कमी व्यवहार लचीलापन कम कर सकते हैं. उत्परिवर्ती चूहे भी उलट शिक्षण सत्र के दौरान नियंत्रण चूहों की तुलना में अधिक चूक त्रुटियों का प्रदर्शन किया. चूक त्रुटियों की संख्या में वृद्धि जानने के लिए जो हाथ इनाम के साथ जुड़ा हुआ है के लिए अवसर कम हो सकता है. इसलिए, देरी सीखने अधिग्रहण चूक त्रुटियों की संख्या में वृद्धि के कारण शुरुआती सत्र के दौरान हो सकता है, लेकिन नहीं कर सके बिगड़ा उलट एलकमाई. एक और संभावना है कि म्यूटेंट नियम है, जो चूक की त्रुटियों को प्रेरित और कार्यकारी समारोह के साथ हस्तक्षेप कर सकता है में परिवर्तन के द्वारा भ्रमित किया जा सकता है. इस प्रकार, के लिए एक उचित निष्कर्ष आकर्षित करने के लिए, चूक त्रुटियों के रूप में सही पसंद प्रतिशत के रूप में अच्छी तरह से जांच की जानी चाहिए.

    छवि टीएम कार्यक्रम उत्पन्न विलंबता और दूरी के लिए अतिरिक्त परिणाम सही प्रतिक्रिया का प्रतिशत और चूक त्रुटि की संख्या के रूप में एक सत्र के रूप में अच्छी तरह से पूरा करने के लिए कूच. विलंबता और दूरी में अंतर करने के लिए एक सत्र पूरा करने के लिए कूच हरकत गतिविधि स्तर, आवेगी हथियार पसंद करने की प्रवृत्ति, के लिए कार्य करने की प्रेरणा, कार्य, विभिन्न सीखने रणनीति अभ्यस्तता स्तर और आदि में एक फर्क के बारे में के रूप में व्याख्या की जा सकती है प्रतिनिधि परिणाम, α-CaMKII / चूहों कम विलंबता और कम नियंत्रण के उन से कूच दूरी से पता चला है. वास्तव में, टी करने के लिए α CaMKII + / - चूहों की तुलना में एक hyperlocomotor गतिविधि से पता चला हैवह 3 चूहों नियंत्रण और इस phenotype के सूचकांकों में मतभेद कायम करना सकता है.

    हमारी प्रयोगशाला में, हम 36 से अधिक उपभेदों अनुवांशिक इंजीनियर चूहों और जंगली प्रकार के एक टी भूलभुलैया परीक्षण में चूहों पर नियंत्रण स्वचालित तंत्र का उपयोग करने के लिए जीन, मस्तिष्क, और 15,16 व्यवहार के बीच संबंध को स्पष्ट आकलन किया है. हम 1200 से अधिक चूहों के कच्चे डेटा का एक बड़ा सेट प्राप्त किया है, और टी भूलभुलैया उत्परिवर्ती 3,16-22 चूहों के कई उपभेदों में प्रदर्शन के लिए डेटा की रिपोर्ट. पहले से ही शोध लेख में प्रकाशित उपभेदों के डेटा एक सार्वजनिक डेटाबेस (: यूआरएल के रूप में "माउस व्यवहार phenotype धन्यवाद" में शामिल हैं http://www.mouse-phenotype.org/~~V ). अध्ययन के कुछ प्रदर्शन कि उत्परिवर्ती Dtnbp1 1, 20 Nrd1 या Plp1 21 जीन के साथ चूहों स्मृति घाटे काम दिखा. इस प्रकार, हमारे साथ टी भूलभुलैया स्वचालित कार्य के लिए मानकीकृत प्रोटोकॉलतंत्र उत्परिवर्ती और जंगली की तरह चूहों पर नियंत्रण के बीच स्मृति समारोह पर आनुवंशिक प्रभाव का पता लगाने के लिए उपयुक्त है. व्यवहार परीक्षण प्रोटोकॉल के लिए मानकीकृत, दोहराया, और प्रयोगशालाओं की तुलना में परिणाम की जरूरत है. सुधार टी भूलभुलैया उपकरण परीक्षण प्रक्रियाओं के स्वचालन, जो प्रयोगशालाओं भर में इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल के मानकीकरण के लिए योगदान कर सकते हैं करने के लिए होता है.

    इस वीडियो लेख में दिखाया गया है, तंत्र और कार्यक्रम के वर्तमान संस्करण काला या agouti चूहों का परीक्षण करने के लिए हमें की अनुमति है, लेकिन हो सकता है नहीं सूरजमुखी मनुष्य चूहों. अब, हम प्रणाली का एक संशोधित संस्करण का निर्माण कर रहे हैं सूरजमुखी मनुष्य चूहों का परीक्षण किया जा करने के लिए सक्षम है. प्रणाली एक फायदा है कि vivo microdialysis में vivo में इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी में और optogenetics प्रयोगों टी भूलभुलैया परीक्षण के दौरान प्रदर्शन किया जा सकता है, क्योंकि दरवाजे के लिए फर्श के नीचे जाने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं. उदाहरण के लिए, कुछ शोधकर्ताओं ने हथियारों के चुनाव के दौरान हिप्पोकैम्पस में न्यूरॉन्स की electrophysiological गुण की जाँच की कोशिश कर सकते हैंहालांकि तंत्र की कुछ सुधार करने के लिए दरवाजे और गोली हटाने तंत्र actuators में से बिजली के शोर को कम करने की जरूरत हो सकती है.

    साथ में ले ली, टी - भूलभुलैया मजबूर प्रत्यावर्तन और बाएँ सही भेदभाव कार्यों संशोधित स्वचालित तंत्र का उपयोग कर काम कर रहे हैं और संदर्भ स्मृति और चूहों में व्यवहार में लचीलापन आकलन करने के लिए उपयोगी होते हैं.

    Disclosures

    ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

    Acknowledgements

    हम काज़ुओ नाकानिशी व्यवहार विश्लेषण के लिए अपनी छवि टीएम कार्यक्रम के विकास में मदद के लिए धन्यवाद. इस शोध खोज रिसर्च के लिए अनुदान में सहायता (19653081), अनुदान सहायता में वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए (बी) (21,300,121), अभिनव क्षेत्रों पर वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए अनुदान सहायता (व्यापक मस्तिष्क विज्ञान नेटवर्क) द्वारा समर्थित किया गया शिक्षा मंत्रालय, विज्ञान, खेल और जापान की संस्कृति, Neuroinformatics जापान केंद्र से अनुदान (NIJC), और शिखा और जापान विज्ञान और प्रौद्योगिकी एजेंसी (JST) के बर्ड से अनुदान.

    References

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    Comments

    5 Comments

    I have a question regarding the "trials to criterion". Each and every mouse tested should reach the criterion? Or can group all mice and see if the mean fits to the criterion. Thank you in advance and congratulations for the excelent protocol.
    Reply

    Posted by: Guilherme G.October 30, 2012, 12:50 PM

    In the case of alpha-CaMKII heterozygous knockout mice and the wild-type control mice, not all the control mice reached the criterion (80 % correct responses) at the last session. They showed 70-100 % correct responses; the mean % responses of the group fitted to the criterion.
    In most studies, the criterion is generally 75-90 %. You can adopt the criterion that you want to use, depending on your research.
    Reply

    Posted by: Hirotaka S.October 31, 2012, 7:29 AM

    Hello, thank you for this excellent article. Is there a way to obtain the Image TM software or a guide on modifying ImageJ? Thank you in advance.
    Reply

    Posted by: Maxym M.November 4, 2012, 8:51 PM

    We are planning to distribute the software freely and now preparing downloadable one. We will make an announce once it is ready. By the way, we are planning same thing for elevated plus maze test ( http://www.jove.com/video/1088/elevated-plus-maze-for-mice ) and the light dark transition test ( http://www.jove.com/video/104/lightdark-transition-test-for-mice ).
    Reply

    Posted by: Tsuyoshi M.November 4, 2012, 9:10 PM

    Now, Image TM is freely available from this URL. http://www.mouse-phenotype.org/software.html
    Hope it helps!
    Reply

    Posted by: Tsuyoshi M.November 25, 2013, 1:54 AM

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