Progettazione di un bioreattore per la pressione ciclica Ex Vivo Studio delle valvole cardiache aortica

1. Raccolta e preparazione dei tessuti

1. Le valvole aortica devono essere raccolti da suini adulti peso non superiore a £ 120 subito dopo la morte.
2. Lavare le valvole due volte con soluzione salina tampone fosfato sterile (PBS) e il trasporto al laboratorio in ghiaccio.
3. Tutte le fasi successive devono essere eseguite in condizioni sterili.
4. Assicurarsi che volantini non mostrano alcun segno di degenerazione, lacrimazione o calcificazione. Rimuovere volantini dalla radice aortica, tagliando 1 / 3 della distanza dal l'anello.
5. Volantini in luogo singoli pozzetti di una piastra ben sei Incubare per una notte con medie da 3 ml di coltura Dulbecco modificato Aquila integrato con 1% di soluzione anti-biotic/anti-mycotic e il 10% di siero fetale bovino a 37 ° C e 5% di CO _2.
6. In alternativa, le cellule isolate possono essere seminati in sei pozzetti piastre di coltura e utilizzato il dispositivo di pressione. Isolamento di cellule endoteliali e valvola di cellule interstiziali può essere eseguita come descritto in precedenza ^{13, 14.}

2. Studi di pressione

1. Una misura della pressione del sistema è stato progettato per studiare gli effetti mechanobiological di pressione ciclica nel tessuto della valvola aortica ^15.
2. Accedere al computer e aprire il programma LabVIEW (Figura 1).
3. Calibrazione:
   1. Prima della sperimentazione, il sistema dovrebbe essere opportunamente calibrato.
   2. Collegare l'alimentatore al circuito. Questo alimenta le elettrovalvole che controllano il flusso di aria all'interno e all'esterno della camera.
   3. Assicurarsi che l'aria compressa è collegata al sistema e aprire l'alimentazione di aria alla velocità completa.
   4. Accendere l'amplificatore di segnale. Assicurarsi che la lettura della tensione è 0,00. Regolare se necessario
   5. L'interfaccia LabVIEW dispone di un interruttore la scritta "TEST / RECORD". Assicurarsi che l'interruttore è impostato su "TEST". Fare clic sul pulsante "Air Supply" per aprire l'elettrovalvola di ingresso.
   6. Utilizzando il regolatore di pressione del gas, pressurizzare la camera con aria compressa a 1 PSI. La pressione nella camera può essere letto usando l'indicatore di pressione digitale situato sul retro finale piatto della camera. Una volta che la pressione è equilibrata, registrare la lettura della tensione da amplificatore di segnale. Ripetere l'operazione per PSI 2, 3, 4 e 5.
   7. Costruire una curva di calibrazione di pressione contro di tensione. La pressione deve essere convertito dal PSI al mmHg. L'equazione dal grafico può essere inserito nel codice del programma LabVIEW
4. Rimuovere la placca frontale in alluminio dalla camera di pressione e spruzzare la camera con il 70% di etanolo. Lasciare agire per un minimo di 10 minuti per consentire l'etanolo residuo dei fumi di dissipare.
5. Posto a sei pozzetti contenenti i campioni volantino nella camera e sostituire la piastra front-end. Garantire la tenuta è tenuta stringendo i dadi situati sui quattro barre filettate (che si trova ad ogni angolo della piastra finale) a mano. Posizionare la camera di pressione nel 37 ° C incubatore. Un diagramma schematico della camera di pressione è mostrata in figura 2.
6. L'interfaccia sarà richiesto all'utente di fornire la quantità di tempo i cicli di sistema tra ingresso e uscita aria compressa. Questi dovrebbero essere regolate per le condizioni diastolica e sistolica e 0.6s 0.4s per imitare, rispettivamente, ad una frequenza di 1Hz. L'utente deve inserire anche un file di dati percorso.
7. In LabVIEW, fare clic su Esegui e passare il "TEST / RECORD" passare a "RECORD".
8. Assicurarsi che la pressione è al livello desiderato utilizzando il grafico sull'interfaccia LabVIEW. La pressione può essere regolata utilizzando il regolatore di pressione del gas.
9. Eseguire il programma per la lunghezza di tempo desiderato.
10. Una volta che l'esperimento è completa, fare clic sul pulsante di arresto su LabVIEW, spegnere l'alimentazione dell'aria e aprire la valvola di scarico in camera di pressione.
11. Rimuovere la piastra di front-end dalla camera e recuperare così sei campioni piastra contenente. I campioni possono essere analizzati per l'espressione genica, espressione proteica, istologia, proprietà meccaniche etc

3. Rappresentante dei risultati:

Il sistema di pressione è in grado di simulare la pressione massima transvalvolare osservato sotto normotesi, fase I e fase II condizioni ipertesi. Tuttavia, la pressione non era in grado di mimare il gradiente di pressione sistolica, che è essenzialmente zero nel vivo. La frequenza è mantenuta a 1Hz, con un tempo di 0.6s dell'aria in ingresso e un tempo di scarico di 0.4s. Rappresentante pressione forme d'onda di condizioni di pressione normali che elevate ottenuti dal sistema può essere visto in figura 3.

Figura 1: Schermata dell'interfaccia LabVIEW.

Figura 2: Schema della camera di pressione A. vista isometrica della camera di pressione; B. Vista laterale della camera di pressione;C. Vista dall'alto della camera di pressione.

Figura 3: Grafico di simulazione della pressione all'interno della camera di pressione (A) normotesi, (B) Fase I ipertesi, e (C) Fase II condizioni ipertesi.

Il sistema di pressione con successo esposti lembi della valvola aortica a pressioni cicliche che erano rappresentativi della pressione diastolica transvalvolare. Tuttavia, non era in grado di simulare la pressione sistolica transvalvolare, come l'unica pressione è sceso a 40 mmHg. Pressione transvalvolare è la differenza tra la pressione in aorta ascendente e del ventricolo sinistro. Durante la diastole, quando la valvola è chiusa, la differenza di pressione è 80mmHg in condizioni normotesi e 90 mmHg e 100 mmHg in fase I e fase II, l'ipertensione, rispettivamente. Durante la sistole, quando la valvola è aperta, la differenza di pressione tra il ventricolo sinistro e dell'aorta ascendente è zero. I cambiamenti cellulari che si verificano nella malattia della valvola aortica si ritiene siano associati ad alta pressione diastolica, quindi, il fatto che la pressione non è caduto a zero non può essere una delle principali preoccupazioni. Questo si basa sul presupposto che si tratta di grandezza pressione e non l'ampiezza di pressione che è la forza trainante risposte biologiche. Ridurre la pressione da 100 mmHg a 0 mmHg richiede 1,20 ± 0.04s, riportato dall'analisi dei dati di 20 cicli di pressione. Dal momento che la quantità di tempo si chiude la valvola aortica è circa 2 / 3 del ciclo cardiaco, l'afflusso di aria nella camera a pressione richiederebbe 2.4s per creare lo stesso equilibrio di apertura e chiusura della valvola con esperienza in condizioni fisiologiche. Di conseguenza, una frequenza di 0,28 Hz sarebbe stato utilizzato per testare gli effetti sia sistolica e diastolica livelli di pressione transvalvolare su mechanobiology valvola aortica. Tuttavia, se la pressione sia sistolica transvalvolare diastolica sono da simulare a una frequenza di 1 Hz fisiologica, una pompa a vuoto e serbatoio può essere montato l'elettrovalvola di scarico. La pompa a vuoto può essere impostata per rimuovere una quantità fissa di pressione in modo che quando si apre la valvola di scarico, la quantità di aria necessaria per ridurre completamente la pressione dal livello di pressione impostato sarebbe stato redatto nel serbatoio vuoto. La rimozione della pressione creerebbe un ambiente 0 mmHg, sinonimo di pressione sistolica transvalvolare. Al contrario, quando la valvola di scarico si chiude, il vuoto non avrà più effetto la camera e consentirebbe di aumentare la pressione tramite aria compressa. Oltre a utilizzare una pompa a vuoto per imitare più condizioni fisiologiche, una valvola di scarico con un diametro maggiore può essere usata per la caduta di pressione all'interno del bioreattore più rapidamente. Attualmente, il 3 / 8 "di scarico della valvola solenoide di diametro ha una portata di 3,3 litri al minuto (a 60 ° F, peso specifico di 1) e che, una valvola di scarico con un diametro di 2" ha una portata di 28,0 litri al minuto. Più una valvola solenoide diametro è più conveniente che usare una pompa a vuoto, tuttavia non può essere in grado di abbandonare completamente la pressione a zero nel raggio d'azione fisiologico e deve pertanto essere ulteriormente analizzato. In alternativa, elettrovalvole varie innescato dal circuito stesso controllo che si aprono allo stesso tempo potrebbe essere aggiunto, quindi "elaborazione parallela" la fuoriuscita del gas.

Il sistema potrebbe essere gestito in continuo mediante in-house aria compressa. Studi precedenti hanno dimostrato che i cambiamenti acuta nei geni e di espressione delle proteine ​​può avvenire in due ore ^{16, 17.} Tuttavia, questa durata non può essere sufficiente per studiare transitori gene / proteina espressione o cambiamenti nel fenotipo cellulare a seguito di sollecitazioni meccaniche. Lo svantaggio di utilizzare l'aria compressa è che il gas non contiene il 5% di CO _2, che è importante per il controllo del pH del terreno di coltura. Questo può essere superato con l'aggiunta di tampone Hepes al mezzo. Inoltre, le cellule producono CO ₂ come prodotto di scarto del metabolismo. Secrezione di CO ₂ dal tessuto eviterà anche il medium diventa fondamentale.

Oltre ai test valvole aortica a pressioni diverse, può essere prudente per studiare gli effetti di diverse frequenze pure. Per esempio, gli effetti dei cambiamenti nella frequenza cardiaca prima, durante e dopo l'intervento potrebbe chiarire cambiamenti nell'espressione delle proteine ​​all'interno della valvola. Aritmie postoperatorie si verificano in oltre il 20% dei pazienti ^18-21. Il programma LabVIEW utilizzato per questo sistema permette all'utente di scegliere la lunghezza del tempo d'aria entra ed esce la camera, quindi, la frequenza del ciclo può essere facilmente regolata. Il dispositivo consente una frequenza massima di 1,5 Hz (90bpm) a causa della quantità di tempo necessario per scaricare la pressione dalla camera. Come si vede in Figura 3, una riduzione della pressione maggiore si è verificato nel 0.2s prima volta dopo l'attivazione della valvola di scarico, poi gradualmente diminuita la pressione residua per la 0.2s restante di gas di scarico. La perdita di carico medio del 0.2s iniziale di scarico era 45,8 ± 0.34mmHg, misurata nell'arco di 20 cicli di pressione. Dato che i test di fase II condizioni ipertesi richiede solo la pressione in bicicletta tra almeno 60-100 mmHg, una frequenza di 1,5 Hz permette 0.22s per gas di scarico, che è ampio time al crollo del 40 mmHg di pressione. Se una pompa a vuoto è collegato alla valvola di scarico, potrebbe facilitare un calo più rapido della pressione e permetterebbe di prova più alta frequenza. La frequenza minima del bioreattore non si limita, però, perché il regolatore di pressione potrebbe consentire lento afflusso di aria e la valvola di scarico avrebbe il tempo sufficiente per cadere la pressione all'interno del reattore.

In conclusione, un sistema di coltura sterile è stato costruito per consentire lo studio ex vivo di mechanobiology valvola cardiaca aortica suina. La pressione all'interno del bioreattore in bici tra i livelli di pressione diastolica transvalvolare per condizioni fisiologiche e patologiche. Per soddisfare i requisiti di sistema, il bioreattore è stato compatto e potrebbe quindi essere contenuta all'interno di un incubatore umidificato per mantenere la temperatura dei tessuti a 37 ° C. Inoltre, l'entità della pressione e della frequenza sono stati controllati in modo indipendente, permettendo una vasta gamma di condizioni da studiare.