Epstein-बर्र वायरस विकास तब्दील Lymphoblastoid सेल लाइन्स की स्थापना

Hui-Yuen, J., McAllister, S., Koganti, S., Hill, E., Bhaduri-McIntosh, S. Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines. J. Vis. Exp. (57), e3321, doi:10.3791/3321 (2011).

1. EBV शेयर तैयारी

1. 3 एक्स 10 ⁵ कोशिकाओं / एमएल पर एक 75cm ² टिशू कल्चर बाँझ तकनीक का उपयोग कर फ्लास्क में, तेजी से B95 8 कोशिकाओं (13 # 1612 CRL ATCC) बढ़ती subculture. कोशिकाओं को पूरा RPMI 1640 में हो रहे हैं 10% निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय (FBS) सीरम, पेनिसिलीन / 100U/ml में स्ट्रेप्टोमाइसिन और 100 / μg मिलीलीटर, गर्मी क्रमशः युक्त और Amphotericin बी 0.5 μg / मिलीलीटर में 37 ° सी उपस्थिति में 5% सीओ _2.
2. चालीस - आठ घंटे बाद, 1 x 10 ⁶ कोशिकाओं / एमएल पर ताजा पूरा RPMI 1640 में resuspend कोशिकाओं. वायरस उत्पादन को प्रेरित करने के लिए, 1 घंटे के लिए 20ng/ml tetradecanoyl phorbol _{(टीपीए)} एक मानक सीओ 2 इनक्यूबेटर में एसीटेट के साथ कोशिकाओं को उत्तेजित. कोशिकाओं RPMI 1640 के साथ तीन बार धो टीपीए हटायें.
3. पूरा RPMI 1640 के मूल मात्रा (1.2) से कोशिकाओं Resuspend और सीओ ₂ इनक्यूबेटर में 96 घंटे के लिए फ्लास्क जगह . इस विधि के संक्रामक वायरस बराबर के उच्च titers का उत्पादन करने के लिए दिखाया गया है⁶ ticles.
4. X 600 जी में 4 बजे 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र ° C कोशिकाओं से EBV युक्त संस्कृति सतह पर तैरनेवाला अलग. एक वर्ष से अधिक के लिए 0.45 माइक्रोन फिल्टर, विभाज्य, और दुकान -70 ° C के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला फ़िल्टर.
   एक विकल्प B95-8 ATCC (VR-1492) से युक्त EBV कोशिकाओं से सतह पर तैरनेवाला प्राप्त करने और ATCC से सिफारिश की कमजोर पड़ने पर उपयोग है.

2. परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMC) के अलगाव

1. 10 मिलीलीटर रक्त दाता से एक heparinized सिरिंज या एक heparinized रक्त ट्यूब में ड्रा. कमरे के तापमान पर एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 20 मिलीलीटर पीबीएस के साथ रक्त पतला.
2. बुनियाद 15 मिलीलीटर Ficoll Hypaque लिम्फोसाइट जुदाई मध्यम के साथ पतला रक्त. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए ब्रेक के बिना 225 x जी पर अपकेंद्रित्र .
3. एक नया 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में buffy कोट और हस्तांतरण निकालें. पीबीएस के साथ 50 मिलीलीटर मात्रा को उठाएँ और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 600 XG पर स्पिन.
4. POUसतह पर तैरनेवाला बंद आर. 50 मिलीलीटर पीबीएस में गोली resuspending और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर x 600 जी में कताई द्वारा कोशिकाओं को धो लें . दो बार एक समान तरीके में और अधिक धो लें.
5. Resuspend पूरा RPMI के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं धोए. कक्षों की 5 μL प्रयोग Trypan नीले रंग में एक 1 / 10 मन्दन तैयार. रहते हैं एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना.
6. एक 25 सेमी ² टिशू कल्चर फ्लास्क में पूरा RPMI का उपयोग करने के लिए 2 एक्स 10 ⁶ मिलीग्राम / एक सेल एकाग्रता प्राप्त करने की मात्रा समायोजित करें .

3. EBV के साथ संक्रमण

1. सेल निलंबन FK506 (एजी वैज्ञानिक) से 2.6 से 20 एनएम के एक अंतिम एकाग्रता जोड़ें. सीओ ₂ इनक्यूबेटर में 37 प्लेस फ्लास्क ° सी के एक घंटे के लिए .
2. तेजी से EBV के एक विभाज्य पिघलना. इनक्यूबेटर से फ्लास्क निकालें और 1 / 10 कमजोर पड़ने पर कोशिकाओं को EBV जोड़ने. आमतौर पर, इस कमजोर पड़ने 50-100 के MOI प्रदान करता है. भंवर मिश्रण करने के लिए और 37 _पर यह सीओ 2 इनक्यूबेटर में ईमानदार जगह फ्लास्क डिग्री सेल्सियस

नोट वेंचरण 4, सफल परिणाम की भविष्यवाणी करने के लिए प्रदर्शन, एक वैकल्पिक कदम है. यदि चरण 4 के लिए प्रदर्शन किया जा रहा है, आप 2 ^x 10 6 नियंत्रण के रूप में कोशिकाओं / मिलीलीटर में संयुक्त राष्ट्र संक्रमित PBMC के एक अतिरिक्त फ्लास्क सेते की आवश्यकता होगी.

4. कोशिकाओं के proliferating जनसंख्या (वैकल्पिक कदम) की पहचान

1. पीबीएस + 5% FBS: FACS बफर तैयार करें. 4 में स्टोर डिग्री सेल्सियस
2. निम्नलिखित एंटीबॉडी 4.6 चरण में कोशिकाओं को धुंधला करने के लिए 50 μL मात्रा प्रत्येक में घोला जा सकता है. एंटीबॉडी dilutions FACS माउस आईजीजी (सिग्मा) के 1mg/ml एंटीबॉडी द्वारा गैर विशिष्ट बंधनकारी रोकना युक्त बफर में बनाया जाना चाहिए.
   1. पीई संयुग्मित विरोधी CD23 एंटीबॉडी (कमजोर पड़ने 1 / 50) के साथ एकल दाग
   2. एकल FITC संयुग्मित विरोधी CD58 एंटीबॉडी (कमजोर पड़ने 1 / 50) के साथ दाग
   3. पीई Cy5 संयुग्मित विरोधी CD19 एंटीबॉडी (कमजोर पड़ने 1 / 50) के साथ एकल दाग
   4. ट्रिपल CD23, CD58, और CD19 (1 / 50 मन्दन) के लिए दाग
   5. पीई संयुग्मित निर्धारण नियंत्रण के साथ एकल दागएंटीबॉडी CD23-पीई करने के लिए मिलान (विरोधी CD23 एंटीबॉडी के रूप में एक ही एकाग्रता में)
   6. एकल FITC संयुग्मित निर्धारण नियंत्रण FITC CD58 - मिलान (विरोधी CD58 एंटीबॉडी के रूप में एक ही एकाग्रता में) एंटीबॉडी के साथ दाग
   7. के साथ एक दाग पीई Cy5 संयुग्मित निर्धारण नियंत्रण एंटीबॉडी के लिए मिलान CD19-पीई Cy5 (विरोधी CD19 एंटीबॉडी के रूप में एक ही एकाग्रता में)
   8. ट्रिपल सभी तीन निर्धारण नियंत्रण एंटीबॉडी के साथ दाग.
   अस्थायी रूप से 4 ° C पर अंधेरे में घोला जा सकता है की दुकान.
3. दिन तीन EBV के बाद जोखिम में धीरे ज़ुल्फ़ फ्लास्क एक अधिक समान सेल निलंबन को प्राप्त करने के लिए. एक 2ml Eppendorf ट्यूब में कुप्पी से 2ml निकालें. 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 3000 rpm पर एक microcentrifuge में ट्यूब स्पिन.
4. 5 x 10 ⁶ 1 10 x ⁷ कोशिकाओं मिलीग्राम / FACS बफर में सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं महाप्राण (व्यंजन).
5. व्यक्तिगत Eppendorf ट्यूबों में आठ 50μl aliquots या एक 96 अच्छी तरह से वी के नीचे की थाली निकालें. स्पिन ट्यूब या 1500 x जी पर थाली3 मिनट के लिए.
6. सतह पर तैरनेवाला और भंवर ट्यूबों / प्लेट त्यागें. प्रत्येक ट्यूब में Resuspend कोशिकाओं / अच्छी तरह से उपयुक्त एंटीबॉडी 4.2 में तैयार dilutions युक्त FACS बफर के 50 μL में.
7. 30 मिनट के लिए अंधेरे में बर्फ पर ट्यूबों / प्लेट सेते हैं. 3 मिनट के लिए 3000 rpm पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं, सतह पर तैरनेवाला निकालने के लिए, और FACS बफर के 200 μL जोड़ने. कोशिकाओं को फिर से अपकेंद्रित्र और धोने के लिए पूरा करने के लिए सतह पर तैरनेवाला हटायें. दो अधिक washes दोहराएँ.
8. 200 μL FACS में Resuspend कोशिकाओं बफर और एक प्रवाह कोशिकामापी, 20,000 घटनाओं / ट्यूब प्राप्त का उपयोग कर डेटा प्राप्त.
9. WinMDI (FACS पीसी पर डेटा विश्लेषण के लिए फ्रीवेयर) का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण. जीना आगे और पक्ष स्कैटर प्रोफाइल का उपयोग कोशिकाओं पर गेट. फिर, गेट CD19 ⁺ निर्धारण नियंत्रण विरोधी CD19 एंटीबॉडी के लिए मिलान एंटीबॉडी के साथ दाग कोशिकाओं के साथ तुलना करने के बाद (बी सेल मार्कर) की अभिव्यक्ति के लिए जीवित कोशिकाओं. CD19 प्लॉट ⁺ CD23 के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता के साथ जीना बी y-अक्ष को x-अक्ष और CD58 के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता पर कोशिकाओं. CD23 निर्धारित ⁺ CD58 ⁺ EBV उजागर मिलान निर्धारण नियंत्रण एंटीबॉडी के साथ दाग कोशिकाओं की तुलना द्वारा कोशिकाओं. CD23 ^हाय CD58 ⁺ EBV उजागर संस्कृति में कोशिकाओं (चित्रा 2C) की उपस्थिति EBV से संक्रमित विकास तब्दील कोशिकाओं के सफल परिणाम की भविष्यवाणी की है . इसके विपरीत, CD23 ^हाय CD58 ⁺ कोशिकाओं जब कोशिकाओं EBV (2A चित्रा) उजागर नहीं कर रहे हैं या गैर immortalizing EBV (चित्रा 2B) की एक नस्ल को उजागर उभरने नहीं करते हैं. CD23 CD58 ^{हाय +} कोशिकाओं प्रयोगात्मक किया गया है प्रसार गुजरना प्रदर्शन किया और बाद में LCL (14) की स्थापना.

5. विस्तार और LCL के cryopreservation

1. प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा कोशिकाओं के विज़ुअलाइज़ेशन EBV संक्रमण के बाद एक सप्ताह तक, कोशिकाओं के समूहों प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा दिखाई दे रहे हैं. चित्रा 3 एक फ्लास्क में जल्दी सूक्ष्म समूहों (3B चित्रा) के एक उदाहरण से पता चलता है.
2. जैसा कि समय की प्रगति, सूक्ष्म समूहों बनने बड़ा कि इस तरह के clumps दिखाई दे रहे हैंफ्लास्क में macroscopically. चित्रा 3C प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा स्थापित LCL में कोशिकाओं के बड़े समूहों से पता चलता है.
3. कोशिकाओं को दूध पिलाने: संस्कृति फ्लास्क में 12 दिन मध्यम संस्कृति की मात्रा डबल. बाद में, इसकी मात्रा 2-3 गुना वृद्धि पूरा RPMI का उपयोग करके संस्कृति का विस्तार.
4. खिला कोशिकाओं की आवधिकता सेल के विकास की दर के आधार पर निर्धारित किया जाना चाहिए. जब संस्कृति के माध्यम पीले रंग बदल जाता है, यह आम तौर पर समय ऊपर के रूप में मीडिया की जगह है. आम तौर पर एक बार प्रति सप्ताह, ऐसा होता है. हालांकि, कुछ सेल लाइनों के लिए अधिक या कम बार खिलाया जा की आवश्यकता हो सकती है. 75-100 मिलीलीटर के लिए अगले कुछ हफ्तों में संस्कृति का विस्तार करें.
5. Cryopreservation: जब नीचे कोशिकाओं ठंड, x 600 जी में कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र कोशिकाओं . ठंड ठंड 90% FBS युक्त मध्यम और 10% dimethylsulfoxide में 1 एक्स ⁷ कोशिकाओं 10 मिलीलीटर / सतह पर तैरनेवाला और resuspend सेल गोली निकालें. तरल नाइट्रोजन में रखें ट्यूब.

6. प्रतिनिधि परिणाम:

सफल परिणाम CD23 ^हाय CD58 ⁺ कोशिकाओं की उपस्थिति द्वारा भविष्यवाणी की है. लगभग EBV के लिए प्रदर्शन के बाद 3-4 दिन जीवित कोशिकाओं के 2-3% इस प्रोफ़ाइल (चित्रा 2C) होना चाहिए. अन्य CD23 के उप आबादी ⁺ CD23 ^{- +} CD58, और CD58 ^{कोशिकाओं} मनाया EBV के लिए प्रदर्शन के बाद कम से कम ¹⁴ प्रसार दिखाने. संयुक्त राष्ट्र संक्रमित (2A चित्रा) कोशिकाओं और कोशिकाओं HH514 16 कोशिकाओं (चित्र 2B), EBV के एक गैर immortalizing तनाव शरण से EBV को उजागर ^CD23 हाय ^{CD58 +} कोशिकाओं का प्रदर्शन नहीं करते हैं .

तुम भी प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा कोशिकाओं कल्पना के सफल परिणाम की निगरानी हो सकता है: जैसा कि पहले उल्लेख किया है, एक सप्ताह के भीतर EBV संक्रमण के बाद, फ्लास्क में कोशिकाओं के छोटे समूहों प्रकाश माइक्रोस्कोपी (चित्रा 3B) से दिखाई दे रहे हैं. जैसा कि समय की प्रगति और कोशिकाओं LCL में विकसित, सूक्ष्म समूहों बड़ा हो ऐसी है कि clumps दिखाई फ्लास्क में macroscopically हैं (3C चित्रा).

चित्रा 1 और lymphoblastoid सेल लाइनों की पीढ़ी cryopreservation के लिए वर्कफ़्लो. परिधीय रक्त में एक Ficoll ढाल के माध्यम से centrifuged है. PBMC वर्तमान में एक स्थापित ढाल के buffy कोट FK506 EBV के अलावा द्वारा पीछा करने के लिए उजागर कर रहे हैं. EBV उजागर कोशिकाओं को 37 डिग्री _5% सीओ 2 को स्थापित करने और बाद में विस्तार cryopreservation के लिए LCL की उपस्थिति में सी उगाए जाते हैं .

चित्रा 2 बी कोशिकाओं EBV के लिए जोखिम के बाद प्रसार से गुजरना करने के लिए उम्मीद की एक उप जनसंख्या की पहचान. संयुक्त राष्ट्र संक्रमित (ए) PBMC या PBMC HH514 16 कोशिकाओं (बी) से या FK506 की उपस्थिति में B95 8 कोशिकाओं (सी) से व्युत्पन्न EBV उजागर 3 दिन पर काटा गया. कक्ष fluorochrome संयुग्मित CD19, CD23, और CD58 के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी के साथ दाग रहे थे. जीवित कोशिका पर gating बादहै, संयुक्त राष्ट्र संक्रमित (ए) और EBV से उजागर (बी और सी) CD19 ⁺ बी कोशिकाओं CD23 और CD58 के अभिव्यक्ति के लिए जांच की गई. बी CD23 के CD58 और उच्च स्तर (CD23 CD58 ^{हाय +)} व्यक्त की कोशिकाओं के एक उप जनसंख्या परिवर्तन सक्षम EBV (B95 8 कोशिकाओं से व्युत्पन्न) उजागर करने के लिए कोशिकाओं में ही मनाया दर्शाया गया है .

चित्रा 3 EBV से संक्रमित कोशिकाओं में कोशिका समूहों के विज़ुअलाइज़ेशन. PBMC FK506 साथ इलाज किया गया और EBV से संक्रमित है. संयुक्त राष्ट्र संक्रमित (ए) और EBV से उजागर (बी) कोशिकाओं को एक सप्ताह के बाद संक्रमण चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी (10X आवर्धन) द्वारा जांच की गई. पांच हफ्ते पुरानी lymphoblastoid सेल लाइन सी. में दिखाया गया है

इस पत्र में वर्णित विधि तेजी से अमरता और cryopreservation बार के साथ परिधीय रक्त दाता से LCL उत्पन्न करता है. FK506 के उपयोग के माध्यम से, एक टी immunosuppressant सेल, और संक्रामक वायरस के उच्च titers हम EBV से संक्रमित परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear से बी कोशिकाओं के प्रसार को बढ़ावा देने में सक्षम हैं. इन उपायों को और अधिक कुशल वर्णित विधि बनाने के लिए, बाद के प्रयोगों के लिए कोशिकाओं का तेजी से विस्तार में जिसके परिणामस्वरूप.

परंपरागत रूप से, विकास ^{परिवर्तन EBV 6,} 15 को प्रदर्शन के बाद एक सप्ताह के बारे में प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा कोशिकाओं के समूहों के दृश्य के द्वारा नजर रखी है. हालांकि, कक्षों की क्लस्टरिंग EBV की मध्यस्थता विकास और परिवर्तन की एक विशिष्ट संकेत नहीं है. हम पहले के माध्यम से प्रवाह cytometry ¹⁴ proliferating सेल की आबादी के अनुरूप पहचान का प्रदर्शन किया है, तीन दिनों पिछाड़ी के रूप में एक सटीक और विशिष्ट जल्दी के रूप में सफल परिणाम को निर्धारित करने के लिए विधि प्रदानएर बी कोशिकाओं की EBV के लिए जोखिम.

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

इस शोध NIH AI062732 K08 अनुदान, HD001401 K12, और 1UL1RR024139-02 और एक बाल चार्ल्स एच. हूड फाउंडेशन से स्वास्थ्य अनुसंधान SB एम अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था. और पथरीले ब्रुक न्यूयॉर्क के राज्य विश्वविद्यालय में रिसर्च फाउंडेशन द्वारा.

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