Klumpformet Assay til måling af TGF-β-induceret Invasion

1. Forberedelse af methocel opløsning (500 ml)

1. Autoklave 6 g methylcellulose i en 500 ml flaske med en magnetomrører.
2. Opløs methylcellulose i 250 ml forvarmet DMEM/F12 uden serum (60 ° C) i 20 min.
3. Tilsæt 250 ml DMEM/F12 (RT) indeholder 10% hest serum. Bland natten (4 ° C).
4. Ryd den løsning ved centrifugering (5000g, 2 timer, 4 ° C).
5. Tag den klare meget tyktflydende løsning på en ny slange (ca. 90-95% af bestanden løsning).
6. Opbevares ved 4 ° C indtil brug.

2. Klumpformet kultur

1. Forbered en 20% methocel opløsning (10 ml methocel og 40 ml vækstmedium).
2. Vask celler to gange med PBS, tilsæt 0,1% trypsin og inkuberes celler ved 37 ° C
3. Resuspender cellerne i vækstmediet og tælle cellerne.
4. Forbered en suspension af 10 000 celler pr ml i 20% methocel.
5. Tilføj cellesuspension til de 96 godt rund bund suspension plader (100 μl per brønd).
6. Næste dag, skal du kontrollere klumpformet dannelsen i suspensionen plader. Spheroids vil være klar til brug efter 1-3 dage.

3. Forberedelse af kollagen

1. Forbered på is en opløsning på 8 ml kollagen, 1 ml 10x PBS, 1 ml 0,1 N NaOH og 3 dråber 0,1 N HCl. Kontroller, om pH-værdien er 7,4 ved at afdække nogle af de løsning på pH indikator strips. Justér pH, hvis uden for rækkevidde.
2. Tilsæt 50 μl af neutraliseret kollagen løsning i brønde af en 96 brønds plade
3. Inkuber ved 37 ° C, indtil kollagen er stivnet (90 min).
4. Forbered methocel-kollagen-ligand løsninger på is: for hver ligand pipette 1 del af kollagen løsning. Tilsæt 20 ng per ml af kollagen TGF-β. Efter fortynding med methocel og spredning over de forskellige lag, vil den endelige koncentration af TGF-β være 5 ng / ml Bland ved hvirvelblanding. Tilsæt 1 del af methocel-løsning. Bland ved hvirvelblanding.

4. Klumpformet embedDing

1. Placer en 200 μl tip, som har ca 5 mm i spidsen afskåret, på en 200 μl pipette. Sug op en klumpformet med pipetten og omhyggeligt Substratet i en tom tallerken. Se hvis klumpformet forbliver inde i spidsen. Den klumpformet er synlig som en hvid prik. Uden at slippe stemplet, suger op til 100 μl kollagen-methocel blandingen og dosere den klumpformet i kollagen blandingen i en kollagen-belagt 96 brønde. Gør dette til 12 spheroids for hver tilstand.
2. Lad kollagen størkne mindst 30 minutter ved 37 ° C
3. Fjern luftbobler med en 200 μl spids.
4. Tilsæt 50 μl af medium med 1,6% serum og hæmmere opløst i DMSO. For SB-431542 tilsættes 4 μl af stamopløsning (10 mM) til 1 ml medium. Efter diffusion, vil den endelige koncentration af hæmmeren blive 10 ìm. TGF-β og hæmmere vil udsætte løbet af forsøget. Tag billeder af spheroids under mikroskopet med 40X forstørrelse.
5. Efter 48h af stimulation med TGF-β og / eller inhibitorer, tage billeder af spheroids under mikroskopet med 40X forstørrelse.
6. Mål det område, som invaderende spheroids efter 2 dage og trække startområdet. Måling af arealet af en klumpformet: Åbn billedet fra klumpformet i Adobe Photoshop Extended (figur 2A) og vælg værktøjet Hurtig markering (figur 2B). Musemarkøren ændres til en cirkel med en 'plus' (+) tegn (Figur 2C). Mens du trækker markøren over klumpformet, vil Photoshop genkende grænser klumpformet. Hvis et område uden for klumpformet er valgt, kan denne region udelukkes fra valget ved at trykke på Alt-tasten eller ved at bruge den negative udvælgelse værktøj, der er angivet med et (-) tegn i værktøjslinjen. Markøren skifter til en cirkel med en "minus" (-) tegn, og ved at trække markøren over den uberettiget valgte område, er dette område fjernes fra markeringen (Figur 2D). Hvis det er nødvendigt, flere regioner kan vælges ved at trykke på ShIFT-knappen. At arbejde mere præcist, kan størrelsen af ​​musemarkøren justeres ved at ændre pensel diameter på værktøjslinjen (Figur 2E). Når hele klumpformet er valgt, er arealet af udvælgelsen beregnede via ANALYSE-foranstaltning i menulinjen eller ved at trykke på Ctrl + Shift + M (Figur 2F). Målingen optagelse vindue vises viser filnavnet og området af markeringen i pixels, samt andre data (figur 2G). Hvis flere valg måles, den første linje viser summen af ​​alle områder. Målingerne af de enkelte valg er præsenteret i linjerne nedenfor. De data, af alle de målinger kan eksporteres til en tekstfil og åbnes i Excel.

5. Repræsentative resultater:

Et eksempel på klumpformet analysen med MCF10A1 (M1) normale bryst epitelceller, forvandlede H-RAS MCF10AneoT (M2) celler og M2-afledte MCF10CA1a (M4) er givet i figur 3. M1 celler viste kun svage invasion udenstimulation, men invaderede væsentligt bedre ved stimulation af TGF-β. I modsætning hertil-RAS transformerede M1-afledte M2 invaderede allerede effektivt uden tilsætning af stimuli, og dette blev yderligere øget 4-5 gange ved TGF-β behandling. M4 celler viste den stærkeste invasionen, både med og uden TGF-β tilføjelse.

Dernæst har vi undersøgt, om vi kunne forstyrre TGF-β-induceret invasion i dette klumpformet model ved hjælp af kemiske inhibitorer. Til dette formål har vi brugt SB-431542, en ATP analog og selektiv hæmmer af kinase aktivitet TβRI, samt activin type IB receptor (ActRIB) og activin receptor-lignende kinase (ALK) 7 ^12. Som forventet, SB-431542 potente hæmmede TGF-β-induceret invasion af M1, M2 og M4 celler (Fig 4), indikerer, at TGF-β-induceret invasion er TβRI-kinase afhængig. Desuden blev det basale invasion af spheroids også stærkt hæmmet, tyder på, at basal invasion er ligeledes degige af TGF-β.

Figur 1. Flow diagram af 3D klumpformet analysen. Først er celler belagte under ikke-klæbende forhold i u-formede suspensioner plader. Celler aggregrate ind multcellular spheroids og kan være indbygget i en collagen matrix. Ind i denne kollagen matrix, er de i stand til at invadere.

Figur 2. Kvantificering af det område, som spheroids ved hjælp af Adobe Photoshop Extended. (A) Billedet af klumpformet åbnes i Adobe Photoshop Extendend (B) Valg af værktøjet Hurtig markering (C) Hvis du trækker markøren over klumpformet at vælge det område af klumpformet (D) Fjernelse af et wongly omfattede område ved hjælp af negative Quick Selection tool (E) Justering af pensel størrelsen af ​​værktøjet Hurtig markering for mere præcist at vælge det område (F) Valg afmåling kommandoen til at optage (G) Eksempel på en måling rekord.

Figur 3. TGF-β-induceret invasion af spheroids af spontant udødeliggjort MCF10A1 (M1) (A), RAS-transformerede MCF10AneoT (M2 (B) og dets metastatisk afledte MCF10CA1a (M4) (C). M1, M2 og M4 spheroids indlejret i kollagen blev behandlet med 5ng/ml af TGF-β for 48 timer som angivet. AC repræsentant billeder taget på dagen for at integrere og to dage senere. D Relativ invasion blev kvantificeret som arealet forskel på dag 2 minus dag 0. Resultaterne udtrykkes som gennemsnit ± SD Tilpasset fra ^13.

Figur 4. Basal og TGF-β-induceret klumpformet invasion hæmmes by SB-431542. M1, M2 og M4 spheroids var indlejret i kollagen og behandles med 5ng/ml TGF-β og / eller 10 ìm SB-431542 som angivet. Repræsentant billeder taget efter 2 dage (A). Relativ invasion blev kvantificeret som arealet forskel på dag 2 minus dag 0 (B). Resultaterne udtrykkes som middel ± SD Tilpasset fra ^13.

Vi har etableret en klumpformet model, hvor MCF10A1 celler og dens maligne derivater invaderer ind i en Kollagenmatrix'en i en TGF-β-afhængig måde. For det første er spheroids dannet i 96-brønde rund bund suspension plader i overværelse af methylcellulose. Selvfølgelig kan også U-formet poly-HEMA plader anvendes til dette formål. Methylcellulose er absolut påkrævet i dette trin, da celler vil dø i mangel af methylcellulose. TGF-β er tilsat direkte til kollagen-methocel blanding, da vi fandt, at celler reagerede mindre godt til TGF-β, da denne faktor blev tilføjet til mediet op toppen af ​​kollagen. Men det er tilrådeligt at tilføje kemiske hæmmere opløst i DMSO ikke direkte ind i collagen, da DMSO udfældninger i den iskolde kollagen-methocel blanding. Derfor har vi tilføje disse forbindelser på mellemlangt på toppen af ​​kollagen.

Efterfølgende er celler indlejret i et kollagen 3-dimensional klima for at tillade dem at invadere ind i collagen matrix. Når man sammenligner de invasive egenskaber for de forskellige MCF10A1 cellelinjer fandt vi, at basal invasion såvel som TGF-β-induceret invasion steg fra den relativt godartede M1 celler, til højere niveauer i RAS-transformerede M2 ​​derivat, til endnu højere niveauer i metastatisk M4 variant. Således invasive egenskaber korreleret med den relative tilstand af aggressivitet af disse tre cellelinjer ^7,8,14.

Indlejring af klumpformet ind i collagen er et kritisk skridt i analysen. Påvisning af klumpformet i pipettespidsen kan være svært, når du udfører analysen for de første par gange. Man kan undgå dette ved at indsamle spheroids i et rør, spinding dem ned, fjerne supernatanten og resuspender spheroids i kollagen-methocel blanding. Dette kræver mere spheroids som input, som omkring 50% af spheroids går tabt under denne proces. Desuden, flerespheroids kan ende op i et godt og kunne ligge for tæt på hinanden for at analysere. Desuden er det foretrækkes ikke at have mere end en klumpformet pr godt for at undgå muligheden for, at spheroids kan interferere med hinanden (fx ved at udskille vækstfaktorer). Derfor ophvirvling skridt er et afgørende skridt ved hjælp af denne metode.

En begrænsning af denne analyse er, at vi analysere en 3-dimensionelle assay i en 2 dimensionel fly. Som det kan ses i figur 3 og 4, de fleste celler normalt invaderer i samme plan. Men spheroids, der er placeret meget tæt på kanten af ​​brønden invadere generelt mere i dybden, og som af denne grund udelukket fra analysen. Selvfølgelig ville det være muligt at foretage analysen i 3D, for at få et mere præcist resultat. Men det kræver avanceret hardware og software og gavn for beregning af volumen i stedet for at bruge området kan ikke opveje den ulejlighed. Især da vi fandt, at variationen i at starte størrelseaf 3-dimensionelle spheroids målt i 2D, er generelt kun 5-10%.

En anden ulempe ved denne metode er, at billeddannelse er en tidskrævende skridt, da spheroids er placeret i forskellige højder, hvilket hæmmer automatisk billedbehandling. Også analysen skridt er tidskrævende og kræver billeder med god kontrast fra klumpformet til matrix for at gøre brug af Photoshops evnen til automatisk at genkende grænsen til klumpformet. Hvis kontrasten er for lav, kan man nemt tilpasse lysstyrke og kontrast ved hjælp af Niveauer og Kurver kommandoer i Photoshop. En anden måde at øge kontrasten ville være at bruge en vital fluorescerende farvestof.

Som en alternativ måde at kvantificering, kunne man tegne området omkring klumpformet manuelt ved hjælp Billede J. Et forskud på billede J er, at det er freeware (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Men vi fandt den manuelle tegning af uregelmæssig form af de invaderede spheroids i Image Jen tidskrævende skridt i forhold til Photoshops Quick Selection Tool.

Protokollen kan tilpasses til at undersøge invasion af andre cellelinjer, forudsat at cellerne er i stand til at danne spheroids.Furthermore, den optimale koncentration af TGF-β til at fremkalde invasion af den cellelinje, kan være anderledes. I alle vores cellelinjer, inducerer TGF-β invasion på 5 ng / ml, men M4 præsterer bedre, når du bruger 2 ng / ml.

Desuden kan denne analyse tilpasses til at måle invasive reaktioner på andre vækstfaktorer, som f.eks epitelial vækstfaktor (EGF) eller hepatocyt vækstfaktor (HGF).

I vores analyser basal og TGF-β-induceret invasion blev stærkt hæmmet af behandling med SB-431542, en hæmmer af type I receptor for TGF-β. Dette er et bevis på princippet om, at kemikalie-hæmmere kan anvendes i denne analyse. Andre kemiske inhibitorer, såsom MMP-hæmmere, er også blevet brugt med succes i koncentrationertioner anbefales af producenten til monolag cellekultur.

Efter mestre denne teknik, kan man afprøve effekten af ​​kemiske inhibitorer, Knockdown eller overekspression af gener på invasion. Desuden ved at opskalere den analysen til en 24 godt format, kan man isolere RNA ved hjælp af en phenol-chloroform-baserede metode (f.eks Trizol ® eller Tripure) efterfulgt af en silica-kolonne baseret oprydning. Dette RNA kan anvendes til kvantitativ real-time PCR.

Vores klumpformet invasion assay ligner in vivo-processen mere indgående end 2D invasion modeller, fordi celler i spheroids er i forskellige metaboliske stater og interagere i mere naturlig måde med deres omgivelser ^10. Vi har udført Propidium Iodid og Fluorescein diacetat farvning for at tjekke for døde og levende celler efter invasionen analysen og observerede, at på samme måde som in vivo situationen, cellerne i midten er døde og nekrotisk, mens cellerne på than yderkanten er metabolisk aktive.

Vi brugte type I kollagen snarere end matrigel, fordi flere rapporter har vist, at sammensætningen af ​​ekstracellulære matrix i brystkræft ofte ændres, hvilket resulterer i fibrotisk stiv foci med et højt kollagen jeg indhold. Det er blevet påvist, at en øget kollagen jeg indhold fremmer brystkræft dannelse og invasion ¹⁵ og er forbundet med øget forekomst af metastaser ^16. Mange tumorceller derfor nødt til at invadere gennem et kollagen jeg rigt miljø med henblik på at metastaserer.

Flere 3D-modeller er blevet udviklet gennem de seneste årtier. Celler kan enten være fuldstændig indlejret i en matrix eller placeres på toppen af en matrix eller et polymert stillads ^17,18. I en 3D-model udviklet af Bissell og medarbejdere, blev celler dyrket i en rekonstitueret basalmembranen (RBM) matrix. Denne model giver en hurtig analyse at skelne mellem normal og malignbrystkirtler epitel, men fokuserer på cellemorfologi ^19,20. Morfogenese og organisering af de forskellige MCF10A cellelinjer omvendt korreleret til malignitet ^21,22. I andre 3D-modeller flercellede spheroids viste den samme modstand mod cytostatika som deres forældre cellelinie in vivo, mens celler i monolag undladt at gøre det ^11. Også 3D-kulturer af MCF10A cellelinier er blevet brugt til at vurdere følsomhed over for kinase hæmmere ^23. Vores klumpformet model supplerer disse analyser ved specifikt at fokusere på invasion.