JoVE   
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Biology

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Neuroscience

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Immunology and Infection

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Clinical and Translational Medicine

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Bioengineering

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Applied Physics

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Chemistry

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Behavior

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Environment

|   

JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms I

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms II

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Automatic Translation

This translation into Hindi was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Clinical and Translational Medicine

और कैंसर में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) की जांच उत्पादन

1, 1

1Center for Cell and Gene Therapy, Baylor College of Medicine

Article
    Downloads Comments Metrics

    You must be subscribed to JoVE to access this content.

    This article is a part of   JoVE Clinical and Translational Medicine. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

    Recommend JoVE to Your Librarian

    Current Access Through Your IP Address

    You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

    IP: 54.198.138.221, User IP: 54.198.138.221, User IP Hex: 918981341

    Current Access Through Your Registered Email Address

    You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

     

    Summary

    यहाँ हम साधारण कोशिकाओं में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों की उपस्थिति के लिए परीक्षण और मूल्यांकन के तरीकों का प्रस्ताव है.

    Date Published: 11/21/2011, Issue 57; doi: 10.3791/3357

    Cite this Article

    Wu, D., Yotnda, P. Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers. J. Vis. Exp. (57), e3357, doi:10.3791/3357 (2011).

    Abstract

    प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों अणुओं की एक संख्या शामिल है कि नुकसान डीएनए और आरएनए और प्रोटीन और लिपिड (लिपिड peroxydation) oxidize. इन प्रतिक्रियाशील अणु एक ऑक्सीजन होते हैं और एच 2 2 हे (हाइड्रोजन पेरोक्साइड), सं (नाइट्रिक ऑक्साइड), 2 हे शामिल हैं - (ऑक्साइड आयनों), peroxynitrite (ONOO -), hydrochlorous एसिड (HOCl), और हाइड्रॉक्सिल कट्टरपंथी (OH - ) .

    Oxidative प्रजातियों न केवल रोग स्थितियों (कैंसर, reperfusion / इस्कीमिक, neurologic और हृदय विकृतियों, संक्रामक रोगों, भड़काऊ रोगों 1, autoimmune रोग 2, आदि ...) के तहत, लेकिन यह भी 3 सेलुलर चयापचय के रूप में शारीरिक (गैर रोग) स्थितियों के दौरान उत्पादित कर रहे हैं 4,. दरअसल, ROS कई सेलुलर संकेत रास्ते में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने (प्रसार, सेल सक्रियण 5, 6, 7 प्रवास आदि.). ROS हानिकारक हो सकता है (यह तब के रूप में संदर्भित किया जाता है"Oxidative और nitrosative तनाव") जब intracellular डिब्बों और कोशिकाओं में उच्च मात्रा में उत्पादन आम तौर पर superoxide dismutase (वतन) और catalase (कैट), glutathione peroxidase (GPX) और glutathione (GSH) कि रक्षा जैसे antioxidants upregulating ROS जवाब उन्हें हानिरहित अणुओं (यानी पानी) के लिए खतरनाक मुक्त कण में कनवर्ट करके. विटामिन सी और ई भी ROS मैला ढोने वालों (एंटीऑक्सीडेंट) के रूप में वर्णित किया गया है है.

    मुक्त कण को कम 3 मात्रा में फायदेमंद होते हैं . बृहतभक्षककोशिका और neutrophils की मध्यस्थता प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया उत्पादन और कोई रिहाई, जो वायरस, रोगज़नक़ों और ट्यूमर 8 प्रसार रोकता शामिल है. सं भी अन्य ROS के साथ प्रतिक्रिया करता है और इस प्रकार, यह भी एक detoxifier (ROS मेहतर) के रूप में एक भूमिका है. अंत में जहाजों पर सं कृत्यों के लिए रक्त का प्रवाह है जो लंबे समय तक व्यायाम 9, 10 को पेशी के अनुकूलन के लिए महत्वपूर्ण है को विनियमित. कई प्रकाशनों को भी दिखा दिया है कि ROS इंसुलिन sens में शामिल कर रहे हैंitivity 11, 12.

    कई तरीकों ROS उत्पादन का मूल्यांकन उपलब्ध हैं. इस अनुच्छेद में हम कई सरल, तेज, और सस्ती assays का प्रस्ताव, इन assays कई प्रकाशनों के द्वारा किया गया पुष्टि की है और नियमित स्तनधारी कोशिकाओं में ROS या इसके प्रभाव का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया. जबकि इन assays के कुछ कई ROS का पता लगाने, दूसरों को केवल एक ही ROS का पता लगाने.

    Protocol

    1. ROS की जांच carboxy - एच 2 DCFDA का उपयोग

    Carboxy - एच 2 DCFDA गैर फ्लोरोसेंट है लेकिन ROS, जब इस अभिकर्मक ऑक्सीकरण हो जाता है की उपस्थिति में, यह हरे रंग का फ्लोरोसेंट हो जाता है.

    1. तुरंत उपयोग करने के लिए पहले, बाँझ (DMSO) dimethylsulfoxide या 100% इथेनॉल में carboxy - एच 2 DCFDA की एक ताजा स्टॉक समाधान तैयार है . अपने डाई के कई / पिघलना फ्रीज चक्र से बचें.
    2. HEPES के साथ कोशिकाओं को धो नमक समाधान (HBSS) buffered या खारा (पीबीएस) के मूल माध्यम से निशान हटाने के लिए फॉस्फेट बफर.
    3. डाई के साथ कोशिकाओं (और नियंत्रण डाई, cf नोट अनुभाग) लोड. इस परख में हम Jurkat, एक मानव लेकिमिया सेल लाइन का इस्तेमाल किया. कम सीरम (2%) के साथ नियमित रूप से संस्कृति के माध्यम में एक 1μM के अंतिम एकाग्रता में carboxy - एच 2 DCFDA का प्रयोग करें.
    4. अंधेरे में 30 मिनट के लिए संस्कृतियों एक पारंपरिक मशीन (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) में सेते हैं. सभी अप्रयुक्त डाई समाधान त्यागें.
    5. Carboxy निकालेंएच 2 DCFDA मध्यम युक्त और HBSS या पीबीएस के साथ दो बार धोने . इस कदम आगे से, प्रकाश से अपने कोशिकाओं की रक्षा.
    6. ताजा carboxy - एच 2 DCFDA लोड कोशिकाओं के लिए अपने पसंद की दवा युक्त मध्यम जोड़ें सेते हैं और के रूप में वांछित . इस उदाहरण के लिए हम 1 घंटे के लिए एच 2 2 हे (0.03%) का उपयोग करें.
    7. तुरंत प्रवाह cytometry द्वारा FL1 चैनल (हरी प्रतिदीप्ति), या प्रतिदीप्ति प्लेट पाठक के द्वारा, या प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा का उपयोग कर अपनी कोशिकाओं का विश्लेषण करके ROS का आकलन करें. प्रतिदीप्ति उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य है कि हरी प्रतिदीप्ति के लिए उपयुक्त हैं का उपयोग करके पता लगाया जा सकता है.

    नोट: नियंत्रण carboxy एच 2 DCFDA लोड अनुपचारित कोशिकाओं और बेदाग अनुपचारित कोशिकाओं को शामिल करना चाहिए. Carboxy - एच 2 DCFDA peroxides का पता लगाने के लिए जाना जाता है लेकिन यह भी अन्य ROS द्वारा ऑक्सीकरण किया जा सकता है है. यह अभिकर्मक भी अन्य तरीकों से संशोधित किया जा सकता है, जैसे 5 ऑक्सीकरण असंवेदनशील नियंत्रण डाई - (और 6) carboxy-2, '7'dichlorofluorescein diacetate (carboxy DCFDA) इसलिए परीक्षण में शामिल किया जाना चाहिए.

    2. नाइट्रिक ऑक्साइड उत्पादन (सं) के मापन

    आप Sulfanilamide और एन 1 napthylethylenediamine dihydrochloride समाधान (NED से), और नाइट्राइट मानक की आवश्यकता होगी. यह परख Griess परख कहा जाता है.

    NED से समाधान: sulfanilamide के एक 1% समाधान में 5% फॉस्फोरिक एसिड पतला बनाओ: N-1-napthylethylenediamine बाँझ water.Sulfanilamide समाधान में पतला dihydrochloride के एक 0.1% समाधान करें. नाइट्राट मानक: 100μM के लिए बाँझ माध्यम 0.1M मानक शेयर सोडियम नाइट्राइट पतला करने के लिए, एक ही माध्यम में एक सीरियल कमजोर पड़ने करना.

    संग्रहण शर्तें: स्टोर कमरे के तापमान पर निर्माता द्वारा निर्देशित के रूप में रसायनों. जब पुनर्गठन, NED से और Sulfanilamide समाधान के तुरंत बाद 4 में उपयोग ° सी संग्रहीत की जाती हैं अंधेरे में, और 3 महीने की एक अधिकतम के लिए.

    1. एक 96 अच्छी तरह से थाली में संस्कृति कोशिकाओं,प्रत्येक शर्त के लिए उपयोग triplicates है, और अपने प्रयोगों के लिए अनुसार उचित नियंत्रण शामिल हैं.
    2. कोशिकाओं का इलाज करने के लिए सं उत्पादन को प्रेरित. हमारे प्रयोग में हम lipopolysaccharide (LPS) (100 एनजी / मिली) और पुनः संयोजक आईएल-4 का उपयोग करने के लिए हमारी कोशिकाओं का इलाज. इस प्रोटोकॉल में, हम रॉ 264.7, एक माउस बृहतभक्षककोशिका सेल लाइन (माउस leukaemic monocyte बृहतभक्षककोशिका सेल लाइन) का इस्तेमाल किया.
    3. परख के दिन पर, कमरे के तापमान पर दोनों अभिकर्मकों लाने.
    4. अपनी थाली को स्पिन करने के लिए, सेल supernatants इकट्ठा करने और एक नया 96 अच्छी तरह से थाली 50μl हस्तांतरण. अपने मानक स्टॉक समाधान के कमजोर पड़ने कुओं को सीमित करने के लिए एक मानक वक्र बनाने की तैयारी.
    5. Sulfanilamide प्रत्येक नमूना और अच्छी तरह से नियंत्रण करने के लिए समाधान के 50μl जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से.
    6. अंधेरे में 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
    7. एन 1 napthylethylenediamine dihydrochloride प्रत्येक नमूना और अच्छी तरह से नियंत्रण करने के लिए समाधान के 50μl जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से.
    8. अंधेरे में 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
    9. Absorba उपायतुरंत तरंगदैर्य की 520nm और 550nm के बीच फिल्टर के साथ एक प्लेट रीडर का उपयोग कर nce.

    यदि आप अलग अलग / प्लेट डिश आकार का उपयोग, प्रत्येक समाधान और नमूना की सतह पर तैरनेवाला के लिए 1/1/1 मात्रा का उपयोग करें.

    एक बैंगनी रंग सकारात्मक कुओं में दिखाई देगा. मानक के साथ प्राप्त परिणाम में मदद मिलेगी आप अपने समाधान की स्थिरता की जाँच.

    3. ROS कार्रवाई की जांच: ऑक्सीकरण प्रोटीन

    ROS के उत्पादन की पहचान के लिए एक अलग विधि प्रोटीन का पता लगाने के ऑक्सीकरण द्वारा अंत परिणाम पर लग रहा है. दरअसल, आरओएस को संशोधित glutathione, एक एंटीऑक्सिडेंट है कि ज्यादातर कोशिकाओं में व्यक्त किया है और ROS के खिलाफ एक सुरक्षात्मक भूमिका निभाता है. ROS, अपने सिस्टीन के sulfhydryl (thiol) समूह डाइसल्फ़ाइड पुल के माध्यम से एक दूसरे glutathione से जुड़े में कम glutathione (GSH) परिणाम के संशोधन द्वारा ऑक्सीकरण के बाद. यह एक dimerized प्रोटीन के गठन की ओर जाता है है (ऑक्सीकरण प्रोटीन GSSG). GSH एंजाइम glutathione रिडक्टेस द्वारा GSSG के संशोधन के माध्यम से बहाल किया जा सकता है. GSSG / GSH अनुपात में वृद्धि oxidative तनाव को दर्शाता है. निम्नलिखित परख का पता लगाने और इन ऑक्सीकरण प्रोटीन की मात्रा का ठहराव के आधार पर है. इस विधि विशिष्ट ROS के लिए चयनात्मक नहीं है, बल्कि कोई प्रभाव का पता लगाता है, एच 2 2 हे, हे 2 - और अन्य ROS. यहाँ हम (GSSG) ऑक्सीकरण और कम glutathione (GSH) bioluminescent संकेतों का उपयोग कर की कुल राशि को मापने.

    1. सामान्य रूप से एक 96 अच्छी तरह से थाली (/ सफेद पारदर्शी, फ्लैट नीचे) में अपने कोशिकाओं के बीज. हमारी प्रयोग के लिए, हम 1x10 पक्षपाती कच्चे 264.7 और A549 कोशिकाओं और निलंबन Jurkat कोशिकाओं के लिए 4 कोशिकाओं के प्रति में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया. अपनी कोशिकाओं के आकार के आधार पर इन नंबरों को समायोजित किया जा सकता है. हम थाली पक्षपाती दिन कोशिकाओं के लिए सुझाव है कि पहले परीक्षण उन्हें थाली करने के लिए संलग्न करने के लिए अनुमति देने के लिए. पर्याप्त कुओं के लिए "मध्यम केवल" के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ऑक्सीकरण और कम प्रोटीन का पता लगाने के लिए तैयार किया जाना चाहिए औरनियंत्रण के रूप में अनुपचारित कोशिकाओं. सभी शर्तों के लिए प्रयोग करें triplicates.
    2. आवश्यक समय के लिए अपनी दवा के साथ अपने कोशिकाओं को समझो. यहाँ हम एच 2 2 हे (पर क्रमश: 5mm और 2.5mm) के साथ Jurkat कोशिकाओं और 1 के लिए A549 कोशिकाओं का इलाज किया. कच्चे 264.7 कोशिकाओं LPS के 200ng/ml साथ 16 एच. के लिए इलाज किया गया इस ऊष्मायन समय के दौरान, कमरे के तापमान (आर टी) के लिए अपने सभी अभिकर्मकों लाने. परीक्षण प्रदर्शन से पहले 30 मिनट से अधिक नहीं सभी अभिकर्मकों बनाओ. नीचे दी गई तालिका में अच्छी तरह से प्रति अभिकर्मकों के संस्करणों से पता चलता है. जब संभव हो, यह महत्वपूर्ण है कि परीक्षण के साथ आगे बढ़ने से पहले कम करने एजेंट युक्त मीडिया को हटाने.
    पक्षपाती कोशिकाओं सस्पेंशन कोशिकाओं
    कुल ग्लू lysis ऑक्सीकरण हो जाता है ग्लू lysis कुल ग्लू lysis ऑक्सीकरण हो जाता है ग्लू lysis
    NEM, 25mm कोई नहीं 0.5μl कोई नहीं 0.5μl
    Luciferin-NT 1 μl 1 μl 1 μl 1 μl
    निष्क्रिय lysis बफर 5X 10μl 10μl 10μl 10μl
    आसुत जल 39.0μl 38.5μl 14μl 13.5μl
    अंतिम मात्रा प्रति अच्छी तरह से 50μl 50μl 25μl 25μl
    1. पक्षपाती कोशिकाओं के साथ कुओं से मध्यम निकालें. निलंबन कोशिकाओं के साथ कुओं में मध्यम निकालने मत करो.
    2. इसी कुओं कम glutathione lysis अभिकर्मक या ऑक्सीकरण glutathione lysis अभिकर्मक और आरटी पर 5 मिनट के लिए हिला जोड़ें.
    3. Luciferin पीढ़ी अभिकर्मक और incubat जोड़ेंआरटी पर 30 मिनट के लिए ए.
    4. Luciferin पता लगाने अभिकर्मक जोड़ें और आरटी पर 15 मिनट के लिए सेते हैं.
    5. 0.25-1 प्रति अच्छी तरह से दूसरी प्लेट पाठक luminometer का उपयोग कर के एकीकरण के समय में bioluminescent संकेत पढ़ें.
    पक्षपाती कोशिकाओं सस्पेंशन कोशिकाओं
    सेल संख्या प्रति अच्छी तरह से 1x10 4 1x10 4
    अच्छी तरह से दवा + प्रति सेल निलंबन 100 μl, 3.4 पहले हटा दिया जाना 25μl हटाया नहीं हो
    घटी Glutathione lysis अभिकर्मक 50 μl 25μl
    ऑक्सीकरण हो जाता है Glutathione lysis अभिकर्मक 50 μl 25μl
    Luciferin पीढ़ी अभिकर्मक 50 μl 50 μl
    Luciferin जांच अभिकर्मक 100 μl 100 μl

    4. प्रतिनिधि परिणाम:

    चित्रा 1
    चित्रा 1 ROS के जांच डाई carboxy - H2DCFDA का उपयोग . Jurkat कोशिकाओं (मानव लेकिमिया सेल लाइन) एच 2 2 हे के साथ इलाज गैर इलाज कोशिकाओं की तुलना में थे . ROS carboxy - एच 2 DCFDA के संशोधन कि हरी fluoresces के रूप में प्रवाह cytometry, 2 एच में फ्लोरोसेंट चोटी हे 2 इलाज कोशिकाओं नियंत्रण में चोटियों (2 एच ओ 2 इलाज किया कोशिकाओं ऑक्सीकरण असंवेदनशील डाई और गैर के साथ दाग की तुलना में बदलाव से पता चला लाती इलाज के साथ दाग carboxy - एच 2 DCFDA कोशिकाओं). परिणाम इलाज कोशिकाओं में ROS की उपस्थिति की पुष्टि करें.

    चित्रा 2
    चित्रा 2 डिटेक्शन ओच Griess अभिकर्मकों का उपयोग सं . रॉ 264.7 कोशिकाओं (माउस बृहतभक्षककोशिका) LPS और आईएल-4 के साथ इलाज किया गया. सं उत्पादन में एक महत्वपूर्ण वृद्धि हुई इलाज अनुपचारित कोशिकाओं को नियंत्रित करने के लिए की तुलना में कोशिकाओं में पाया गया.

    सेल लाइनों गैर इलाज इलाज
    264.7 कच्चे 13.0 8.3
    A549 21.6 10.5
    Jurkat 5.2 2.8

    टेबल ROS के एक जांच प्रोटीन के ऑक्सीकरण मध्यस्थता. रॉ 264.7 कोशिकाओं LPS Jurkat, और A549 के साथ इलाज किया गया कोशिकाओं (मानव फेफड़े के कैंसर) एच 2 2 हे के साथ इलाज किया गया. परिणाम के रूप में अनुपात (GSH) कम / glutathione (GSSG) ऑक्सीकरण व्यक्त कर रहे हैं. Glutathione (GSH) / (GSSG) के लोअर अनुपात इलाज किया कोशिकाओं की तुलना में पाया गयाअनुपचारित नियंत्रण कक्ष, खुलासा है कि प्रोटीन और इलाज कोशिकाओं में ऑक्सीकरण थे.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    भड़काऊ रोगों, कैंसर, ischemia reperfusion /, और भी विकिरण या रसायन चिकित्सा जैसे उपचार के रूप में ऐसे कई रोग स्थितियों (यानी cisplatin) ROS overproduction प्रेरित. इस प्रकार, पता लगाने और ROS स्तर को मापने के कई बुनियादी पूर्व नैदानिक ​​और नैदानिक ​​अध्ययन में महत्वपूर्ण है. हालांकि, ROS बहुत ही कम आधा जीवन है और पता लगाने के लिए जटिल हो सकता है है. यहाँ, हम साधारण परीक्षण है कि नियमित तौर पर इस्तेमाल किया जाता है और स्तनधारी कोशिकाओं में मुफ्त कट्टरपंथी उत्पादन का पता लगाने के के लिए व्यापक रूप से स्वीकार किए जाते हैं प्रस्ताव है.

    जांच रंगों का उपयोग प्रोटोकॉल experimenter के विभिन्न व्यापक रूप से उपलब्ध तरीकों (जैसे माइक्रोस्कोपी, प्रवाह cytometry, प्लेट रीडर आदि.) का उपयोग करने के लिए ROS के उपस्थिति का आकलन करने की अनुमति देते हैं. प्रवाह cytometry और माइक्रोस्कोपी सेल व्यवहार्यता और अशक्त, कम है, और उच्च ROS उत्पादन की कोशिकाओं के प्रतिशत पर जानकारी प्रदान करते हैं. माइक्रोस्कोपी सेल morphology और कोशिका आसंजन पर ROS के प्रभाव पर भी जानकारी प्रदान करता है है. प्लेट आर का उपयोग जांचeaders ज्यादातर मात्रात्मक जानकारी की अनुमति देता है. Griess द्वारा सं पता लगाने मात्रात्मक है, लेकिन आकृति या अध्ययन कोशिकाओं के आसंजन के बारे में कोई जानकारी प्रदान नहीं करता है. सं पता लगाने माउस कोशिकाओं में अपेक्षाकृत सरल है. हालांकि, की कम मात्रा सं मानव नमूनों में पाए जाते हैं, इसलिए यह महत्वपूर्ण है पता लगाने की प्रक्रिया के हर कदम पर और भी अधिक सावधान रहना करने के लिए और नियंत्रण शामिल है. प्रोटीन ऑक्सीकरण की जांच अध्ययन कोशिकाओं द्वारा उत्पादित सभी ROS के कुल प्रभाव की जांच, यहाँ प्राप्त संकेत की तीव्रता उत्पादन ROS की राशि का प्रतिनिधित्व करता है. एच 2 हे 2 प्रभाव का पता लगाने के रूप में यह बहुत तेजी से catalase के द्वारा समाप्त हो रहा है पेचीदा मामला है. GSH GSSG-Glo परख करने के लिए सीधे GSSG पता लगाने की क्षमता है, इस परख ऑक्सीकरण के मुद्दों को कम है क्योंकि यह सीधे नमूनों पर कोई निकासी नहीं के साथ किया जाता है, और कम कोशिकाओं के साथ. GSH / GSSG रीडिंग, HBSS समाधान या glutathione मुक्त मीडिया (जैसे DMEM के रूप में) पसंद चाहिए में सुधार;सीरम मुक्त मीडिया के साथ काम आगे पढ़ने में सुधार होगा. यह महत्वपूर्ण है को ध्यान में रखना है कि कोशिकाओं की प्रकृति (ऊतक प्रकार, सामान्य बनाम वैकृत ऊतकों), monolayer सेल संस्कृति के confluency, सक्रियण और तनाव की स्थिति, उम्र (अंश की संख्या), के रूप में अच्छी तरह सहित कई कारकों के रूप में अपनी कोशिकाओं के प्रसार की दर ROS के उत्पादन पर असर पड़ेगा.

    अधिकांश ROS पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया अभिकर्मकों प्रकाश, ऑक्सीजन और तापमान में परिवर्तन करने के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, यह इसलिए महत्वपूर्ण है कि experimenter सभी अभिकर्मकों और नमूनों का परीक्षण करने के लिए, हो सकता है और काम जल्दी प्रदर्शन के भंडारण और उपयोग के लिए विशेष देखभाल का उपयोग करता है.

    प्रत्येक रंगों का उपयोग कर प्रयोग उत्पादन का पता लगाने / ROS के लिए नियंत्रण के रूप में (कोई दवा) अनुपचारित, उतार (कोई डाई) के रूप में समुचित नियंत्रण, इलाज लोड और अनलोड इलाज किया कोशिकाओं को शामिल करना चाहिए. Phenol के लाल के बिना मध्यम का प्रयोग फ्लोरोसेंट रंजक के साथ हस्तक्षेप को कम करने (यानी carbox जाएगाYH 2 DCFDA, मुख्यमंत्री - एच 2 DCFDA). इन प्रयोगों के शुरू करने से पहले, यह महत्वपूर्ण है के लिए अपनी दवा / उपचार और प्राकृतिक अपने अनुपचारित कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति की जांच करने के लिए इस प्रोटोकॉल के लिए अनुकूल है. फ्लोरोसेंट रंजक के साथ अपने कोशिकाओं लोड हो रहा है से पहले या (/ मिनट घंटे बनाम कई दिनों) की अवधि और उपचार (दवाओं ischemia / reperfusion की, यांत्रिक तनाव) के प्रकार है कि कोशिकाओं को लागू किया जाएगा के आधार पर उपचार के बाद किया जाना चाहिए. डाई की एकाग्रता का पता लगाने के लिए आरओएस सेल प्रकार पर और कोशिकाओं की सक्रियता की स्थिति पर निर्भर करता है भिन्न हो सकते हैं की आवश्यकता है. हमारी सलाह के लिए 10μM और 100μM की डाई सांद्रता के साथ शुरू होता है, और धुंधला की विषाक्तता और प्रभावकारिता के लिए जाँच, और तब एकाग्रता कम करने के लिए सबसे अच्छा अपने प्रयोगों के लिए उपयोग करने के लिए खुराक निर्धारित.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    हम इस प्रकाशन के लिए Promega का समर्थन प्राप्त है.

    Acknowledgements

    यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (CA142664) द्वारा समर्थित किया गया.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    5-(and-6)-carboxy-2’,7’-dichlorofluorescein diacetate (carboxy-DCFDA) Molecular Probes, Life Technologies C369 control
    carboxy-H2DCFDA Molecular Probes, Life Technologies C400
    Sulfanilamide Sigma-Aldrich S9251-100G
    N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride Sigma-Aldrich N9125-10G
    Nitrite standard Sigma-Aldrich 237213-100G
    GSH/GSSG-Glo Assay Promega Corp. V6612 To quantify oxidized, reduced or oxidized/reduced glutathione

    References

    1. Guzik, T. J., Korbut, R., & Adamek-Guzik, T. Nitric oxide and superoxide in inflammation and immune regulation. J Physiol Pharmacol. 54, 469-487 (2003).
    2. Perl, A., Gergely, P., Jr., & Banki, K. Mitochondrial dysfunction in T cells of patients with systemic lupus erythematosus. Int Rev Immunol. 23, 293-313 (2004).
    3. Valko, M., Leibfritz, D., Moncol, J., Cronin, M. T., Mazur, M., & Telser, J. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Int J Biochem Cell Biol. 39, 44-84 (2007).
    4. Droge, W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol Rev. 82, 47-95 (2002).
    5. Nakamura, K., Yube, K., Miyatake, A., Cambier, J. C., & Hirashima, M. Involvement of CD4 D3-D4 membrane proximal extracellular domain for the inhibitory effect of oxidative stress on activation-induced CD4 down-regulation and its possible role for T cell activation. Mol Immunol. 39, 909-921 (2003).
    6. Los, M., Droge, W., Stricker, K., Baeuerle, P. A., & Schulze-Osthoff, K. Hydrogen peroxide as a potent activator of T lymphocyte functions. Eur J Immunol. 25, 159-165 (1995).
    7. Deem, T. L., & Cook-Mills, J. M. Vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM-1) activation of endothelial cell matrix metalloproteinases: role of reactive oxygen species. Blood. 104, 2385-2393 (2004).
    8. Pacher, P., Beckman, J. S., & Liaudet, L. Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease. Physiol Rev. 87, 315-424 (2007).
    9. Griendling, K. K., Sorescu, D., Lassegue, B., & Ushio-Fukai, M. Modulation of protein kinase activity and gene expression by reactive oxygen species and their role in vascular physiology and pathophysiology. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 2175-2183 (2000).
    10. Powers, S. K., Duarte, J., Kavazis, A. N., & Talbert, E. E. Reactive oxygen species are signalling molecules for skeletal muscle adaptation. Exp Physiol. 95, 1-9.
    11. Loh, K., Deng, H., Fukushima, A., Cai, X., Boivin, B., Galic, S., Bruce, C., Shields, B. J., Skiba, B., Ooms, L. M., Stepto, N., Wu, B., Mitchell, C. A., Tonks, N. K., Watt, M. J., Febbraio, M. A., Crack, P. J., Andrikopoulos, S., & Tiganis, T. Reactive oxygen species enhance insulin sensitivity. Cell Metab. 10, 260-272 (2009).
    12. Goldstein, B. J., Mahadev, K., & Wu, X. Redox paradox: insulin action is facilitated by insulin-stimulated reactive oxygen species with multiple potential signaling targets. Diabetes. 54, 311-321 (2005).

    Comments

    0 Comments

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter