En protokol til Afsløring og latrintømning Gas-fase frie radikaler i Mainstream cigaretrøg

Yu, L. X., Dzikovski, B. G., Freed, J. H. A Protocol for Detecting and Scavenging Gas-phase Free Radicals in Mainstream Cigarette Smoke. J. Vis. Exp. (59), e3406, doi:10.3791/3406 (2012).

Cigaretrygning er forbundet med menneskelige kræftformer. Det er blevet rapporteret, at de fleste af lungekræft dødsfald skyldes cigaretrygning ^5,6,7,12. Selvom tobak tjære og tilknyttede produkter i partikel fase af cigaretrøg er væsentlige årsager til kræftfremkaldende og mutagene sygdomme, cigaretrøg indeholder betydelige mængder af frie radikaler, der også betragtes som en vigtig gruppe af kræftfremkaldende stoffer ^9,10. Frie radikaler angriber cellens bestanddele ved at ødelægge proteiners struktur, lipider og DNA-sekvenser og øge risikoen for at udvikle forskellige typer af kræft. Inhaleret radikaler producere addukter, der bidrager til mange af de negative sundhedsmæssige virkninger af tobaksrøg i lungerne ^3. Undersøgelser er blevet gennemført for at reducere frie radikaler i cigaretrøg at mindske risici ved rygning-induceret skade. Det er blevet rapporteret, at hæmoglobin og hæm-holdige forbindelser delvis kan scavenge nitrogenoxid, reaktivoxidanter og kræftfremkaldende flygtige nitrosocompounds af cigaretrøg ^4. A 'bio-filter "bestod af hæmoglobin og aktivt kul blev brugt til at scavenge de frie radikaler og for at fjerne op til 90% af de frie radikaler fra cigaretrøg ^14. Men på grund af cost-ineffektivitet, har det ikke været held kommercialiseres. En anden undersøgelse viste gode latrintømning effektivitet shikonin, en komponent af kinesisk urtemedicin ^8. I nærværende undersøgelse, rapport, vi har en protokol for at indføre fælles naturlig antioxidant ekstrakter i cigaret filter til skylningssystem gasfasen frie radikaler i cigaretrøg og måling af scavenge effekt på gasfasen frie radikaler i mainstream cigaretrøg (MCS) ved hjælp af spin-fældefangst Elektron spin resonans (ESR) spektroskopi ^1,2,14. Vi viste høj latrintømning kapacitet af lycopen og vindruekerneekstrakt, der kunne pege på deres fremtidige anvendelse i cigaretfiltre. En vigtig fordel af disse fordelepective skraldemanden er, at de kan fås i store mængder fra biprodukter af tomat eller vinindustri henholdsvis ^11,13

1. Materialer

Alle opløsningsmidler, der anvendes i dette arbejde blev reagens klasse. Spin fælde, herunder N-tert-butyl-α-phenylnitrone (PBN), og standarden spin-label 2,2,6,6-tetramethyl-1-piperinyoxyl (TEMPO) stammer fra Sigma og blev brugt som leveret. Anlægget antioxidanter blev indhentet kommercielt fra Swanson, Inc. USA.

2. Udarbejdelse af cigaretrøg og analyse af frie radikaler

1. At introducere antioxidanter ind i filteret, blev de antioxidanter Pycnogenol og vindruekerneekstrakt first opløst i 95% ethanol, mens lycopen blev opløst i acetone. Opløsningsmidlet mængder var forskellige afhængigt af antioxidant opløselighed.
2. Mængden af ​​antioxidanter på 0,4 mg / filter blev brugt. De blev derefter belagt med 10 mg af aktivt kul. Til dette formål aktivt kul blev omrørt for ~ 12 timer med antioxidant løsning i anaerobe forhold, filtreret og tørret under vakuum. Antioxidanter blev derefter indført i konventionelle acetat filter (CA filter). Til dette formål blev filtret skåret i to stykker. Den coatede planten antioxidanter blev indsat mellem to stykker af filter og omviklet med et stykke tape til at danne et filter - antioxidant-filter sandwich (Fig. 1A). Dette kombineret filter blev efterfølgende tilknyttet cigaret stænger med indhold af tobak. Kontrollen filter blev foretaget på samme måde som antioxidant filter undtagen ingen antioxidant blev tilføjet.
3. Forud for rygning simulation, blev de forsknings-cigaretter pakket ud og holdes i en konstant luftfugtighed (20 ° C, 60% relativ fugtighed) ved hjælp af en mættet NaBr løsning i minimum 2 dage.
4. Rygning simulation til rutinemæssig analyse blev udført ved omgivende temperatur ved hjælp af en enkelt havn rygning anordning, der, som vist i Fig.1, består af en vand-emhætte eller Gast DOA-P104-BN Vacuum Pumpe / Air Kompressor (Benton Harbor, Mich) tilsluttet til spin-trappingsamling via et T-kryds med den ene ende åben. Pust blev udført ved at sætte den åbne ende der forblev åben mellem pust. Gassen flow var kontrolleret af flowmåler og indstilles på ~ 2,2 SCFH = 17,5 mL / s ved at justere en ventil placeret mellem pumpen og ventilen.
5. Forskningen cigaretterne blev røget under forudsætning af pust volumen på 35 ml til en varighed på 2 sekunder gentages hver 60 sekunder, svarende til ^1. Rygning simulation til kvantitativ estimering af gas-fase frie radikaler blev udført i samarbejde med spin fældefangst systemet som vist i Fig. 1.
6. Ti intense pust (35 ml / pust) blev taget for hver cigaret. Gas-fase frie radikaler blev indsamlet ved at sende den MCS gennem et Cambridge filter pad og derefter skal føres ind i spin-trapping-løsning (0,05 M PBN i benzen, 2,0 mL).
7. Efter det sidste pust, var det boblede fældefangst løsningen justeres til sin oprindelige volumen (2,0 ml) med samme benzen. En alikvot blev overført til en ~ 250 mm lang, 3 mm ID glasrør lukket i den ene ende.
8. Den fældefangst Løsningen blev deoxygenated ved hjælp af et frost-pumpe-tø-procedure. Det var frosne under flydende nitrogen, og et vakuum blev anvendt. Så var det tøet under argon atmosfære, så fanget gasbobler at undslippe, og frosset igen. Efter denne cyklus blev gentaget tre gange, røret blev flamme-forseglet under vakuum og som anvendes ved ESR målinger. Dette trin er påkrævet, fordi ilt, som er godt opløseligt i benzen, udvider ESR linjer af organiske radikaler. Iltsvind dramatisk forbedrer signal-støj-forholdet.
9. X-Band ESR spektre blev optaget på en Bruker EMX spektrometer med en frekvens på 9,34 GHz under standardiserede betingelser. Spektrometeret indstillinger, der bruges i de fleste eksperimenter var: midterste felt 3312.5G, scan bredde 80G, modulation amplitude 0,5 g, tidskonstant 82 mikrosekunder, scan tid 40 sek.
10. Spin fælde addukter er relativt stabilt på eksperimentet vilkår, som i nogle tilfælde REQuired 25 ophobninger, der typisk tog ~ 20 min. Men efter 12 timers intensiteten af ​​den ESR signaler i benzen løsning faldet med en faktor på ~ 5.
11. At kvantificere koncentrationen af ​​fældefangst addukt, var dets oprindelige første-afledte ESR spektrum integreret. Den resulterende absorptionsspektrum viser en bred singlet baggrund, sandsynligvis på grund af sod / tjære produkter indeholdt i røgen.
    
    Efter fratrækning af den baggrund adskilt triplet af fældefangst addukt blev integreret en gang (fig. 2).

3. Repræsentative resultater

De fleste af de frie radikaler i brændende cigaret-producerede røg (gasfase) er øjeblikkelige og ustabile. For at overholde disse radikale et spin fælde teknik er ansat. Det fanger gas-fase frie radikaler ved at omdanne dem til et spin addukt, som er mere stabil og kan påvises ved ESR (Fig.1). I nærværende undersøgelse, spin-fælde løsning på 0,05M PBN blev brugt til at indsamle røg gasfase frie radikaler, som er en blanding af ilt-og kulstof-centreret radikaler, som er vanskelige at adskille ^15. I vores tilfælde, men de observerede hyperfine opdele konstanterne a _N = 13.7G og en _H = 1,95 g er meget lig de tilsvarende værdier for fældefangst addukter af alkoxyl frie radikaler (RO.) ^2, hvilket tyder på, at de er de største produktgrupper. Vi viste, at svage ESR signaler og lav reproducerbarhed observeret i vores indledende målinger (fig. 2) blev på grund af fugt i røgen flow. For at løse dette problem, har vi tilføjet en flydende kvælstof (LN2) fælde mellem Cambridge filter og spin fælden løsning. LN ₂ fælde fjernet vand fra MCS flow ved hurtig frysning og opfange det på indersiden af glasrøret. Denne stærkt forbedret ESR signaler og gav mulighed for meget reproducerbare resultater (Fig. 3).

Mængden af ​​fangne ​​frie radikaler blev bestemt vha. etreferenceprøve. For kontrolprøver uden antioxidanter, var den typiske addukt koncentrationen i benzen estimeret ved at sammenligne sin dobbelte integreret spektrum med en dobbelt integreret spektrum for kendte koncentration af TEMPO 1,24 m (Fig.2). Siden den mængde luft passerede gennem hver cigaret under rygning var ~ 350 ml, giver dette et skøn for den frie radikaler koncentrationen i gasfasen af MCS på ~ 7.1X10 ^{-9 m,} og et samlet antal radikaler fanget fra gasfasen af en hel cigaret på ~ 1.5X10 ^15. Et skøn for den samlede mængde af frie radikaler i røgen fra en hel cigaret, herunder både gas og partikler fase, var ~ 10 ¹⁶ frie radikaler ^9.

Forskellige niveauer af latrintømning effekten af ​​plante-antioxidanter på gas-fase frie radikaler i main stream cigaretrøg blev observeret. Deres scavenging satser blev præsenteret i Fig. 4. Lycopen og vindruekerneekstrakt viste de højeste satser, mens lavis sats blev observeret for Pycnogenol (Fig.4).

Figur 1. Et diagram af forbedrede rygning simulering design for indsamling af gas-fase frie radikaler i mainstream cigaretrøg (MCS) ved hjælp af spin-fælde. MCS er tegnet af en vand-emhætte gennem CA filter, så Cambridge filter (gult filter) og ledes gennem en flydende kvælstof fælde for at fjerne H ₂ O. Den gas-fase produkter endelig kom til at spinde fælde og bobles gennem spin fælden løsning. Plant antioxidant blev placeret mellem to stykker af konventionelle acetat filtre (udvidet i cirkel A) knyttet til cigaret til bekæmper frie radikaler i MCS.

Figur 2. En kvantitativ skøn for spin-fældefangst addukt koncentration i benzen kræver trække en bred baggrund signal fra den første integrationl spektrum. Den hyperfine opdele parametre for spin-fældefangst addukt er en _H = 1,95 g, en _N = 13.7G.

Figur 3. Passing gennem LN2 fælde væsentligt forbedrer kvaliteten af ESR signaler opnås ved spin-indfangning af MCS.

Figur 4. Effekt af naturlige antioxidanter på koncentrationen af ​​frie radikaler i MCS. Den relative signal intensiteter er: kontrol - 100%, Pycnogenol - 55%, vindruekerne ekstrakt - 12%, lycopen - 10%.

Et pålideligt skøn over effekten af ​​forskellige frie radikaler skraldemanden i tobaksrøg kræver en reproducerbar teknik til kvantitativ påvisning af frie radikaler. Tidligere ^1, har det vist sig, at små mængder af højere koncentration spin-fælde løsninger i ikke-polære opløsningsmidler, der er mest effektive til at fange frie radikaler fra tobaksrøg. Cigaretrøg indeholder altid vanddamp fra forbrænding af organiske forbindelser og den resterende fugt i tobak, som kan ende op i fældefangst opløsningsmiddel. Denne blanding af vand i PBN spin-fælden løsning væsentligt nedsætter levetiden af ​​spin fældefangst addukter og intensiteten af ​​deres ESR signaler. Fjernelse af denne fugt ved simpel passerer MCS gennem en U-formet rør køles med flydende kvælstof dramatisk forbedret kvaliteten af ​​ESR-spektre i vores eksperimenter, selv om nogle brøkdel af gas-fase radikaler kan også fanget på den frosne overflade.

Brug af thans teknik vi sammenlignede relative effektivitet af forskellige radikale-latrintømning naturlige forbindelser indført i cigaretfiltre. Vi fandt, at lycopen og vindruekerneekstrakt umiddelbart efter indarbejde cigaretfiltre er i stand til at scavenge op til 90% af de frie radikaler fra gasfasen MSC. Sådanne høje scavenging kapacitet rækker disse billige let tilgængelige naturlige forbindelser blandt de mest effektive rapporterede frie radikaler beskyttere som hæmoglobin og shikonine ^8,14. Men i vores eksperimenter cigaretfiltre lastet med studeret naturlige antioxidanter tabt en mærkbar del af deres latrintømning kapacitet efter en uges opbevaring ved stuetemperatur. Løsning af dette problem kan stimulere fremtidige anvendelse af lycopen og vindruekerneekstrakt i kommercielle cigaretfiltre.

Ingen interessekonflikter erklæret.

Dette arbejde blev støttet af National Institute of Health, give Nej NIH / NCRR P41-RR 016.292 (for ACERT).

1. Baum, S.L., Anderson, I.G.M., Baker, R.R, Murphy, D.M., & C.C., Rowlands. Electron spin resonance and spin trap investigation of free radicals in cigarette smoke: development of a quantification procedure. Analytica Chimica. Acta. 481, 1-13 (2003).
2. Bluhm, A.L., Weinstein, J., & Sousa, J.A. Free radicals in tobacco smoke. Nature. 229, 500 (1971).
3. Church, D.F. & Pryor W.A. Free-radical chemistry of cigarette smoke and its toxicological implications. Environ. Health. Perspect. 64, 111-126 (1985).
4. Deliconstantinos, G., Villiotou, V., & Stavrides, J.C. Scavenging effects of hemoglobin and related heme containing compounds on nitric oxide, reactive oxidants and carcinogenic volatile nitrosocompounds of cigarette smoke. a new method for protection against the dangerous cigarette constituents. Anticancer. Res. 14, 2717-2726 (1994).
5. Hecht, S.S. Tobacco smoke carcinogens and lung cancer. Journal of the National Cancer Institute. 91, 1194-1210 (1999).
6. Kodama, M., Kaneko, M., Aida, M., Inoue, F., Nakayama, T., & Akimoto, H. Free radical chemistry of cigarette smoke and its implication in human cancer. Anticancer. Res. 17, 433-437 (1997).
7. Nair, A.K. & Brandt, E.N. Effects of smoking on health care costs. Journal of Oklahoma State Medical Association. 93, 245-250 (2000).
8. Nishizawa, M., Kohno, M., Nishimura, M., Kitagawa, A., & Niwano, Y. Presence of Peroxyradicals in Cigarette Smoke and the Scavenging Effect of Shikonin, a Naphthoquinone Pigment. Chem. Pharm. Bull. 53, 796-799 (2005).
9. Pryor, W.A. Cigarette smoke and the involvement of free radical reactions in chemical carcinogenesis. Br. J. Cancer. 8, 19-23 (1987).
10. Pryor, W.A. Cigarette smoke radicals and the role of free radicals in chemical carcinogenicity. Environ. Health. Perspect. 105, 875-882 (1997).
11. Rozzi, N.I., Singh, R.K., Vierling, R.A., & Watkins, B.A. Supercritical fluid extraction of lycopene from tomato processing byproducts. J. Agric. Food. Chem. 50, 2638-2643 (2002).
12. Shopland, D.R. Tobacco use and its contribution to early cancer mortality with a special emphesis on cigarette smoking. Environmental. Health. Perspectives. 103, 131-142 (1995).
13. Shrikhandle, A.J. Wine products with health benefits. Food Res. Int. 33, 469-474 (2000).
14. Valavanidis, A. & Haralambous, E.A comparative study by electron paramagnetic resonance of free radical species in the mainstream and sidestream smoke of cigarettes with conventional acetate filters and 'bio-filters'. Redox. Rep. 6, 161-171 (2001).
15. Valavanidis, A., Vlachogianni, T., & Fiotakis, K. Tobacco smoke: involvement of reactive oxygen species and stable free radicals in mechanisms of oxidative damage, carcinogenesis and synergistic effects with other respirable particles. International Journal of Environmental Research and Public Health. 6, 445-462 (2009).

4 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.