JoVE   
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Biology

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Neuroscience

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Immunology and Infection

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Clinical and Translational Medicine

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Bioengineering

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Applied Physics

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Chemistry

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Behavior

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Environment

|   

JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms I

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms II

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Essentials of
Neuroscience

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Automatic Translation

This translation into Hebrew was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Neuroscience

דימות ספקטרלי Confocal של קולטנים ניאציניות מתויג fluorescently ב עקום בעכברים עם מינהל ניקוטין כרונית

1, 1

1Department of Biology, University of Victoria

Article
    Downloads Comments Metrics

    You must be subscribed to JoVE to access this content.

    This article is a part of   JoVE Neuroscience. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

    Recommend JoVE to Your Librarian

    Current Access Through Your IP Address

    You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

    IP: 54.89.1.216, User IP: 54.89.1.216, User IP Hex: 911802840

    Current Access Through Your Registered Email Address

    You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

     

    Summary

    פיתחנו שיטה חדשנית של לכימות ניאציניות קולטני אצטילכולין שינויים בתוך אזורים subcellular של תת ספציפיים של נוירונים במערכת העצבים המרכזית כדי להבין טוב יותר את המנגנונים של התמכרות לניקוטין באמצעות שילוב של גישות כולל תיוג חלבון פלואורסצנטי של הקולטן באמצעות עקום בגישה רפאים confocal הדמיה.

    Date Published: 2/10/2012, Issue 60; doi: 10.3791/3516

    Cite this Article

    Renda, A., Nashmi, R. Spectral Confocal Imaging of Fluorescently tagged Nicotinic Receptors in Knock-in Mice with Chronic Nicotine Administration. J. Vis. Exp. (60), e3516, doi:10.3791/3516 (2012).

    Abstract

    ליגנד-מגודרת תעלות יונים במערכת העצבים המרכזית (CNS) הם מעורבים תנאים רבים עם השלכות רפואיות וחברתיות קשות. למשל, התמכרות לניקוטין באמצעות עישון טבק הוא הגורם המוביל למוות בטרם עת ברחבי העולם (ארגון הבריאות העולמי) והיא נגרמת ככל הנראה על ידי שינוי של חלוקת ערוץ יונים במוח 1. חשיפה כרונית לניקוטין בשני מכרסמים ותוצאות בני אדם מספרים מוגברת של קולטני אצטילכולין ניאציניות (nAChRs) ברקמת המוח 1-3. כמו כן, שינויים או את GluN1 GluA1 ערוצי glutamatergic היו מעורבים לעורר רגישות לסמים ממכרים אחרים כגון קוקאין, אמפטמינים ו 4-6 בסמי הרגעה.

    כתוצאה מכך, היכולת למפות ולכמת הפצה ביטוי דפוסים של תעלות יונים מסוימות חשוב ביותר להבנת המנגנונים של התמכרות. מחקר של אזור ספציפי במוח EFfects של תרופות בודדות קידם כניסתו של טכניקות כגון ligands רדיואקטיביים. עם זאת, ברזולוציה מרחבית נמוכה מחייב ליגנד רדיואקטיבי מונע את היכולת לכמת ליגנד-מגודרת תעלות יונים של תת ספציפיים של נוירונים.

    כתבים ניאון מקודדים גנטית, כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ו גרסאות רבות שלה צבע, חוללו מהפכה בתחום הביולוגיה 7. על ידי תיוג גנטית כתב ניאון לחלבון אנדוגני אפשר לדמיין חלבונים in vivo 7-10. אחד היתרונות של fluorescently תיוג חלבונים עם החללית היא חיסול השימוש נוגדנים, אשר יש בעיות של nonspecificity ונגישות חלבון המטרה. השתמשנו באסטרטגיה זו כדי fluorescently nAChRs תווית, אשר אפשרו את לימוד מכלול הקולטן באמצעות פורסטר תהודה העברת אנרגיה (סריג) בתאים בתרבית transfected 11. לאחרונה, השתמשנו knocK-בגישה לעכברים מהנדס עם חלבון פלואורסצנטי צהוב מתויג α4 יחידות משנה nAChR (α4YFP), המאפשר כימות מדויק של vivo הקולטן לשעבר ברזולוציה submicrometer בנוירונים במערכת העצבים המרכזית באמצעות מיקרוסקופיה confocal רפאים 12. ממוקד ניאון עקום של מוטציה משולב לוקוס אנדוגני תחת שליטה של ​​האמרגן המקורית שלו, לייצר רמות נורמליות של ביטוי וויסות של הקולטן בהשוואה קולטנים לא מתויגות בעכברים wildtype. גישה זו דפיקה-in ניתן להרחיב fluorescently לתייג תעלות יונים אחרים ומציע גישה חזקה של הדמיה לכימות קולטני מערכת העצבים המרכזית.

    במאמר זה אנו מתארים מתודולוגיה לכמת שינויים בביטוי nAChR בנוירונים מסוימים במערכת העצבים המרכזית לאחר החשיפה לניקוטין כרונית. השיטות שלנו כוללות מיני האוסמוטי השתלת המשאבה, קיבעון זלוף intracardiac, הדמיה וניתוח של rec ניקוטינית מתויג fluorescentlyeptor יחידות משנה של α4YFP עקום בעכברים (איור 1). יש לנו אופטימיזציה הטכניקה קיבעון למזער autofluorescence מ tissue.We המוח קבועה תאור מפורט של המתודולוגיה שלנו דימות באמצעות מיקרוסקופ confocal רפאים יחד עם אלגוריתם unmixing ליניארי רפאים כדי להחסיר אות autofluoresent כדי להשיג דיוק האות הקרינה α4YFP. לבסוף, אנו מראים תוצאות upregulation ניקוטין הנגרמת כרונית של קולטני α4YFP בנתיב perforant המדיאלי של ההיפוקמפוס.

    Protocol

    1. השתלת משאבה

    1. לפני השתלת המשאבה, למלא ולהכין את Alzet מיני האוסמוטי משאבות (Alzet, דגם 2002, בקופרטינו, ארה"ב) נזהר לא להכניס בועות אוויר. מודל זה של משאבה מיני האוסמוטי מספקת פתרון בשיעור של μl 0.5 / שעה למשך 14 יום. להבטיח תנאים סטריליים. לשקול משאבות ריקה ומלאה. בתום הניסוי (10 ימים לאחר ההשתלה), הנוזל שנותר משאבה ניתן להסיר בעזרת מזרק ומחט ומשקלו לחשב את נפח שאוב.
    2. משאבות עם פתרון שליטה מכילים מלח (0.9% w / v, Teknova, S5819, הוליסטר, ארה"ב). כדי להכין את הפתרון ניקוטין, פתרון 1 M מלאי (-), ניקוטין מימן tartrate מלח (Sigma, חתול # N5260) הוא מדולל מלח (0.9% w / v) לעקר ידי סינון דרך מסנן 0.22 מיקרון מזרק-end. אנחנו מנוהל בעבר הניקוטין על 0.4 ו 2 מ"ג / ק"ג / שעה (כפי שחושב הבסיס ללא ניקוטין) למשך 10 ימים.
    3. הכן שלוש אמבטיות מלוחים (310 ס"מ מלוחים מלא בצלחות פטרי). לאחר משאבת כבר מלא ו כתרים, לשטוף ביסודיות לשאוב באמבטיה כל מלוחים ברציפות כדי להסיר כל עקבות של סמים על המעטפת החיצונית. לטבול מלא משאבות של תמיסת מלח לאחסון עד הניתוח, שמירה על שליטה משאבות הניקוטין מכולות מלוחים נפרדים.
    4. על מנת לעודד התאוששות בריא להפחית את הסיכון לזיהום לאחר ניתוח, יש כלובים נקיים שהוכנו לצורך התאוששות ארוכת טווח.
    5. להתאוששות בטווח הקצר מיד לאחר הניתוח, להכין כלוב ובו כרית חימום מנורת חום.
    6. כדי לבחון את השפעות הניקוטין כרוניות יש לנו 5-6 α4YFP הומוזיגוטים עקום בעכברים (2-3 חודשים) בכל קבוצה (שליטה או ניקוטין). עקום ב α4YFP קו העכבר כבר backcrossed במשך 10 דורות עד זן העכבר C57BL/6J. אנחנו דואגים גיל ומין של כל העכברים זהים לחקר וכי כל הניתוחים מבוצעים באותו יום כדי לצמצם שונות. כדי למנוע Hypothermia כדי העכברים במהלך ואחרי הניתוח, לצייד שולחן כירורגית עם כרית חימום מכוסה וילון ניתוח סטרילי.
    7. להשרות את העכבר α4YFP עקום עם L 3 / חמצן דקות ו 3% isoflurane ואז לשמור הרדמה ב 2.5 L / min חמצן ו 1% isoflurane. אנחנו מעדיפים הרדמה isoflurane כי בסיום הניתוח isoflurane מנקה את המערכת במהירות העכברים מודעים וניידים בתוך 2 דקות ~. החל בטיפות עיניים באופן מיידי (רימוני ג'ל, נוברטיס) כדי למנוע נזק הקרנית.
    8. משאבות מושתלים תת עורית על העורף דרך חתך בעור משאבת נדחף caudally את ההיבט של הגב מאחור. נגב את האזור בגב בין forelimbs עם אתנול 95% ל מט פרווה. לצבוט את העור עם מלקחיים 0.8mm גרפה (כלי מדעי יפות, 11050-10) ולעשות 1 ס"מ לחתוך לרוחב המרכזי באמצעות מספריים איריס (כלי מדעי יפות, 14060-10).
    9. כדי ליצור מרחב תת עורית של המשאבה, הכנס מספריים דפוס רגילs (כלי מדעי יפות, 14101-14) לתוך החתך ולדחוף אותם בקפידה לקראת סוף הזנב של החיה.
    10. באמצעות מלקחיים גרפה 1.0 מ"מ (כלי מדעי יפות, 11650-10), הסר את המשאבה של תמיסת מלח. החזק החתך באמצעות מלקחיים פתוחים ולהכניס את המשאבה לתוך החתך עם מכסה משאבת האוסמוטי מול סוף הזנב של החיה ודחוף את המשאבה עד סוף הזנב.
    11. קמצוץ לפצוע לסגור באמצעות מלקחיים 0.8mm וליישם כמות מספקת של Vetbond (3M, חתול # 1469SB) דבק. להחזיק עד הפצע נחרץ.
    12. להסיר את המסכה מן החי isoflurane, להזריק עם כאבים, meloxicam (0.1 מ"ג / ק"ג SC), ומקום לכלוב לטווח קצר התאוששות עד מודעת וניידים. אז במקום בכלוב ארוך טווח עם התאוששות libitum מזון ומים המודעה זמין.

    2. α4YFP עקום ב קיבעון העכבר על ידי זלוף intracardiac

    1. הפוך את הפתרונות יום לפני ההליך ולהשאיר על 4 מעלות צלסיוס כדי למזער את השתנות כל העכבריםיהיה perfused באותו יום עם קבוצה דומה של פתרונות.
    2. בצע הקיבעונות זלוף במקום מאוורר היטב. קו רצף של המשאבה peristatic (עומס Masterflex קל, 7518-00, Masterflex משאבת בקר, 60648) עם DDH 2 א '
    3. הוסף את ~ 0.0015g של הפרין (Sigma, חתול # H4784), נוגד קרישה, עד 20 מ"ל PBS pH 7.6 (Invitrogen, חתול # 70011).
    4. להרדים α4YFP עקום ב העכבר על ידי הזרקה לשריר תערובת של קטמין (25 מ"ג / ק"ג, הבריאות Wyeth בעלי חיים) ו hydrochloride medatomidine (0.25 מ"ג / ק"ג, פייזר) לתוך שריר רגלו האחורית, ומיד לשים את החיה חזרה לכלוב בבית שלו.
    5. הצמד בעל החיים המכסה קלקר מוכנס לתוך מגש מתכת. נגב החזה עם 95% אתנול. העור עם קמצוץ adson מלקחיים (כלי מדעי יפות, 91106-12) ו חיתוך לפתוח את חלל החזה עם מספריים איריס. הצמד בית החזה באמצעות hemostat יפה במיוחד (כלי מדעי יפות, 13021-12) ולחשוף את הלב.
    6. בגין שאיבה PBS ב 4 מ"ל / דק 'ואניnsert מחט 23G פרפר (בקטון דיקינסון, 367253) לתוך החדר השמאלי של בעל החיים. מיד לגזוז אטריום הזכות לאפשר דם perfusate לברוח.
    7. Perfuse 20 מ"ל של PBS (pH 7.6), ואז 30 מ"ל של paraformaldehyde 4% (pH 7.6, מדולל PBS מ 16% PFA המניות, מדעי אלקטרונים מיקרוסקופית, חתול # 15710), אז 20ml של סוכרוז 5% (pH 7.6) . מצאנו כי קיבעון על מגבירה autofluorescence. זלוף עם סוכרוז 5% שוטף PFA שיורית מהמוח, אשר מפחית את autofluorescence.
    8. הסרה של המוח חנות סוכרוז 30% במשך 3 ימים.
    9. להקפיא את המוח על חתך העטרה, לנתק את המוח הקטן בסכין גילוח והמוח מקום עובש הטבעה פלסטיק (VWR, חתול # 18986-1) בצד מקורי מעלה לצלול במגרש אוקטובר הרכבה (Tissue-Tek, חתול # 4583) . הקפאה בקרח יבש החנות ב -20 ° C לפני חיתוך.
    10. המוח בפסקה (30 מיקרומטר עובי) על cryostat ואז להעביר שקופיות מצופים. אחסן את החלקים במוח ב -20 &מעלות: C בקופסאות שקופיות המכילות אבן אחת anhydrous סולפט סידן. תיבת שקופיות צריך להיות בתיק zip מנעול סגור, כדי למנוע לחות במקפיא לאחר מכן לצרוב כאשר הם מאוחסנים ב -20 ° C.

    3. דימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי nAChRs confocal רפאים

    1. ודא שקופיות יש חשיפה מינימלית לכל מקור אור כדי למזער photobleaching
    2. Coverslip את סעיף שקופיות המוח עם המדיום הרכבה זה לא לעכב את הקרינה חלבון פלואורסצנטי. יש לנו הצלחה טובה עם Mowiol 4-88 (pH 8.5 ב טריס-HCl ו גליצרול, EMD-Calbiochem, חתול # 475904), אשר מתקשה לאחר מספר שעות. ודא Mowiol equilibrates לטמפרטורת החדר לפני הכיסוי מחליק על מנת למנוע בועות אוויר. אין להשתמש לק כאשר כיסוי החלקה, כפי שיופיע להרוות את הקרינה YFP.
    3. תמונות נרכשות באמצעות C1si Nikon מיקרוסקופ רפאים מערכת confocal. פרטים על שיטת הדמיה confocal רפאים unmixing ליניארי הם מספקיםד במקומות אחרים 13-15. הרציונל באמצעות מיקרוסקופ confocal רפאים היא רקמת המוח קבוע יש autofluorescence הטבועה. דימות ספקטרלי confocal על C1si ניקון משתמשת במערך של 32 גלאי צינור מכפיל את טווח מדגם מסוים של אורכי הגל של האור הנפלט ניאון, נשבר מרחבית אל אורכי הגל השונים באמצעות אלמנט dispersive צורם בדיוק כמו פריזמה refracting אור לבן אל קשת של צבעים 16. מה נאסף הוא ערימה למבדה של תמונות - תמונות שנאספו באורכי גל שונים של אור, כך ספקטרום פליטת נאספים עבור כל פיקסל ערימה למבדה של תמונות. מאז YFP ו autofluorescence רקמות לכל אחד מאיתנו יש חתימה ספקטראלית אופייניים, מחסנית למבדה ניתן deconvolved באמצעות אלגוריתם unmixing ליניארי אלגברית אל YFP נפרד אותות autofluorescent (איור 2). לכן, כימות מדויק מאוד של YFP הקרינה ניתן לקבוע גם ברקמות עם רמות משמעותיות של Autofluorescence.
    4. הגדרות שונות יכול להיות מותאם כדי לייעל את איכות התמונה ואת יעילות הקרינה אוסף. אנו מדווחים על הגדרות שאנחנו בדרך כלל משתמש בהם, אבל ההגדרות האלה ניתן להתאים בהתאם המדגם מיקרוסקופ confocal. כדי לכמת במדויק את השינויים בביטוי למקטע α4YFP עם ניקוטין כרונית אנו מבטיחים כי בקנה מידה אפור רמת עוצמת האותות של פיקסלים כרגע מתחת לערך להרוות (<4095 ל בהיקף 12 אפור קצת). יתר על כן, אנו להתאים לגידול פוטנציאל האות בשל upregulation הקולטן על ידי התאמת ההגדרות confocal כך פיקסלים שהם כשליש מערך להרוות (~ 1300-1400) או פחות. לאחר הגדרות מותאמות, ההגדרות נשמרות זהה לכל המפגשים הדמיה דגימות.
    5. אנו משתמשים את ההגדרות הבאות עבור דימות α4YFP להשתמש בשמן 60x CFI תוכנית Apo VC אובייקטיבי (1.40 NA, מרחק 0.13 מ"מ עובדים): 488 ננומטר לייזר בתור שידור מקסימלית של 15% 40 mW ארגון לייזר, רווח גלאי ספקטרלי ב 220, טווח ספקטרלי צילמו מתוך 496.5 nm עד 656.5 nm ברזולוציה של 5 ננומטר, 512 x 512 פיקסלים על פני שטח 50 x 50 מיקרומטר מיקרומטר, גודל חריר בינוני (60 מיקרומטר קוטר), פיקסל 4.08 להתעכב זמן, ממוצע של יותר משני סריקות ו -12 סיביות של סולם אפור.

    4. Unmixing שכבות של תמונות confocal רפאים וניתוח תמונה

    1. כדי לבצע unmixing רפאים ליניארי על התמונה נלקחה דגימה במיקרוסקופ confocal רפאים, יש תחילה לרכוש מגוון התייחסות YFP ואת ספקטרום התייחסות autofluorescence רקמות.
    2. הדרוש חשוב הקשת כל התייחסות היא להשיג אות לרעש גבוה בספקטרום הקרינה צילמו עם קו לייזר המשמש עבור הדמיה של דגימות שלך. למרות קו לייזר 514 ננומטר של ארגון יש יעילות גבוהה יותר עירור לרגש YFP אנו מעדיפים YFP תמונה עם קו 488 ננומטר לייזר כי יש הפרדה טובה יותר בין פליטת שיא של YFP וקו 488 ננומטר הוא אני פחותikely לעוות שיא ניתן לקבל את כל קשת פליטת YFP כולל עלייה לשיא. אנחנו YFP התמונה מסיסים transfected בתור התא, כך האות חזק YFP מתקבל ואת ספקטרום YFP כתוצאה מאוחסן בספריה שלנו ספקטרום ההתייחסות. Α4YFP Transfected על ביטוי שורות תאים עשויה לשמש גם משום שהיא תספק גם אות גבוהה למגוון רקע.
    3. כדי לקבל ספקטרום ההתייחסות של autofluorescence לנו תמונה autofluorescence מן קטע המוח wildtype העכבר מאזורי מוח שונים, כי אנו מתכוונים תמונה העכבר α4YFP ולקבל הספקטרום המתאים להם. אנו משתמשים בקו לייזר זהה, 488 ננומטר, ואת התמונה באמצעות פרמטרים זהים כמעט, אם כי אנו עשויים לשנות את רווח גלאי, עוצמת לייזר או לבצע הדמיה הממוצע על מנת למקסם את האות לרעש.
    4. לאחר קבלת תמונה confocal רפאים מאזור המוח של העכבר α4YFP, התמונה deconvolved מכן לתוך YFP שלה autofluorescence אותות באמצעות הפעלת אלגוריתם ליניארי unmixing ספקטרלי באמצעות ספקטרום ההתייחסות של YFP ואת ההתייחסות של קשת autofluorescence העכבר wildtype מאזור אותו מוח.
    5. התמונה α4YFP צרוף לאחר מכן ניתן לפתוח תוכנות תמונת ניתוח כגון ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) ולאחר מכן את עוצמת פיקסל הממוצע מחושב על האזור של עניין. תוסף ImageJ בשם "loci_tools.jar" ( http://www.loci.wisc.edu/bio-formats/imagej ) ניתן להשתמש כדי לייבא Nikon-ics / תעודות זהות קבצים confocal.
    6. אנו חוזרים unmixing באותו ניתוח ספקטרלי לינארית כדי wildtype עכברים באזור המוח באותה להשיג ערך הרקע שיורית.
    7. לאחר מכן מתקבל α4YFP תיקן בעוצמה ממוצעת על ידי הפחתת ערך הרקע שיורי (4.6) מתוך הערך הממוצע α4YFP מתוקן (4.5).

    5. נציג תוצאות

    אנחנו מראים השלכה נציג הצבע האמיתי של מחסנית למבדה של תמונות של habenula המדיאלי של העכבר α4YFP הומוזיגוטים (איור 3 א) שצולמה במיקרוסקופ confocal רפאים. כמו כן, אנו מציגים את הספקטרום הפליטה מאזור עניין המכיל נוירונים חיוביות α4YFP מהתמונה למבדה באותה ערימה (איור 3 ב). שיא פליטת מובהק ניכר על ~~~HEAD=NNS 527 ננומטר, שהוא פליטת הקרינה השיא של YFP. האזור השכנות habenula המדיאלי מראה ספקטרום פליטה חסר השיא רפאים ב 527 ננומטר, המעיד על העדרו של יחידות משנה α4YFP nAChR. בעקבות unmixing רפאים ליניארי באמצעות ספקטרום ההתייחסות של YFP והמוח autofluoresence העכבר עם חפיפה משמעותית של פליטת (איור 4), הפרדת YFP ואת האות autofluorescent ניתן התמונה מניב צרוף α4YFP, דימוי צרוף autofluorescent ואת ערוץ השאר. לוקליזציה ברורה של שפעת α4YFPorescence ניתן לזהות סומה צפופים של habenula המדיאלי (איור 4).

    ב α4YFP ההיפוקמפוס הוא מקומי בעיקר בנתיב perforant המדיאלי, דרך tempero-ammonic ו alveus 12. כל אלה הם glutamatergic העצבוב של ההיפוקמפוס. בדקנו את השפעות הניקוטין כרונית על הביטוי α4YFP בנתיב perforant בהיפוקמפוס (איור 5). ממשל כרונית של ניקוטין (2 מ"ג / ק"ג / שעה למשך 10 ימים) הביאה לעלייה משמעותית (69 ± 14%) ב α4YFP הקרינה מעכברים שליטה מלוחים שטופלו על כרוניים בעכברים שטופלו ניקוטין (p = 0.001, סכום ווילקוקסון מבחן דרגה) ( איור. 5).

    איור 1
    1. תרשים זרימה תרשים המציג הליך לשינויים תמונה של יחידות משנה α4YFP nAChR עם ניקוטין כרונית. מיני האוסמוטי משאבות מלאים או מלוחים או ניקוטין מושתל מתחת לעור ב & Alpחה, 4YFP עכברים הומוזיגוטים. אחרי 10 ימים העכברים הם perfused וקבוע עם paraformaldehyde 4% ועוצמת מחשוב עכבר הם מחולק (30 מיקרומטר עבה) בשקופיות. בחלק המוח צילמו על מיקרוסקופ confocal ספקטרלי (Nikon C1si) ו הכיל שמץ גל לתמונות YFP ו autofluorescent. אז התמונות α4YFP מנותחים נוספת עם תוכנת ImageJ.

    איור 2
    איור 2. תרשים סכמטי של מחסנית למבדה צילמו מ מיקרוסקופ confocal רפאים הכיל שמץ ליניארי למרכיבים רפאים שלה. (א) ערימה של תמונות למבדה נאסף. (ב) מחסנית למבדה כולל תמונות שנאספו באורכי גל שונים של אור, כך ספקטרום פליטת נאסף עבור כל פיקסל על פני הערימה כולה. (ג) מאז YFP ו autofluorescence רקמות לכל אחד מאיתנו יש חתימה ספקטראלית אופייניים, מחסנית למבדה ניתן deconvolved באמצעות אלגוריתם ליניארי אלגברית unmixing אל יםYFP eparate אותות autofluorescent. לכן, כימות מדויק מאוד של YFP הקרינה ניתן לקבוע גם ברקמות עם רמות גבוהות של autofluorescence.

    איור 3
    איור 3. תמונה confocal הרפאים של האזור במוח להביע nAChRs α4YFP. (א) היטל הצבע האמיתי של מחסנית למבדה של תמונות של habenula המדיאלי של העכבר α4YFP לקחת עם מיקרוסקופ Nikon C1si confocal רפאים. (ב) מגרשים של ספקטרום מהאזור של עניין, הכולל נוירונים המכילים α4YFP (ירוק), וכן אזור של אינטרס מחוץ habenula המדיאלי (אדום).

    איור 4
    איור 4. Unmixing רפאים שכבות של habenula המדיאלי. (א ') תמונות של α4YFP צרוף ו (ב) autofluorescence בעקבות unmixing רפאים ליניארי. (ג) הפניה ספקטרום של YFP (ירוק טריזוויות) ו autofluorescence (עיגולים צהובים) המשמש unmixing רפאים.

    איור 5
    איור 5. Upregulation של α4 nAChRs בהיפוקמפוס של α4YFP עקום בעכברים שנחשפו לניקוטין כרונית. (א) מונטאז' של רעפים α4YFP הקרינה מן ההיפוקמפוס. שני האזורים הבחירה מקווקווים הם מקומות מקורב על איבר נחות הדרך perforant של ההיפוקמפוס שבו ניתוחים בוצעו עבור כל עכבר. (ב) α4YFP הקרינה היה גבוה משמעותית בדרך perforant של עכברים שנחשפו לניקוטין כרונית מאשר מלוחים כרונית (*, p = 0.001, סכום ווילקוקסון מבחן דרגה). תוצאות מייצגים ממוצע ± SEM מ n = 20 מדידות של עכברים ניקוטין הן מלוחים כרוניות שטופלו (5 עכברים עבור כל קבוצת הטיפול).

    איור 6
    איור 6. מוטבהביטוי epth של α4YFP לעומת תיוג נוגדנים. XZ צפיות מאונך של α4YFP הקרינה (א) ו VGlut2 נוגדנים עם Cy5 כתווית משני (ב '). (ג) מגרשים מראה גדולה השפלה הקרינה עוצמת האות על עומק עבור מכתים נוגדנים (ריבועים שחורים) לעומת α4YFP (מעגלים פתוחים).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    immunohistochemical מאתגרות. המוצר גן α4YFP מתבטא ברמות WT, להיות תחת שליטה של ​​היזמים, משפרי אותם מנגנוני סחר

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    אין לנו מה למסור.

    Acknowledgements

    אנתוני Renda נתמך על ידי אוניברסיטת פרס ויקטוריה מלגה לתואר שני. מחקר זה נתמך על ידי למדעי הטבע וההנדסה מועצת המחקר של קנדה דיסקברי גרנט, פרס NARSAD לחוקר הצעיר (עד RN), קרן ויקטוריה - Myre ו ויניפרד סים הקרן, הקרן הקנדית חדשנות גרנט, פיתוח קולומביה הבריטית קרן ידע ואת למדעי הטבע וההנדסה מועצת המחקר של כלי קנדה מחקר ו גרנט מכשור. אנו מודים Jillian מקיי, כריסטינה בארנס, אריאל סאליבן, ג'ניפר מקדונלד ודניאל Morgado עבור בעלי העכבר מעולה.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    mini-osmotic pumps Alzet model 2002
    saline TEKnova, Inc. S5819
    (-)-nicotine hydrogen tartrate salt Sigma-Aldrich N5260
    eye drops Novartis AG Tear-Gel
    Vetbond glue 3M 1469SB
    heparin sodium salt Sigma-Aldrich H4784
    10x PBS Invitrogen 70011
    ketamine Wyeth Animal Health 0856-4403-01
    medatomidine hydrochloride Pfizer Pharma GmbH 1950673
    23G butterfly needle BD Biosciences 367253
    paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
    plastic embedding mold VWR international 18986-1
    O.C.T. Mounting Compound Tissue-Tek 4583
    Mowiol 4-88 EMD Millipore 475904 pH 8.5

    References

    1. Perry, D.C., Davila-Garcia, M.I., Stockmeier, C.A., & Kellar, K.J. Increased nicotinic receptors in brains from smokers: membrane binding and autoradiography studies. J. Pharmacol. Exp. Ther. 289, 1545-52 (1999).
    2. Schwartz, R.D. & Kellar, K.J. Nicotinic cholinergic receptor binding sites in the brain: regulation in vivo. Science. 220, 214-6 (1983).
    3. Marks, M.J., Burch, J.B., & Collins, A.C. Effects of chronic nicotine infusion on tolerance development and nicotinic receptors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 226, 817-25 (1983).
    4. Carlezon, W.A.J. & Nestler, E.J. Elevated levels of GluR1 in the midbrain: a trigger for sensitization to drugs of abuse? Trends Neurosci. 25, 610-5 (2002).
    5. Fitzgerald, L.W., Ortiz, J., Hamedani, A.G., & Nestler, E.J. Drugs of abuse and stress increase the expression of GluR1 and NMDAR1 glutamate receptor subunits in the rat ventral tegmental area: common adaptations among cross-sensitizing agents. J. Neurosci. 16, 274-82 (1996).
    6. Saal, D., Dong, Y., Bonci, A., & Malenka, R.C. Drugs of abuse and stress trigger a common synaptic adaptation in dopamine neurons. Neuron. 37, 577-82 (2003).
    7. Tsien, R.Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-44 (1998).
    8. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W.W., & Prasher, D.C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-5 (1994).
    9. Feng, G., Mellor, R.H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q.T., Wallace, M., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
    10. Livet, J., Weissman, T.A., Kang, H., Draft, R.W., Lu, J., Bennis, R.A., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
    11. Nashmi, R., Dickinson, M.E., McKinney, S., Jareb, M., Labarca, C., Fraser, S.E., et al. Assembly of α4β2 nicotinic acetylcholine receptors assessed with functional fluorescently labeled subunits: effects of localization, trafficking, and nicotine-induced upregulation in clonal mammalian cells and in cultured midbrain neurons. J. Neurosci. 23, 11554-67 (2003).
    12. Nashmi, R., Xiao, C., Deshpande, P., McKinney, S., Grady, S.R., Whiteaker, P., et al. Chronic nicotine cell specifically upregulates functional α4* nicotinic receptors: basis for both tolerance in midbrain and enhanced long-term potentiation in perforant path. J. Neurosci. 27, 8202-18 (2007).
    13. Dickinson, M.E., Bearman, G., Tilie, S., Lansford, R., & Fraser, S.E. Multi-spectral imaging and linear unmixing add a whole new dimension to laser scanning fluorescence microscopy. BioTechniques. 31, 1272-1278 (2001).
    14. Nashmi, R., Fraser, S.E., Lester, H., & Dickinson, M.E. In Molecular imaging: fret microscopy and spectroscopy. Periasamy, A. & Day, R.N., eds., 180-192, Oxford University Press, (2005).
    15. Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., & Pepperkok, R. Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair. FEBS Lett. 531, 245-9 (2002).
    16. Larson, J.M. The Nikon C1si combines high spectral resolution, high sensitivity, and high acquisition speed. Cytometry A. 69, 825-34 (2006).
    17. Melvin, N.R. & Sutherland, R.J. Quantitative caveats of standard immunohistochemical procedures: implications for optical disector-based designs. J. Histochem. Cytochem. 58, 577-84 (2010).
    18. Jones, I.W. & Wonnacott, S. Why doesn't nicotinic ACh receptor immunoreactivity knock out? Trends Neurosci. 28, 343-5 (2005).
    19. Moser, N., Mechawar, N., Jones, I., Gochberg-Sarver, A., Orr-Urtreger, A., Plomann, M., et al. Evaluating the suitability of nicotinic acetylcholine receptor antibodies for standard immunodetection procedures. J. Neurochem., (2007).
    20. Whiteaker, P., Cooper, J.F., Salminen, O., Marks, M.J., McClure-Begley, T.D., Brown, R.W., Collins, A.C., & Lindstrom, J.M. Immunolabeling demonstrates the interdependence of mouse brain a4 and b2 nicotinic acetylcholine receptor subunit expression. The Journal of Comparative Neurology. 499, 1016-38 (2006).
    21. Marks, M.J., McClure-Begley, T.D., Whiteaker, P., Salminen, O., Brown, R.W.B., Cooper, J., Collins, A.C., & Lindstrom, J.M. Increased nicotinic acetylcholine receptor protein underlies chronic nicotine-induced up-regulation of nicotinic agonist binding sites in mouse brain. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 337, 187-200 (2011).
    22. Marks, M.J., Rowell, P.P., Cao, J.Z., Grady, S.R., McCallum, S.E., & Collins, A.C. Subsets of acetylcholine-stimulated 86[Rb]+ efflux and 125[I]-epibatidine binding sites in C57BL/6 mouse brain are differentially affected by chronic nicotine treatment. Neuropharmacology. 46, 1141-57 (2004).
    23. King, S.L., Caldarone, B.J., & Picciotto, M.R. Beta2-subunit-containing nicotinic acetylcholine receptors are critical for dopamine-dependent locomotor activation following repeated nicotine administration. Neuropharmacology. 47 Suppl. 1, 132-9 (2004).
    24. Robinson, S.F., Marks, M.J., & Collins, A.C. Inbred mouse strains vary in oral self-selection of nicotine. Psychopharmacology (Berl.) 124, 332-9 (1996).
    25. Sparks, J.A. & Pauly, J.R. Effects of continuous oral nicotine administration on brain nicotinic receptors and responsiveness to nicotine in C57Bl/6 mice. Psychopharmacology (Berl.) 141, 145-53 (1999).
    26. Rahman, S., Zhang, J., Engleman, E.A., & Corrigall, W.A. Neuroadaptive changes in the mesoaccumbens dopamine system after chronic nicotine self-administration: a microdialysis study. Neuroscience. 129, 415-24 (2004).
    27. Picciotto, M.R., Zoli, M., Rimondini, R., Lena, C., Marubio, L.M., Pich, E.M., et al. Acetylcholine receptors containing the β2 subunit are involved in the reinforcing properties of nicotine. Nature. 391, 173-177 (1998).
    28. Fowler, C.D., Lu, Q., Johnson, P.M., Marks, M.J., & Kenny, P.J. Habenular α5 nicotinic receptor subunit signalling controls nicotine intake. Nature. 471, 597-601 (2011).
    29. Maskos, U., Molles, B.E., Pons, S., Besson, M., Guiard, B.P., Guilloux, J.P., et al. Nicotine reinforcement and cognition restored by targeted expression of nicotinic receptors. Nature. 436, 103-7 (2005).
    30. Matta, S.G., Balfour, D.J., Benowitz, N.L., Boyd, R.T., Buccafusco, J.J., Caggiula, A.R., Craig, C.R., Collins, A.C., Damaj, M.I., Donny, E.C., Gardiner, P.S., Grady, S.R., Heberlein, U., Leonard, S.S., Levin, E.D., Lukas, R.J., Markou, A., Marks, M.J., McCallum, S.E., Parameswaran, N., Perkins, K.A., Picciotto, M.R., Quik, M., Rose, J.E., Rothenfluh, A., Schafer, W.R., Stolerman, I.P., Tyndale, R.F., Wehner, J.M., & Zirger, J.M. Guidelines on nicotine dose selection for in vivo research. Psychopharmacology. 190, 269-319 (2007).
    31. Lang, T. & Rizzoli, S.O. Membrane protein clusters at nanoscale resolution: more than pretty pictures. Physiology (Bethesda). 25, 116-24 (2010).

    Comments

    0 Comments

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter