JoVE   
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Biology

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Neuroscience

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Immunology and Infection

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Clinical and Translational Medicine

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Bioengineering

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Applied Physics

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Chemistry

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Behavior

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Environment

|   

JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms I

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms II

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Automatic Translation

This translation into Norwegian was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Biology

Identifisering av Protein Samspill Partners Bruke Tandem Affinity Rensing

*1, *1, 1, 1

1Section of Virology, Department of Medicine, Imperial College London

* These authors contributed equally
Article
    Downloads Comments Metrics
     

    Summary

    Tandem affinitet rensing er en robust metode for identifisering av protein bindende partnere. Som bevis på konseptet, ble denne metoden brukt på godt karakterisert oversettelse initiering faktor eIF4E til co-fremskynde vertscellen faktorer involvert i oversettelse innvielse. Denne metoden er lett tilpasses enhver cellulær eller viral protein.

    Date Published: 2/25/2012, Issue 60; doi: 10.3791/3643

    Cite this Article

    Bailey, D., Urena, L., Thorne, L., Goodfellow, I. Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification. J. Vis. Exp. (60), e3643, doi:10.3791/3643 (2012).

    Abstract

    En kritisk og ofte begrense skritt i å forstå funksjonen av host og virale proteiner er identifisering av å samhandle mobilnettet eller viral protein partnere. Det er mange tilnærminger som gjør identifiseringen av samvirkende partnere, inkludert gjær to hybrid system, samt trekke ned analyser ved hjelp av rekombinante proteiner og immunoprecipitation av endogene proteiner etterfulgt av massespektrometri identifikasjon 1. Nyere studier har fremhevet nytten av dobbelt-affinitet tag mediert rensing, kombinert med to konkrete eluering trinn i identifiseringen av samvirkende proteiner. Denne tilnærmingen, kalt Tandem Affinity Renselse (TAP), ble opprinnelig brukt i gjær 2,3 men mer nylig har blitt tilpasset til bruk i pattedyrceller 4-8.

    Som proof-of-concept har vi etablert en tandem affinitet renselse (TAP)-metoden bruker godt karakterisert eukaryote oversettelse initiering facTor eIF4E 9,10. Den cellulære oversettelse faktoren eIF4E er en kritisk komponent i den cellulære eIF4F komplekset involvert i Cap-avhengige oversettelse initiering 10. TAP tag brukt i denne studien består av to Protein G enheter og en streptavidin bindende peptid atskilt med en Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sekvens. TAP tag brukt i denne studien består av to Protein G enheter og en streptavidin bindende peptid atskilt med en Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sekvens åtte. For å gi avkall på behovet for generering av klonal cellelinjer, utviklet vi en rask system som bygger på den uttrykk for TAP-merkede agn protein fra en episomally opprettholdes plasmid basert på pMEP4 (Invitrogen). Uttrykk av merket murine eIF4E fra denne plasmid ble kontrollert ved hjelp av kadmium klorid induserbar metallothionein promoter.

    Lyse av de uttrykker cellene og påfølgende affinitet rensing via binding til rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding til streptavidin knyttet agarose og påfølgende biotin eluering identifisert en rekke proteiner tilsynelatende spesifikke for eIF4E trekke ned (i forhold til styre cellelinjer som uttrykker TAP tag alene). Identiteten til de proteinene ble innhentet ved eksisjon av bandene fra 1D SDS-PAGE og påfølgende tandem massespektrometri. De identifiserte komponentene som følger de kjente eIF4E proteiner eIF4G og 4EBP-1. I tillegg andre deler av eIF4F komplekset, hvorav eIF4E er en komponent ble identifisert, nemlig eIF4A og Poly-A bindende protein. Evnen til å identifisere ikke bare kjent direkte bindende partnere samt sekundære samvirkende proteiner, fremhever videre nytten av denne tilnærmingen i karakterisering av proteiner med ukjent funksjon.

    Protocol

    1. Generering av cellelinjer: pMEP4 transfeksjon / uttrykket

    1. Transfektere celler med pMEP4 uttrykk vektor og velg med 100 mikrogram hygromycin B / ml (Roche) til alle mock transfekterte cellene har blitt drept av. Den pMEP4 plasmidet opprettholdes episomally så det er ikke nødvendig å isolere spesifikke kloner.
    2. Celler som inneholder pMEP4 vektoren kan settes i gang ved behandling med 10 mm CdCl 2 i 16 timer. Uttrykk og inducibility bør bekreftes på en liten skala før forsterkning av cellelinjer. TAP-tagget protein kan lett oppdages som protein G domener bindes til antistoffene fra nesten alle arter. For storskala renselser vanligvis 10 konfluent 175 cm 2 flasker av celler kreves. Dette tilsvarer ca 2 X10 8 uttrykke celler.

    2. Cell lysate forberedelse

    1. Skrap celler inn i PBS og sammen til ett 50 ml tube. Spinn 1200X gfeller 5 minutter (dette skal resultere i 2-3 ml av pakkede celler til å begynne med, noe som reduserer til ca 1,5 ml etter vask).
    2. Vask cellene tre ganger i iskaldt PBS (50 MLS hver gang).
    3. Lyse cellene i 5 ml lysis buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 125 mm NaCl, 5% Glyserol, 0,2% NP-40, 1,5 mM MgCl 2, 25 mm NaF, 1 mM Na 3 VO 4 og protease inhibitor ). Merk: NaF, 3 Na VO 4 og proteasehemmere bør legges frisk. Pipettering opp og ned 10 ganger før avreise til 5 minutter på isen. Sprøyte opp og ned 5-10 ganger med en stump nål før du forlater igjen på is i 5 minutter på isen. Gjenta syringing og la stå i ytterligere 5 minutter på isen.
    4. Fryse-tine den lysate to ganger (flytende N 2 / eller tørris og etanol). Ikke la utvalget til å nå større enn 4 ° C. Merk: Du kan lagre denne prøven ved -80 ° C til du har tid til å behandle.
    5. Delmengde prøve til 1,5 ml rør og fjern lyserte celler og debris ved sentrifugering (10 minutter ved 4 ° C, 16 000 X g).
    6. Recover supernatant, kombinere i en 15 ml falk rør og (valgfritt) passerer gjennom en 0,45 mikrometer filter før du tar en 20 mL prøve for protein yield kvantifisering. Fjerne en ytterligere 50 mL delmengde for påfølgende analyse (Prøve 1).

    3. Binding til Rabbit IgG-agarose

    (Merk: Alle spins bør utføres ved 1200X g i en nedkjølt sentrifuger ved 4 ° C i 1 minutt, hvis ikke annet er oppgitt)

    1. Forsiktig resuspender kanin IgG-agarose løsning (Sigma-Aldrich) ved å svinge flaske. Ta 380 mL av IgG agarose (ved hjelp av et kutt 1ml pipettespissen) og fjerne shipping / konserveringsmiddel løsning ved sentrifugering i 1 minutt. Vask agarose tre ganger i kjølt lysis buffer (4 ° C) ved hjelp av sentrifugering å avklare. Den endelige avkastningen av agarose bør være ca 250 mL av pakket perler.
    2. Tilsett ryddet cellen lysate fra 2,6 (i en 15 ml falk badekare) til den vasket kanin-IgG agarose og inkuber 3 timer (eller over natten) ved 4 ° C ved hjelp av en roterende blandebatteri.
    3. Spinn ned agarose perler i 5 minutter ved 4 ° C og fjern supernatanten for påfølgende analyse (Eksempel 2). Merk: TAP tagget protein skal nå være assosiert med perler.

    4. TEV protease cleavage

    (Merk: Alle spins bør utføres ved 1200X g i en nedkjølt sentrifuger ved 4oC i 1 minutt, hvis ikke annet er oppgitt)

    1. Vask kanin IgG agarose perler tre ganger i kjølt lysis buffer (4 ° C) ved hjelp av sentrifugering for å avklare (merk: det lysis buffer bør ikke inneholde proteasehemmere). Forsiktighet bør utvises for ikke å fjerne eller miste noen perler i løpet av de vaske trappen.
    2. Vask perlene ytterligere to ganger med TEV-protease cleavage buffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mm NaCl, og 0,2% NP-40) med sentrifugering å avklare. Etter siste vask forsiktig fjerne all liQuid fra perlene.
    3. Forbered en TEV protease cleavage mix, for hver prøve inkluderer 467,5 mL H 2 O, 25 mL 20x TEV Buffer (Invitrogen), 5 mL 0.1m DTT og 2,5 mL (25 U) TEV Protease (Invitrogen). Legg til 500 mL av denne TEV cleavage blandingen til hver prøve fullstappede perler og overføre hele blandingen til en 1,7 ml ferdigfylt smurt tube (CoStar). Før inkubasjon fjerne en 30 mL delmengde for påfølgende analyse (Prøve 3).
    4. Inkuber TEV protease reaksjon over natten ved 4 ° C ved hjelp av en roterende blandebatteri. Vær oppmerksom på at kortere Inkuberinger tider kan brukes avhengig av hva slags agn protein og tilgjengeligheten av TEV protease kuttesete men minimal inkubasjonstiden bør empirisk bestemt.

    5. Binding til Ultralink immobilisert streptavidin Plus perler

    (Merk: Alle spins bør utføres ved 1200X g i en nedkjølt sentrifuger ved 4 ° C i 1 minutt, hvis ikke annet er oppgitt)

  • Sentrifuger TEV cleavage reaksjonen inneholder kanin IgG agarose perler i 5 minutter ved 1200X g (4 ° C). Ta en 20 mL delmengde av avklart supernatanten for analyse (Prøve 4)
  • Overfør gjenværende supernatanten (ca 480 mL) til en frisk 1,5 ml ferdigfylt smurt tube (CoStar) og la dette på is. Ikke kast dette supernatanten - denne inneholder din TEV kløyvde agn protein og eventuelle tilknyttede bindende proteiner.
  • Legg til 500 mL av kjølt lysis buffer (punkt 2.3) til de resterende kanin IgG agarose perler og Resuspender. Sentrifuger denne blandingen å avklare perlene før du fjerner supernatanten og kombinere det med det fra trinn 5,2. La dette røret på is (det skal nå inneholde ~ 980 mL av prøven).
  • Beholde kanin IgG agarose perler for senere analyse (prøve 5). Merk: Hvis du kjører denne prøven på en SDS-PAGE gel (eller western blot) vil det gi mye av bakgrunnen på grunn av tilstedeværelsen av IgG tung og lettkjeder.
  • Imens forsiktig resuspender den Ultralink immobiliserte streptavidin Plus agarose perler (Pierce) ved å svinge flasken. Ved hjelp av en 200 mL pipette med slutten cut, alikvoter 70 mL av streptavidin perler per prøven i pre-smurt 1,5 ml rør og fjern shipping / konserveringsmiddel løsning ved sentrifugering. Merk: Disse perlene er veldig små og så "duck-billed" eller flat / smal-ended tips kan brukes til å minimere perle tap under vask.
  • Vask streptavidin perler tre ganger i kjølt lysis buffer (4 ° C) ved hjelp av sentrifugering å avklare. Dette bør la det være cirka 45-50 mL av pakket perler per tube.
  • Overfør TEV-protease cleavage supernatanten (dvs. 980 mL av prøven fra trinn 5,3) til røret som inneholder vasket streptavidin perler og Inkuber i 3 timer (eller over natten) ved 4 ° C ved hjelp av en roterende blandebatteri.
  • Spinn ned streptavidin perlene i 5 minutter ved 4 ° C og fjern supernatanten for påfølgende analyse (SamPLE 6). Vask streptavidin perler tre ganger i kjølt lysis buffer (4 ° C) ved hjelp av sentrifugering å avklare. Etter den siste vask, forsiktig fjerne all gjenværende vaskebuffer.
  • 6. Biotin eluering av streptavidin bindende peptid og agn protein

    (Merk: Alle spins bør utføres ved 1200X g i en nedkjølt sentrifuger ved 4 ° C i 1 minutt, hvis ikke annet er oppgitt)

    1. Eluer tagget proteiner fra streptavidin perlene ved å legge 500 mL PBS: Biotin (1 mm D-biotin) og ruger ved 4 ° C i 3 timer (eller over natten) ved hjelp av en roterende blandebatteri.
    2. Spinn ned streptavidin perlene i 5 minutter ved 4 ° C og fjern supernatanten til et 1,5 ml ferdigfylt smurt tube (Merk: dette er den endelige prøven / eluering (Sample 7).
    3. Legg til en annen 500 mL Biotin: PBS til de gjenværende streptavidin perler og inkuber ved 4 ° C i 2-3 timer (eller over natten) ved hjelp av en roterende blandebatteri.
    4. Retorv trinn 6,2 og kombinere de to elutions (prøve 7). Denne endelige eluering kan oppbevares ved -80 ° C.
    5. For å vurdere effektiviteten av biotin eluering, fryse de resterende streptavidin perler og koke senere i SDS prøve buffer (Sample 8) (anbefalinger: LaneMarker 5x redusere prøve buffer fra Fisher).

    7. Protein konsentrasjon

    1. Den endelige eluatet (Sample 7) må være konsentrert før analyse på grunn av lav protein konsentrasjon og relativt høyt volum. Dette kan oppnås ved hjelp av lav molekylvekt (<5 kDa) Vivaspin spin kolonner (Vivascience). Tar sikte på å konsentrere volumet ned til mindre enn 100 mL. Denne endelige prøven kan kokes og oppbevares i protein prøve buffer (anbefalinger: LaneMarker 5x redusere prøve buffer fra Fisher).

    8. Analyse

    1. Prøver 1-8 kan analyseres ved western blot for å fastslå effektiviteten av trekke ned. Merk: De fleste sekundære antistoffer vilkryssreagerer med protein G domener av fusion protein, men dette er fjernet etter TEV protease cleavage.
    2. Eksempel 7 kan analyseres ved 1D eller 2D SDS-PAGE Farging kan utføres ved hjelp sølv eller Coomassie (anbefalinger: SilverQuest sølv flekker og kolloidale Blue Coomassie flekker kits fra Invitrogen). Protein identifikasjon kan utføres ved hjelp massespektrometri.

    9. Representative Resultater

    Et eksempel på 1D SDS-PAGE analyse av den endelige eluering (Sample 7) fra denne protokollen til å identifisere bindende partnere av TAP tagget eIF4E er gitt i Figur 2. Denne representanten gel gjenspeiler den komplekse og rikelig natur eIF4E interaksjoner med andre proteiner i cellen. Sammenligning med den negative kontrollen også vist i figur 2, generert fra en cellelinje som uttrykker bare TAP tag, illustrerer det spesielle ved denne eIF4E agnet rullegardinmenyen. I dette tilfellet 15% av konsentrert endelige eluering (Sample7) ble analysert ved 1D SDS-PAGE bruke kommersielt tilgjengelige pre-cast gradient gel før de blir farget med Silverquest sølv flekker kit fra Invitrogen.

    Typisk 50-85% av den resterende konsentrert endelige eluering (Sample 7) er analysert med kolloidalt Coomassie flekk (Invitrogen). Prøver (gel skiver / band) fra hele kjørefeltet ble deretter hentet og analysert av masse-spektrometri.

    Proteiner identifisert i eIF4E nedtrekksmenyen ble filtrert mot bindende partnere fra negativ kontroll for å identifisere ikke-spesifikk binding partnere. De endelige proteiner identifisert ved hjelp av denne prosessen TAP tagging eIF4E kan sees i figur 2, som er representant for de normale proteiner identifisert ved hjelp av denne teknikken. I tillegg ble en rekke av de eIF3 subenheter også identifisert (data ikke vist).

    Figur 1
    Figur 1. Skjematisk avtandem affinitet rensing prosedyre. De seks trinn tandem affinitet renselse (TAP)-protokollen innebærer cellelinje generasjon, cellelyse, Kanin IgG agarose immuno-nedbør, TEV protease cleavage, streptavidin perle affinitet rensing og endelig biotin eluering.

    Figur 2
    Figur 2. Tandem affinitet rensing av murine eIF4E protein. Samhandle partnere av N terminalt Pek tagget eIF4E ble renset fra eukaryote HEK293 celler ved hjelp av vedlagte protokoll. En 20% brøkdel av den endelige eluering (Sample 7) ble analysert ved SDS-PAGE på en pre-cast 4-12% stigning gel (TAP-eIF4E kjørefelt). En tilsvarende analyse ble utført for tag alene (TAP kjørefelt). Proteiner ble identifisert ved hjelp av sølv flekker. Proteiner senere identifisert av massespektrometri av den samme prøven blir fremhevet på denne gel.
    Forkortelser: eIF4G; eukaryote oversettelse initiering fskuespiller 4 gamma, PABP; Polya bindende protein, eIF4A: eukaryot oversettelse initiering faktor 4 alpha, SBP-eIF4e, de resterende TAP agnet protein inneholder streptavidin bindende peptid smeltet til eukaryote oversettelse initiering faktor 4E, 4EBPs; eukaryote oversettelse initiering faktor 4E binding proteiner, eIF4eNiF1l eukaryote oversettelse initiering faktor 4E kjernekraft import faktor 1, SBP, resterende streptavidin bindende peptider fra TEV ukondensert TAP peptid.

    Discussion

    TAP tagging teknikken illustrert her demonstrerer en svært bestemt og streng metode for å isolere bindende partnere av agn proteiner i eukaryote celler. Denne tilnærmingen kan brukes til både cellulære og viral proteiner. Så vidt vi vet er dette første gang en slik teknikk har blitt brukt på oversettelsen innvielse faktor eIF4E. Identifikasjon av den kjente eIF4E bindende proteiner eIF4G og 4EBPs bruke denne teknikken bekrefter gyldigheten av en slik tilnærming. I tillegg har identifisering av den gjenværende delen av eIF4F komplekse, bekrefter nemlig eIF4A, og PABP som indirekte samhandling og tertiære komplekser forbli intakt under renseprosessen. Identifiseringen av flere isoformer av de kanoniske eIF4e proteiner var også tydelig. Disse er beskrevet nærmere i figur 2.

    Med hensyn til begrensningene i tilnærmingen, bør visse forsiktighet tas med hensyn til valgav agn protein og om ikke å plassere TAG-koden på N-eller C-terminus. Det kan være lurt å foreta en funksjonell analysen eller undersøke lokalisering av fusion protein ved mikroskopi før full skala rensing for å sikre at tagget deriverte er funksjonell. Integral membran eller kjernefysiske proteiner kan ikke nødvendigvis bli utgitt av de relativt mildt vaskemiddel forhold som beskrives i lysis trinn. Som med alle immunoprecipitations og lignende pull-down analyser, kan endringer gjøres til natur og konsentrasjoner av vaskemiddel i lysis buffer for å øke effektiviteten i lysis. Den ioniske konsentrasjonen av lysis og vask buffere kan også bli modifisert for å øke eller redusere stringens av renselse. Det er også mulig å utføre innledende rensing under standard milde betingelser (beskrevet ovenfor), men senere dele streptavidin perlene (pkt. 5.8) inn 4-5 alikvoter, som senere kan vaskes under økende ionisk condene. Dette kan gjøre det mulig for brukeren å identifisere de optimale forholdene som fjerner ikke-spesifikke samspill proteiner. Hele prosessen kan også utføres ved hjelp forbigående transfeksjon hvor samvirkende partnere er kjent og deres tilstedeværelse eller fravær fastsatt av påfølgende Western blot bare. I dette tilfellet vil vi foreslå to 100cm 2 retter av celler hver transfekterte med 8 mikrogram uttrykk plasmid. Denne modifiserte prosedyren er særlig nyttig når undersøke muligheten av muterte derivater av TAP-fusion protein for å samhandle med kjente bindende partnere.

    Analysere prøver 1 til 8 på sølv farget SDS-PAGE gel (eller Western blot hvis et antistoff er tilgjengelig) er en utmerket måte å feilsøking, bør teknikken klarer å generere akseptable resultater. Effektiviteten av hver affinitet baserte nedbør og spesifikk eluering kan analyseres ved hjelp av denne systematiske prøvetaking tilnærmingen. Prøver ett til åtte må tas i løpet av optimvisualisering av protokollen for hver nye agn.

    TAP tagging teknikk gir en kraftig og robust alternativ til andre tilnærminger som GST rullegardinlistene, gjær to hybrid-analyser etc. dobbel tilhørighet rensing og konkrete eluering trinn (TEV cleavage og biotin eluering) gi spesifisitet og stringens som skal opprettholdes på en høyt nivå gjennom hele rensing prosedyren. Kritisk denne teknikken kan brukes på alle protein og representerer derfor en utmerket metode for å identifisere bindende partnere for et protein mål av interesse.

    Disclosures

    Ingen interessekonflikter erklært.

    Acknowledgements

    Denne forskningen ble finansiert av en Wellcome Trust Senior Fellowship tildelt dr. Ian Goodfellow.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Hygromycin B Roche Group 10843555001
    Rabbit IgG Agarose Sigma-Aldrich A2909
    AC-TEV Protease Invitrogen 12575-015
    Protease inhibitor cocktail Calbiochem 539134
    Ultralink Immobilized Streptavidin Plus beads Pierce, Thermo Scientific 53116
    Vivaspin 500 centrifugal concentrator (5KDa) Vivaspin V50112
    SilverQuest silver staining kit Invitrogen LC6070
    Novex Colloidal Blue Coomassie staining kit Invitrogen LC6025
    1.7ml prelubricated tubes Costar 3207
    Microcapillary pipette tips VWR international 37001-150
    NuPage 4-12% Bis-Tris gradient gels Invitrogen NP0322BOX
    CdCl2 Sigma-Aldrich 202908
    5x SDS Sample Buffer Fisher Scientific PN39000

    References

    1. Williamson, M.P. & Sutcliffe, M.J. Protein-protein interactions. Biochem. Soc. Trans. 38 (4), 875-8 (2010).
    2. Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat. Biotechnol. 17 (10), 1030-2 (1999).
    3. Blackwell, C. & Brown, J.D. The application of tandem-affinity purification to Candida albicans. Methods Mol. Biol. 499, 133-48 (2009).
    4. Cochrane, A., et al. Stable complex formation between HIV Rev and the nucleosome assembly protein, NAP1, affects Rev function. Virology. 388 (1), 103-11 (2009).
    5. Fernandez, E., et al. Targeted tandem affinity purification of PSD-95 recovers core postsynaptic complexes and schizophrenia susceptibility proteins. Mol. Syst. Biol. 5, 269 (2009).
    6. Gloeckner, C.J., et al. Tandem affinity purification of protein complexes from mammalian cells by the Strep/FLAG (SF)-TAP tag. Methods Mol. Biol. 564, 359-72 (2009).
    7. Holowaty, M.N., et al. Protein profiling with Epstein-Barr nuclear antigen-1 reveals an interaction with the herpesvirus-associated ubiquitin-specific protease HAUSP/USP7. J. Biol. Chem. 278 (32), 29987-94 (2003).
    8. Burckstummer, T., et al. An efficient tandem affinity purification procedure for interaction proteomics in mammalian cells. Nat. Methods. 3 (12), 1013-9 (2006).
    9. Goodfellow, I., et al. Calicivirus translation initiation requires an interaction between VPg and eIF 4 E. EMBO Rep. 6 (10), 968-72 (2005).
    10. Goodfellow, I.G. & Roberts, L.O. Eukaryotic initiation factor 4E. Int. J. Biochem. Cell Biol. 40 (12), 2675-80 (2008).

    Comments

    0 Comments

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter