JoVE   
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Biology

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Neuroscience

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Immunology and Infection

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Clinical and Translational Medicine

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Bioengineering

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Applied Physics

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Chemistry

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Behavior

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Environment

|   

JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms I

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms II

You have trial access to videos in this collection until May 31, 2014.

Automatic Translation

This translation into Arabic was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Immunology and Infection

جيل من الخلايا المستحثة تي التنظيمية من المرحلة الابتدائية الإنسان خلايا T ساذجة والذاكرة

1, 1, 1, 1, 1

1Department of Microbiology, Immunology and Molecular Genetics, University of Kentucky

Article
    Downloads Comments Metrics

    You must be subscribed to JoVE to access this content.

    This article is a part of   JoVE Immunology and Infection. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

    Recommend JoVE to Your Librarian

    Current Access Through Your IP Address

    You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

    IP: 23.23.67.57, User IP: 23.23.67.57, User IP Hex: 387400505

    Current Access Through Your Registered Email Address

    You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

     

    Summary

    ونحن تصف طريقة لتوليد خلايا تي التنظيمية، والذاكرة وساذجة من متبرع الدم البشري واحد. ويمكن مقارنة Tregs الاستقطاب ثم إلى مجموعات فرعية أخرى في مجموعة متنوعة من التطبيقات الوراثية والوظيفية مع تجانس الجينية، بما في ذلك فحص قمع بالتفصيل هنا أيضا.

    Date Published: 4/16/2012, Issue 62; doi: 10.3791/3738

    Cite this Article

    Ellis, G. I., Reneer, M. C., Vélez-Ortega, A. C., McCool, A., Martí, F. Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Naïve and Memory T Cells. J. Vis. Exp. (62), e3738, doi:10.3791/3738 (2012).

    Abstract

    تطوير وصيانة CD4 + التنظيمية مناعة الخلايا التائية (Tregs) المساهمة في تحمل الطرفية اللازمة للبقاء في التوازن المناعية مع الكم الهائل من مستضدات الذات وcommensal في وعلى الجسم البشري. يمكن أن الاضطرابات في التوازن بين Tregs والتهابات الخلايا التائية التقليدية يؤدي في الباثولوجيا المناعية أو السرطان. على الرغم من أن ثبت الحقن العلاجية للTregs أن تكون فعالة في الفئران نماذج من التهاب القولون النوع الأول من مرض السكري والتهاب المفاصل الروماتيزمي والكسب غير المشروع مقابل المضيف المرض، و 4 عدة فروق جوهرية في مجال البيولوجيا Treg الإنسان مقابل 5 الماوس وبذلك حالت دون حتى استخدام السريري. استلزم عدم توافر العدد الكافي، والنقاء، والاستقرار، وخصوصية صاروخ موجه من Tregs العلاجية منصة حيوية للتنمية البشرية على Treg التي لتحسين الظروف لتوسعها المجراة سابقا 6.

    مد هنا نحنescribe وسيلة للتمايز Tregs التي يسببها (iTregs) من نفس واحدة الإنسان المانحة الدموية المحيطية والتي يمكن تقسيمها إلى أربع مراحل: عزل الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى، واختيار المغناطيسي للخلايا CD4 +في خلية ثقافة المختبر، ومضان تنشيط الفرز الخلية (نظام مراقبة الأصول الميدانية) من مجموعات فرعية الخلايا التائية. منذ توقيع نسخ Treg عامل forkhead P3 مربع (FoxP3) هو عامل النسخ التنشيط التي يسببها البشر (7) ويجب عدم استخدام أي علامة أخرى فريدة من نوعها موجودا، لجنة توافقية من علامات لتحديد الخلايا التائية مع النشاط المكثف. بعد ستة أيام في الثقافة، لا يمكن ترسيم الخلايا في نظامنا إلى الخلايا التائية السذاجة، وخلايا تي الذاكرة أو iTregs على أساس التعبير النسبية من CD25 و CD45RA. كما الخلايا التائية الذاكرة والسذاجة لديها متطلبات مختلفة عن الاستقطاب وplasticities قبل فرز السكان تي الخلية الأولية إلى + CD45RA وCD45RO + يمكن فرعية باستخدام البريد لدراسة هذه التناقضات. بما يتفق مع الآخرين، لدينا CD25 مرحبا CD45RA - iTregs مستويات عالية من التعبير عن FoxP3 GITR وCTLA 4-11 وانخفاض مستويات CD127 12. بعد FACS من كل السكان، ويمكن استخدام الخلايا الناتجة في فحص القامع الذي يقيم القدرة النسبية لتأخير انتشار carboxyfluorescein succinimidyl استر (CFSE) المسمى ذاتي الخلايا التائية.

    Protocol

    1. عزلة الإنسان الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى (PBMCs) من معطف بافي

    1. الحصول على وحدة واحدة من معطف بوفي من المستشفى أو في مكان قريب موقع مركز الدم. مركزنا الدم يوفر لنا حول 40-60 مل من معطف بوفي لكل وحدة تم الحصول عليها من المتبرعين بالدم العادي.
    2. صب الدم الى مشبع 500 مل زجاجة تحتوي على برنامج تلفزيوني العقيمة لتخفيف الغلالة الشهباء. وينبغي أن الحجم النهائي من بافي PBS معطف + يكون 250 مل.
    3. شغل 10 50 أنابيب مخروطية كل مل مع 20 مل من محلول Lymphoprep.
    4. تراكب بلطف الحل Lymphoprep مع 25 مل من معطف بوفي الواحد، والحرص على عدم تعكير صفو حل Lymphoprep.
    5. تدور الأنابيب لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في ز × 500. تأكد لإيقاف الفرامل أجهزة الطرد المركزي، وحتى لا تعكر صفو جزء اللمفاويات.
    6. جمع PBMCs في واجهة بين Lymphoprep والطبقات المتوسطة في البلازما مع ماصة. نضح في قبالة بلازما متوسطة حتى حوالي 1 مل لا يزال يغطي طبقة معطف بوفي التي تحتوي على PBMCs. استخدم ماصة 10 مل لنقل PBMCs إلى أنبوب جديد 50 مل.
    7. غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني وresuspend ثم الخلايا في 50 مل من RPMI الباردة لحساب على عدادة الكريات. انتعاش نموذجي هو 8 × 10 8 - 1 × 10 9 PBMCs.

    يمكن زيادتها هذا الإجراء إلى أسفل لأصغر حجم الدم. التخفيف من عينات الدم كله هو 1:1 في برنامج تلفزيوني.

    2. اختيار السلبية المغناطيسي من إجمالي CD4 + الخلايا التائية، CD4 + + CD45RA خلايا تي ساذجا أو CD4 + + CD45RO الذاكرة خلايا تي من PBMCs باستخدام مجموعات الإثراء EasySep (تقنيات الخلايا الجذعية)

    الخطوات التي يجب اتباعها ل1 × 10 8-4،25 X PBMCs 8 10.

    1. PBMCs Resuspend إلى تركيز النهائي من 5 × 10 7 لكل مليلتر في برنامج تلفزيوني يحتوي على 2٪ FBS وEDTA 1MM. نقل الخلايا إلى العذبة البولي بروبلين 14 مل أنبوب أسفل جولة.
        ق = "lalpha">
      1. عزلة الإنسان CD4 + مجموع الخلايا التائية عن طريق الانتقاء السلبية: إضافة الإنسان CD4 + T كوكتيل إثراء خلية من الأجسام المضادة (50 ميكرولتر لكل مليلتر من PBMCs)، ومزيج من الحضانة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      2. عزل خلايا تي ساذجة عن طريق الانتقاء السلبية: إضافة 50 ميكرولتر المضادة للCD45RO الأجسام المضادة لكل مل من تعليق خلية PBMC، ومزيج من الحضانة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إضافة كوكتيل تخصيب المقدمة مع عدة (50 ميكرولتر من مل لكل من PBMCs)، ومزيج احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
      3. عزل خلايا تي الذاكرة عن طريق اختيار السلبية: إضافة CD4 + T ذاكرة الإنسان كوكتيل إثراء خلية من الأجسام المضادة (50 ميكرولتر لكل مليلتر من PBMCs)، ومزيج من الحضانة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    2. خلط الجزيئات المغناطيسية جيدا لتوزيع بالتساوي لهم في جميع أنحاء حل. لا تفعل النانوية دوامة من عدة ساذجة.
    3. إضافة الجزيئات المغناطيسية (100 ميكرولتر لكل مليلتر من PBMCs لCD4 + مجموع والسذاجة اختيار الخلايا التائية، 50 ميكرولتر لكل مليلتر من PBMCs لاختيار ذاكرة الخلايا التائية). مزيج من قبل pipetting بلطف 2-3 مرات واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق عن السذاجة اختيار الخلايا التائية أو 5 دقائق للذاكرة أو CD4 + T مجموع اختيار الخلية.
    4. إضافة PBS التي تحتوي على 2٪ و 1 FBS EDTA ملم الى جعل حجم ما يصل الى 10 مل لكل أنبوب. مزيج من قبل pipetting بلطف 2-3 مرات قبل ان يضع أنبوب لم يسبق لهم اللعب في مغناطيس EasySep الفضة لمدة 5 دقائق، 10 أو 2.5 لCD4 + مجموع الخلايا التائية، مجموعات فرعية من السذاجة والذاكرة، على التوالي.
    5. مع أنبوب لا يزال في EasySep المغناطيس، صب السائل في أنبوب جديد 50 مل لعزل الخلايا من الفائدة.
    6. كرر الخطوات من 2.5 و 2.6 لتحسين الانتعاش.

    3. شروط الثقافة خلية للحث على خلايا تي التنظيمية

    1. قبل يوم من الخطوات 1 و 2 الأنسجة لوحات معطف الثقافة، عن طريق تمييع 1 المضادة للأجسام المضادة CD3 (OKT3 استنساخ) لتركيز 1 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني العقيمة. لوحة 6 جيدا إضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني + المضادة للCD3 لكل بئر، لوحة 12 جيد إضافة 1 مل أو لوحة 24 جيد إضافة 500 ميكرولتر لكل بئر. الحفاظ على لوحة المغلفة في 4 درجات مئوية حتى استخدامها.
    2. إعداد المتوسطة الاستقطاب عن طريق إضافة للحرارة المعطل الجنين بنسبة 10٪ مصل بقري (FBS)، و 100 وحدة / مل البنسلين، الستربتومايسين 100 ميكروغرام / مل و 50 ميكرومتر β-المركابتويثانول إلى RPMI-1640 ملي Glutamax-I و 25 قبل أن تستكمل مع 2.06 ملي HEPES العازلة. المقبل، إضافة 2 نانوغرام / مل TGF-β و 5 نانوغرام / مل IL-2. هنا، يمكن للمرء أن يضيف يغاندس أو مثبطات التي تهم وسائل الإعلام. Resuspend الخلايا من الخطوة 2 عند تركيز من الخلايا × 10 6/2 مل من وسط الاستقطاب.
    3. قبل دافئ لوحات عند 37 درجة مئوية، ونضح في برنامج تلفزيوني من أصل لمكافحة CD3 المغلفة الآبار قبل أن يضيف الخلايا. إضافة 4 مل لكل بئر من تعليق خلية للحصول على لوحة 6 جيدا، 2 مل من الخلايا للحصول على لوحة 12 جيدا أو 1 مل من الخلايا للحصول على لوحة جيد 24. تملأ الآبار فارغة مع برنامج تلفزيوني للحد من تبخروسائل الاعلام. احتضان لمدة 3 أيام في 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2.
    4. في يوم آخر تصفيح 3، وتدور إلى أسفل لوحة في جهاز للطرد المركزي لمدة 5 دقائق في ز × 500. من دون إزعاج خلايا تي في الجزء السفلي من لوحة، وإزالة نصف من وسائل الإعلام واستبدالها مع وسائل الاعلام الجديدة. بدلا من ذلك، إذا كان جيدا ويصبح مكتظة مع الخلايا (تركيز فوق 3 × 10 مل / 6)، وتقسيم وحدة التخزين على قدم المساواة في آخر لوحة لمكافحة CD3 المغلفة وإضافة وسائل الإعلام الجديدة ما يصل الى حجم الأصلي. احتضان لمدة يومين أو ثلاثة أيام في 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2.

    4. مضان المنشط الفرز الخلية (نظام مراقبة الأصول الميدانية) لثلاثة من السكان من الخلايا التائية

    1. إعداد نظام مراقبة الأصول الميدانية غسل العازلة من خلال إضافة 0.5٪ (W / V) ألبومين المصل البقري (BSA) و 2 مم EDTA إلى برنامج تلفزيوني العقيمة. العازلة مكان في 4 درجات مئوية للحصول على البارد.
    2. إزالة الخلايا من خلية ثقافة جيدا وشطف كل جيدا مع 2 مل من برنامج تلفزيوني لضمان استرداد كامل الخلية. وضع جميع الخلايا في 50 أنابيب البولي بروبلين مل والطرد المركزي في 500 x ج لمدة 10دقائق في 4 درجات مئوية.
    3. عد الخلايا في وعدادة الكريات لتحديد كثافة الخلية.
    4. مكان 3-5 × 10 5 خلايا لكل أنبوب في أربعة منفصلة 5 مل جولة أنابيب البولي ستايرين أسفل لعناصر التعويض. وضع الخلايا المتبقية في 50 أنابيب البولي بروبلين مل، أي أكثر من 35 × 10 6 خلايا في أنبوب.
    5. تدور أسفل الخلايا لمدة 5 دقائق في تمام الساعة 4 وسائل الاعلام، ونضح C °. Resuspend الخلايا ليتم فرزها في 90 ميكرولتر من البرد العازلة غسل خلايا لكل 1 × 6 10. Resuspend في 100 ميكرولتر من العازلة غسل الباردة أنابيب سيطرة التعويض.
    6. إلى الخلايا ليتم فرزها، والجمع بين 2 ميكرولتر من مكافحة CD25-PE، 3 ميكرولتر المضادة للCD45RA-PE-Cy5 و 1 ميكرولتر المضادة للAPC-CD127 في 1 × 10 6 خلايا. إضافة الجسم المضاد لا لأنبوب تعويضات التحكم الأول، 2 ميكرولتر من مكافحة CD25-PE على أنبوب ثان، 3 ميكرولتر من CD45RA المضادة - PE-Cy5 إلى ميكرولتر 3 and1 أنبوب المضادة للAPC-CD127 إلى أنبوب الرابع. احتضان جميع الأنابيب على الجليد لمدة 45 دقيقة في الظلام.
    7. نضح العازلة وresuspend الخلايا بتركيز من 1 الخلايا × 7 10 في مل من غسل العازلة. إضافة 1،5 ميكرولتر من الثاني الدناز لكل مليلتر من الخلايا قبل ترشيح من خلال مصفاة ميكرومتر 40 خلية من النايلون. نقل الخلايا إلى جولة متعددة 5 مل أنابيب البولي بروبلين أسفل مع عدم وجود أكثر من 3.5 مل لكل أنبوب. Resuspend خلايا سيطرة التعويض في 300 ميليلتر من غسل العازلة.
    8. تعيين التعويض على تدفق عداد الكريات MoFlo للحد من كشف الصليب من APC، والمؤسسة العامة والمرشحات PE-Cy5. وضع بوابات لفرز iTregs (CD25 مرحبا CD127 -/LOW CD45RA - الخلايا)، ساذجة (CD25-CD45RA +) والذاكرة (CD25 - CD45RA -) خلايا تي في 5 مل جولة أنابيب البولي ستايرين أسفل يحتوي على 1 مل مصل العجل.

    5. قمع الفحص

    1. جعل supprوسائل الاعلام فحص ession بإضافة 100 وحدة / مل من البنسلين، 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين، 5 نانوغرام / مل من IL-2 و 2 نانوغرام / مل من TGF-V-β إلى الهدف.
    2. في يوم الفحص، تنقية CD4 + الخلايا التائية مغاير من معطف بوفي كما هو مبين في الخطوات 1 و 2. وستكون هذه الخلايا المستهدفة لفحص قمع و لا تحتوي على CD25 + الخلايا Treg، كما يمكن أن يرى في الشكل 2، يوم 0.
    3. خلايا التسمية مع عدة CellTrace وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، ما عدا استخدام فقط 1 ميكرولتر من 5 ملم حل سهم لكل مليلتر من الخلايا بدلا من ميكرولتر 2. الابتعاد عن الضوء المباشر، إضافة 18 ميكرولتر من DMSO التي قدمتها عدة CellTrace إلى واحد من قارورة CFSE لتقديم حل سهم 5 ملم. Resuspend العدد المطلوب من الخلايا المستهدفة (بحد أقصى 1 7 10 x) في جيش صرب البوسنة prewarmed + 0.1٪ (W / V) في برنامج تلفزيوني لتركيز النهائي من الخلايا 1 × 6 10 / مل. إضافة 1 ميكرولتر من CFSE 5 مم لكل مليلتر من الخلايا واحتضان في حمام ماء 37 درجة مئوية لمدة 5 minutوفاق. إضافة 5 مجلدات كاملة، RPMI الباردة الجليد مع FBS 10٪ لإرواء تلطيخ واحتضان على الجليد لمدة 5 دقائق. غسل خلايا أكثر مرتين مع RPMI كاملة الباردة وresuspend 1 × 10 5 خلايا لكل 100 ميليلتر من وسائل الاعلام فحص قمع.
    4. Treg الخرز مفتش قمع هي في تركيز مخزون من 2 × 10 7 حبات / مل. بيليه عدد من حبات يساوي العدد الكلي للخلايا لكل تجربة عن طريق الطرد المركزي بسرعة في أنبوب إيبندورف. تغسل حبات مرة واحدة مع RPMI وإعادة بيليه. بعد تطلع RPMI، الخرز resuspend بحيث كمية مناسبة من الخرز لكل بئر في 8 ميكرولتر من وسائل الاعلام فحص قمع.
    5. على 96 لوحة أسفل جولة جيدا زراعة الأنسجة، إضافة CFSE الملطخة الخلايا (1 × 10 5 خلية / مل)، والخرز مفتش وخلايا الاستقطاب وفرزها (1 × 10 5 خلية / مل) في وسائل الاعلام فحص جديد لقمع الهدف المنشود (الملون CFSE): المستجيب (مرتبة) نسبة في حجم نهائي من 200 ميكرولتر. يتم تعيين كافة الظروف في tripliكايتس.
    6. يعد الأول من شروط مراقبة 2 وذلك بإضافة 100 ميكروليتر من الخلايا الملون CFSE، 8 ميكرولتر من الخرز ومفتش 1 × 10 5 من الخلايا، طازجة غير ملوثين في 92 ميكرولتر المتوسطة فحص القامع لكل بئر. إعداد التحكم الثاني مع المكونات الخلوية نفسه كما سبق ولكن من دون Treg الخرز مفتش.
    7. تغطية لوحة في رقائق الألومنيوم واحتضان عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2 لمدة خمسة أيام.
    8. في الظلام، وجمع كل من الخلايا بشكل جيد من قبل pipetting ومكان في 5 مل جولة أسفل أنبوب البوليسترين. منبذة الخلايا في 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، ووسائل الإعلام نضح، وresuspend في نظام مراقبة الأصول الميدانية 300 بارد ميكرولتر غسل العازلة من الخطوة 4. تحليل أول 3 × 10 4 CFSE + الأحداث من بوابة اللمفاويات الحية التي تمثل الخلايا المستهدفة في رسم بياني مع برنامج كويست الخلية.

    6. ممثل النتائج

    مثال pseudocolor تدفق cytometric تنتشر المؤامرات على مدى فصول التوجيه الجامعي في الوقت لمدة خمسة أيامRSE التمايز iTreg الرصد على أساس نسبي شارك في التعبير عن CD25 مع FoxP3، يمكن أن ينظر CTLA-4 وCD45RA في الشكل 2. الرسم البياني في الشكل (3) يبين فحص قمع الناجحة التي تم فرزها iTregs (CD25 مرحبا CD45RA - CD127 الخلايا -/LOW). هي مجموعة فرعية فقط من ثقافة لمدة خمسة أيام أن اكتسب القدرة التنظيمية / القامع ويبين الشكل 4 تحريض Tregs من بين مجموعة تي خلية ساذجة (لوحات أعلى) والخلايا التائية تجمع الذاكرة (لوحات أسفل)، وبعد خمسة أيام الثقافة في المتوسط ​​iTreg القياسية. تلطيخ CFSE من الخلايا الأولية تبين أن الخلايا التائية إما ساذجة (لوحة أعلى اليمين) أو ذاكرة (لوحة أسفل اليمين) إلى التفريق iTregs (أعلى FoxP3 في التعبير عن الخلايا) إلا بعد عدة جولات من انقسام الخلية.

    الشكل 1
    الشكل 1. تخطيطي لإجراء التجارب. PBMCs ARه فصل من الدم المحيطي الإنسان عن طريق الطرد المركزي التدرج قبل اختيار سلبي المغناطيسي للCD4 + CD25 - خلايا تي. بعد خمسة وستة أيام في الثقافة، والخلايا تخضع لنظام مراقبة الأصول الميدانية وشارك في تحضين مع خلايا CFSE مغاير الهدف المسمى لقياس النشاط المكثف.

    الشكل 2
    الشكل 2 منقى CD4 + CD25 الإنسان الأساسية - يتم استزراع خلايا تي في iTreg المتوسط. ويتم جمع وقسامة من الخلايا فقط بعد عزلة (يوم 0) وعلى أيام 1 و 3 و 5 من خلية ثقافة إلى رصد التقدم المحرز في CD45RA، FoxP3، CTLA 4-وعلامات CD25. ملف iTreg يناظر CD45RA FoxP3 مرحبا، CTLA-4 مرحبا ومرحبا CD25 (سلط عليها الضوء في نافذة في والرسم البياني).

    الشكل (3)
    الشكل 3. تنقية CD4 + لا CFSEbeled يتم استزراع خلايا (1 × 10/5 أيضا) مع Treg الخرز مفتش قمع في ظل وجود فرز الخلايا السذاجة، أو ذاكرة iTreg (3 × 10/4 أيضا). بعد خمسة أيام، ويتم حصاد الخلايا ويتم تحليل الشخصية CFSE من الخلايا الملون بواسطة التدفق الخلوي. وجود خلايا iTreg يلغي تماما انتشار خلايا CD4 + T. تدل الأرقام على النسبة المئوية للخلايا CFSE المسمى التي خضعت لتقسيم.

    الشكل 4
    الشكل 4 منقى الأولية الساذجة الإنسان. (CD4 + CD25 - CD45RA +) والذاكرة (CD4 + CD25 - CD45RO +) وملطخة الخلايا التائية مع CFSE ومثقف في iTreg المتوسط. بعد خمسة أيام، يتم phenotyped الخلايا وقدرت معدلات انقسام الخلايا. كما هو مبين في الشكل 2، وفرعية iTreg متباينة من كل من المجموعات الفرعية يناظرCD45RA - CD25 مرحبا مرحبا FoxP3 وCTLA-4 مرحبا (الأخيران لا تظهر). مقارنة ملامح تلطيخ CFSE تحديد iTregs (هنا كما أعلى معربا عن FoxP3 خلايا تي) والخلايا معظم التكاثري خلال ثقافة لمدة خمسة أيام.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    في حين نقل Treg يحمل وعدا العلاجية الهائلة في مجال مكافحة الكسب غير المشروع الرفض المناعة الذاتية وغيرها من الاضطرابات المناعية أو التهابات بوساطة، وأساليب لجيلهم كفاءة وصيانة مستقر حتى الآن لم يتم تطويرها. كما 1-5٪ فقط من تعميم خلايا تي هي Tregs، توسعها للرقابة والمفاضلة يتغلب على هذه ندرة رادعا رئيسيا لتنفيذ Tregs إلى العيادات الطبية. من ناحية أخرى، كما تعلمنا من تجربة TGN1412 13، فمن الضروري علميا وأخلاقيا إلى فهم عميق للأحداث الجزيئية التي تنسق خلية القرارات تي مصير الإنسان قبل تنفيذ أي نظام علاجي. مع هذا الأسلوب من iTreg التمايز، السكان الناتجة من السذاجة خلايا الذاكرة،، تي المستجيب وiTregs تسهيل التعبير الجيني أو المقارنات الفنية بين السكان من الخلايا التي تستمد من واحدة من الجهات المانحة الإنسان الدموية المحيطية. في ايدينا، وكانت الخلايا مرتبةمقارنة في ميكروأري وqRT-PCR التحليلات لقياس التغيرات الجينية، في البقع الغربي لدراسة الأحداث الرئيسية مما يشير، أو في رقعة حملتها لقياس وظيفيا أيون استخدام قناة 14.

    نظامنا يوفر فائدة إضافية تتمثل في القدرة على التعامل مع الجوانب الرئيسية لعملية التمايز حول إطار المركزية وقراءات. وبالتالي، يمكن للمرء أن مرحلة ما قبل الفرز PBMCs لتغيير سكان المدخلات من الخلايا أو تشمل مثبطات جزيء صغير وبروابط للثقافة المتوسط. يمكن للمرء أيضا transfect الخلايا إلى overexpress أو هدم البروتين في المصالح أو إدخال مراسل بناء. وكفائدة إضافية، يمكننا تغيير شروط ثقافة لتعظيم نسبة iTregs ولدت. وعموما، هذا الإنسان الخلايا التائية الأولية ثقافة يحدد منصة قوية جدا تجريبية مع أهميتها الفسيولوجية أكبر بكثير من تلك التي تم إنشاؤها في أنظمة الفئران. الأهم من ذلك، فإنه قد تحمل أيضا قيمة علاجية مباشرة. في الواقع، كما MOSتي الحالي Treg النهج القائمة على إشراك العلاجية في المختبر أو بحكم تطور الجسم الحي أو التلاعب في الخلايا، يمكن أن ينظر نظامنا كقناة هامة على الطريق نحو إدراج Treg العلاج بالخلايا في مستوى الرعاية. سوف التوسعات المستقبلية على هذا النظام خياط Tregs لتصبح تفعيلها على اللقاء مع محددة في مولدات المضادات للالتهابات الجسم الحي بدلا من تفعيل بولكلونل وصفها.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

    Acknowledgements

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Lymphoprep Axis-Shield 1114547 Keep at room temperature
    Refrigerated Bench-Top Centrifuge Eppendorf 5810R
    Bright-Line Hemocytometer Hausser Scientific 3110
    EasySep Human CD4+ T Cell Enrichment Kit Stem Cell Technologies 19052
    EasySep Human Memory CD4+ T Cell Enrichment Kit Stem Cell Technologies 19157
    EasySep Human Naïve CD4+ T Cell Enrichment Kit Stem Cell Technologies 19155
    The Big Easy EasySep Magnet Stem Cell Technologies 18001 Silver
    5 mL Round Bottom Polystyrene Tubes BD Biosciences 352008
    15 mL Polypropylene Centrifuge Tubes VWR international 89004-368
    14 mL Polypropylene Round-Bottom Tubes BD Biosciences 352059
    50 mL Polypropylene Centrifuge Tubes VWR international 89004-364
    Human anti-CD3 Antibody Bio X Cell BE0001-2 Clone: OKT3
    24 Well Cell Polystyrene Culture Plate BD Biosciences 353047
    96 Well Round Bottom Tissue Culture Plate Greiner Bio-One 650180
    RPMI 1640 with Glutamax-I and HEPES Buffer GIBCO, by Life Technologies 72400
    Fetal Bovine Serum (FBS) GIBCO, by Life Technologies 16000
    β-Mercapt–thanol Sigma-Aldrich M7522
    Recombinant Human TGF-β1 eBioscience 14-8348-62
    Recombinant Human IL-2 eBioscience 14-8029-63
    Bovine Serum Albumin (BSA) MP Biomedicals 810531
    0.5 M EDTA Amresco E177
    Mouse Anti-Human CD25-PE Miltenyi Biotec 130-091-024 Clone: 4E3
    Mouse Anti-Human CD45RA-PE-Cy5 eBioscience 15-0458-42 Clone: HI100
    Mouse Anti-Human CD127-APC Miltenyi Biotec 130-094-890 Clone: MB15-18C9
    DNase II MP Biomedicals 190370
    MoFlo Flow Cytometer Beckman Coulter Inc.
    FlowJo Software Tree Star, Inc.
    Cell Quest Pro Software BD Biosciences
    Newborn Calf Serum GIBCO, by Life Technologies 16010
    L-glutamine GIBCO, by Life Technologies 25030
    AIM-V GIBCO, by Life Technologies 0870112
    CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit Invitrogen C34554
    Treg Suppression Inspector Beads Miltenyi Biotec 130-092-909
    Penicillin-Streptomycin GIBCO, by Life Technologies 15140
    40 μM Nylon Cell Strainer BD Biosciences 352340

    References

    1. Powrie, F., Correa-Oliveira, R., Mauze, S., & Coffman, R.L. Regulatory interactions between CD45RBhigh and CD45RBlow CD4+ T cells are important for the balance between protective and pathogenic cell-mediated immunity. The Journal of Experimental Medicine. 179, 589-600 (1994).
    2. Tarbell, K.V., et al. Dendritic cell-expanded, islet-specific CD4+ CD25+ CD62L+ regulatory T cells restore normoglycemia in diabetic NOD mice. The Journal of Experimental Medicine. 204, 191-201 (2007).
    3. Morgan, M.E., et al. Effective treatment of collagen-induced arthritis by adoptive transfer of CD25+ regulatory T cells. Arthritis and Rheumatism. 52, 2212-21 (2005).
    4. Taylor, P.A., Lees, C.J., & Blazar, B.R. The infusion of ex vivo activated and expanded CD4(+)CD25(+) immune regulatory cells inhibits graft-versus-host disease lethality. Blood. 99, 3493-9 (2002).
    5. Ziegler, S.F. FOXP3: of mice and men. Annual Review of Immunology. 24, 209-26 (2006).
    6. Riley, J.L., June, C.H., & Blazar, B.R. Human T regulatory cell therapy: take a billion or so and call me in the morning. Immunity. 30, 656-65 (2009).
    7. Morgan, M.E., et al. Expression of FOXP3 mRNA is not confined to CD4+CD25+ T regulatory cells in humans. Human Immunology. 66, 13-20 (2005).
    8. Wang, J., Huizinga, T.W.J., & Toew, R.E.M. De Novo Generation and Enhanced Suppression of Human CD4+CD25+ Regulatory T Cells by Retinoic Acid. Journal of Immunology. 183, 4119-26 (2009).
    9. Hori, S., Nomura, T., & Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science (New York, N.Y.). 299, 1057-61 (2003).
    10. McHugh, R.S., et al. CD4(+)CD25(+) immunoregulatory T cells: gene expression analysis reveals a functional role for the glucocorticoid-induced TNF receptor. Immunity. 16, 311-23 (2002).
    11. Takahashi, T., et al. Immunologic Self-Tolerance Maintained by Cd25+Cd4+Regulatory T Cells Constitutively Expressing Cytotoxic T Lymphocyte-Associated Antigen 4. The Journal of Experimental Medicine. 192, 303-310 (2000).
    12. Liu, W., et al. CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells. The Journal of Experimental Medicine. 203, 1701-11 (2006).
    13. Schraven, B. & Kalinke, U. CD28 superagonists: what makes the difference in humans? Immunity. 28, 591-5 (2008).
    14. Reneer, M.C., et al. Peripherally induced human Regulatory T cells uncouple Kv1.3 activation from TCR-associated signaling. European Journal of Immunology. doi: 10.1002/eji.201141492 (2011).

    Comments

    0 Comments

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter