Kemisk blokeret antistof Microarray for Multiplexed Højkapacitetsforskning Profilering af specifikke protein Glycosylering i komplekse prøver

1. Udskrive en Antistof Microarray for assayet

1. Fortyndes alle antistoffer til 0,5 mg / ml i phosphatbufret saltvand, pH 7,2 (PBS).
2. Portion 40 ul af hvert antistof i 384-brønds kilde plade.
3. Læg 384-brønds source plade på Scienion sciFLEXARRAYER microarrayer.
4. Læg 20 PATH microarray glider på microarrayer som mål.
5. Indstille microarrayer at udskrive 48 identiske subarrays, hvor 27-antistoffer og kontrol proteiner plettede in triplo i en 9x9 mønster (fig. 1E, 1F).
6. Start microarrayer at udskrive de antistof microarray dias.
7. Saml antistof microarray dias, og gemme dem i dias kassette med tørremiddel. Vakuumtætning kassetten i en plastpose ved hjælp vakuum sealer (Foodsaver).
8. Lagring af de forseglede microarray objektglas ved 4 ° C i køleskab.

2. Kemisk Bloker Antibody Microarray til forebyggelse GBPBinde til indfangnings-antistoffer

Den microarray-analysen starter, når microarray dias er kemisk blokeret og varer cirka 8 timer. Når startede microarray-analysen er afsluttet (trin 2 til 8).

1. Tage mikroarray glider ud af køleskabet, og ækvilibrering dem til stuetemperatur i 30 minutter.
2. Fjerne objektglasset fra opbevaringskassen og kortvarigt skyl dem i phosphatpuffersaltopløsning pH 7,2 med 0,1% Tween 20 (PBST0.1) en gang i et objektglas håndvask, og derefter i 15 mM natriumacetatpuffer pH 5,0 med 0,1% Tween (CBT0 0,1) i en sekventiel måde. Inkubér objektglassene i CBT0.1 i 10 minutter i slide håndvask.
3. Forbered frisk 150 mM NaIO ₄ i 15 mM natriumacetat pH 5,0 (CB), og holde den i ind i et dias håndvask i et køleskab og samtidig undgå lys før brug.
4. Fjern dias fra CB, og sætte det ind i bassinet med frisk NaIO ₄ med antistoffet sideopad. Omfatte vask med aluminiumfolie for at undgå lys, og inkuber glideren bassinet i 2 timer under forsigtig omrystning ved 4 ° C i et køleskab.
5. Fremstille 300 ml af 10 mM hydrazid glutaminsyre (blokerings) i CB.
6. Fjern dias fra bassinet, og kort skyl den i CB 3 gange i 5 minutter hver gang i slide håndvask.
7. Glassene inkuberes i blokker i en håndvask i 2 timer ved stuetemperatur med forsigtig rystning.
8. Fjern dias fra bassinet, og vask dem med PBST0.1 i 3 minutter.

3. Blokere ikke-specifikke bindinger på mikroarrayet med bovint serumalbumin (BSA)

1. Fremstille 300 ml af 1% BSA i phosphatbuffer saltvand, pH 7,2 med 0,5% Tween (PBST0.5) i et objektglas håndvask, og inkuber mikroarrayet objektglasset i bassinet i 1 time ved stuetemperatur med forsigtig omrystning.
2. Skyl objektglassene i PBST0.1 tre gange i 3 minutter hver gang.
3. Sæt slidepå et objektglas stativ, og centrifugering ved 1200 xg i en centrifugering i 2 minutter for at tørre den mikroarray objektglasset.

4. Imprint Wax Grid på Microarray Slide at adskille de enkelte undergrupperingen

1. Forvarmning af voks imprinter ved 70 ° C i 5 minutter.
2. Læg den blokerede microarray glide ind i voks imprinter med antistof opad til voks. Træk forsigtigt i håndtaget til aftryk voks på slide jævnt.

5. Anvendelse Serumprøver på mikroarrayet Slide

1. Under Trin 2,4, forberede serumprøver for enten Glyco profilering analysen i en prøve (5.1.1), eller en enkelt Glyco epiptope måling blandt flere prøver (5.1.2).
   1. I et eksperiment for glycan profileringer af multiple serumglycoproteiner i en serumprøve ved hjælp af flere Euros (se eksempel eksperiment 1), vil et serumprøver påføres på alle subarrays. I dette tilfælde er 40 pi serum rigelig fortyndet i 360 ul PBS indeholdende 0,1%Tween-20, 0,1% Brij 35, 100 ug / ml muse IgG, 100 ug / ml rotte IgG, 100 ug / ml kanin-IgG, 100 ug / ml gede-IgG og 100 ug / ml æsel IgG. Denne mængde er tilstrækkelig til at anvende 6 ul fortyndet serum opløsningen på hver undergrupperingen.
   2. I et eksperiment for den glycan måling af flere serumproteiner mellem flere serumprøver ved anvendelse af en GBP detektioner (se eksempel eksperiment 2). I dette tilfælde er en pi serum rigelig fortyndet i 9 pi PBS indeholdende 0,1% Tween-20, 0,1% Brij 35, 100 ug / ml muse IgG, 100 ug / ml rotte IgG, 100 ug / ml kanin-IgG , 100 ug / ml gede-IgG og 100 ug / ml æsel IgG. Denne mængde er tilstrækkelig til at anvende 6 pi fortyndet serum opløsningen på hver undergrupperingen.
2. Efter voks aftryk i trin 4, omhyggeligt gælder 6 pi fortyndet prøve eller kontrolprøver (PBST0.1) til hver undergruppering af dias. Inkuber slæden i en fugtig kassette med våde papirhåndklæder ved stuetemperaturi 1 time.
3. Skyl objektglasset med PBST0.1 tre gange i 3 minutter hver gang.
4. Tør dias ved spinding den ved 1200 xg i 2 minutter.

6. Anvend Biotinyleret GBP (Lectin eller Anti-glycan antistof) på Slide

1. Under trin 2.4, forbereder 10μg/ml af biotinylerede lectiner / Gbps i PBST0.1.
   1. I glycan profilering eksperiment som probe én prøve med flere lectiner (prøve eksperiment 1), fremstilling 350 uL af biotinyleret lectin, som er tilstrækkelig for alle subarrays.
   2. I én glycan epitop / biomarkør screening i multiple prøver ved hjælp af flere lectiner, fremstilles 10 ul af hver biotinyleret lectin, som er tilstrækkelig for en undergruppering.
2. Anvendelse 6 pi af fortyndet biotinyleret lectin (er) til hver undergrupperingen af ​​slæden, og inkubér i befugtet objektglasset kassen med våde papirhåndklæder ved stuetemperatur i 1 time.
3. Skyl objektglassene med PBST0.1 tre gange i 3 minutter hver Timig.
4. Tør objektglasset ved centrifugering den ved 1200 xg i centrifuge for 2 minutter.

7. Anvendelse farvestofmærkede NeutrAvidin til fluorescenspåvisning

1. Forberede 350 pi Dylight 549 mærket NeutrAvidin som er tilstrækkelig for alle subarrays.
2. Anvendelse 6 pi Dylight 549 mærket NeutrAvidin på hver undergrupperingen og inkuber glideren i befugtet objektglasset kassetten ved stuetemperatur i 1 time.
3. Skyl objektglasset med PBST0.1 tre gange i 3 minutter hver gang.
4. Tør dias ved at dreje den ved 1200 xg i centrifuge i 2 minutter.

8. Få Microarray Slide billede ved at skanne Slide

1. Scan dias ved hjælp af en fluorescens microarray scanner på 10 um opløsning. De laser-og PMT-indstillinger skal være så stærk som muligt, men ingen mætning stedet observeres.

9. Dataudtræk og analyse

1. Åbn billedet i ArrayPro 3,2. Nedsat arrayet skabelonen ifølge arrayet kort, der viser antistof-spots steder. Omhyggeligt tilpasse hver skabelon cirkel på den tilsvarende sted i billedet.
2. Uddrag intensiteten af ​​hver plet i en Excel-fil til yderligere analyse.

10. Repræsentative resultater

Prøven Eksperiment 1

Glykosylering profilering af flere serumglycoproteiner i hepatocellulært carcinom patientserum prøve ved hjælp af kemisk blokeret antistof microarray med flere lektiner detektion.

Formålet med dette eksperiment er at undersøge den individuelle glycosylering profil 20 glycoproteiner i hepatocellulært carcinom (HCC) patientserum prøve ved anvendelse af kemisk blokeret antistof mikroarray med lectin detektion. Et antistof microarray, der indeholder 48 identiske subarrays, som omfatter 26 antistoffer og biotin-BSA, er designet og fremstillet som beskrevet i STEP 1. Disse 26 antistoffer var mod 20 serumglycoproteiner, der er identificeret som lovende tidlig diagnose værdi for HCC patienter ved hjælp af lectin-baseret immunopræcipitation kombineret med massespektrometrisk proteinidentifikation ^{12, 32} som vist i tabel 1. Mønsteret og arrangementet af de antistof pletter trykkes in triplo i et repræsentativt undergrupperingen er vist i Figur 1E og 1F, hhv. To identiske microarray objektglas, én var ikke kemisk blokeret (fig. 1A), mens den anden blev (figur 1B), blev anvendt til at udføre den samme glycosylering profilering eksperiment for at påvise betydningen af kemisk blokering procedure til analyse. For kemisk blokeret slæde (figur 1B), begyndte eksperimentet ved trin 2, for ingen kemisk blokeret slæde (figur 1A), begyndte eksperimentet fra trin 3. Eksperimentet blev udført ved following alle de skridt, der er beskrevet i protokollen, bortset fra trin 5.1.2 og 6.1.2. I trin 5.2 blev en PBST0.1 kontrolprøve påført subarrays i kolonne 1 og 3, og en samlet HCC serumprøve blev påført subarrays i kolonne 2 og 4, henholdsvis (som vist i figur 1G). Denne sammenligning er at vise effektiviteten af ​​fremgangsmåden, samt antigenbindingsaffinitet af antistofferne efter kemisk blokering. 22 biotinylerede lectiner (som vist i tabel 1), der er specifikke for forskellige glycaner ^{18, 20} blev anvendt på hver undergrupperingen som vist i figur 1G for glycosylering profilering. Billeder af de kemisk blokeret (fig. 1B) og ikke-kemisk blokeret (fig. 1A) microarrays efter glycosylering-profileringsassay ved at følge protokollen. Som vist i subarrays i kolonne 1 og 3 i ikke-kemisk blokeret mikroarrays (figur 1A og figur 1C), somKun PBST0.1 blev anvendt fleste lectiner bundet til indfangnings-antistoffer og viste meget høj baggrund, der kan sammenlignes med dem subarrays i kolonne 2 og 4, hvor serumprøven blev anvendt. Det er umuligt at få glycan profil oplysninger fra dette microarray dias. Tværtimod, når det samme forsøg blev udført på en kemisk blokeret antistof mikroarray glider de subarrays i kolonne 1 og 3, som kun PBST0.1 blev anvendt fleste lectiner udviste ingen eller meget lav bindinger at indfange antistoffer, mens høj-antigen bindinger blev stadig observeret i subarrays i kolonne 2 og 4, hvor serumprøven blev påført (fig. 1B og 1D). Disse Resultatet viste, at kemisk blokering af proceduren var et afgørende skridt forgrunden måling af glycaner på antistof-tilfangetagne glycoproteiner. Ved at følge protokollen, kan glycosylation profiler af 22 glycoproteiner i HCC serum opnås.

Eksperiment 2

Skærm for ændrede fucosylation på specifikke serumglycoproteiner som biomarkører til diskrimineret levercirrose og hepatocellulært carcinom patienter.

Målet med dette eksperiment er at screene for ændret fucosylering om bestemte serumglycoproteiner som biomarkører, som diskriminerer levercirrose og hepatocellulært carcinom (HCC) patienter. Forskellig fra eksperiment 1, hvori kun én serumprøve blev anbragt på hver subarrays og probet med forskellige lektiner, i dette assay, i alt 40 forskellige serumprøver fra HCC og cirrhose patienter blev påført hver undergrupperingen og probet med et lectin (AAL ). Statistisk analyse, såsom T-test, modtager-operating characteristic (ROC) kurve, blev udført for at evaluere fordelingerne eller diagnostisk ydeevne glycan epiptope / biomarkør for hvert enkelt protein i alle serumprøver. Vi anvendte det samme antistof mikroarray fremstillet i forsøg 1, bortset fra anti-CA19-9-og anti-Lewis X-antistoffer i denne undersøgelse. Den ekspertiseiment blev gennemført fra september 2 til trin 9 med undtagelse af Step 5.1.1 og 6.1.1. I alt 40 serumprøver fra 20 skrumpelever og 20 HCC patienter blev anvendt tilfældigt undergrupperingen af ​​de 48 subarrays sammen med de kontrol PBS prøver som negativ kontrol. Fucosylering af hver af de indfangede proteiner blev derefter detekteret ved hjælp af biotinyleret Fucose-specifik lectin. Mikroarrayet billede vist i figur 1 viste lectin AAL kun bundet til serumproteiner fanget på mikroarrayet (fig. 2D) i stedet for indfangede antistoffer (figur 2E). AAL bindende intensiteter af alle de steder blev derefter ekstraheret, og analyseres ved hjælp af T-test og ROC kurver at evaluere resultaterne af fucosylering (AAL binding intensitet) af hvert serum protein på forskelsbehandling mellem HCC og skrumpelever grupper. Resultaterne viste, at fucosylering af GP73 protein gav den bedste forskelsbehandling mellem de to grupper med en p = 0,03 og areal-under-kurve ROC-kurven er lig med 0,72. Dette eksperiment viste denne fremgangsmåde er en hurtig, effektiv fremgangsmåde til glycan epitop / biomarkør screening af flere prøver i adskillige proteiner.

Tabel 1. Liste over lectiner og antistoffer, der anvendes i denne protokol.

Tabel 2 nedenfor. Listaf udstyr og reagenser, der anvendes i denne protokol.

Skema 1 En ordning viser lectin antistoffet mikroarray baseret glycan biomarkør opdagelse fremgangsmåde 1 (Trin 2 til 4): Blokering af antistoffet mikroarray med blokker (Glu-hydrazid) og BSA, 2 (trin 5).. Anvendelse serumprøver og indfange specifikke glycoproteiner med specifikke antistoffer, 3 (Trin 6): anvendelse biotinyleret lectin (er), 4 (trin 7): Probe det biotinylerede AAL med Dylight 549 mærket NeutrAvidin for mikroarray billeddannelse.

Figur 1. Microarray billeder af prøven Eksperiment 1 glycosylering profilering af multiple serumglycoproteiner i HCC patient serumprøve ved hjælp chemicallierede blokeret antistof mikroarray med multiple lectin detektion. To identiske microarray objektglas (A) ingen kemisk blokeret eller (B) kemisk blokeret som beskrevet i trin 2, begge gik gennem alle trin fra 2 til 9 til glycosylering profilering samt sammenligningsformål. (A) og (B) er microarray billederne scannes på trin 8 i en opløsning på 10 mikron. (C) zoom i billedet af de to første rækker af ingen kemisk blokeret microarray slide (A), (D) zoom i billedet af de to første rækker ikke kemisk blokeret microarray slide (B)), (E) diagrammet af antistoffet arrangementet i hvert undergrupperingen (f) array kort: placeringen af ​​hvert antistof i undergrupperingen, hvert antistof navn repræsenterer 3 pletter (G) serumprøve og lectin placering: Et diagram viser, hvilke undergrupperingen hver serumprøve og lectin blev påført på.

Figur 2. Microarray billeder afPrøven eksperiment 2 skærm til ændret fucosylering om bestemte serumglycoproteiner som biomarkører, som diskriminerer levercirrose og HCC patienter. Mikroarrayet Assayet blev udført som beskrevet i Eksempel Eksperiment 2 sektion. (A) Hele lysbillede af mikroarray objektglasset fra trin 8 (B) diagram af antistoffet arrangementet i hvert undergrupperingen, (C) array-kort: placeringen af ​​hvert antistof i undergrupperingen, hvert antistof navn repræsenterer 3 pletter; (D) en zoom-in billede af en undergruppering der blev inkuberet med serum-prøve (E) en zoom-in billede af en undergruppering der blev inkuberet med PBS-kontrol.

Figur 3. Glycan profilanalyser fra prøven eksperiment 1. Hver søjlegraf repræsenterer lectin binding profil (eller glycan profiler) ifølge et af de 20 testede protein. Alt 22 forskellige lectiner blev benyttet til at analysere the glycan profil af hvert protein.

1. Target protein og capture Antibody Selection

Forud for antistoffet mikroarray assayet nogle reagenser og materialer for at blive betragtet og fremstilles. At designe et antistof microarray for glycan profilering eller glycan biomarkør screening, et panel af antistoffer specifikke for glycoprotein ansøgere skal fastlægges i henhold til litteraturen eller fra tidligere resultater. Disse antistoffer var normalt købt fra forskellige leverandører, såsom R & D Systems mv IgG foretrækkes indfangningsantistoffer forhold til vores tidligere tests viste, at nogle IgM og IgE helt kan miste deres antigen bindingsaffiniteter efter kemisk modifikation.

2. Design og fremstilling af antistof microarray

Fremstilling af antistoffet microarray er et valgfrit trin, som kræver professionel og dyre microarrayer, og vel-uddannet personale til drift. Men tilpasset antistof microarray fremstiltur kan let udføres fra en tjenesteudbyder, såsom Serome Biosciences Inc. For en robust resultat, anbefales en berøringsfri microarrayer, såsom Scienion sciFLEXARRAYER ultralav volumen berøringsfri microarrayer der blev anvendt i vores antistof mikroarray fremstilling. Høj bindingskapacitet microarray lysbilleder, såsom PATH (Gentel Bio Inc. WI) eller Slide H (Shott, PA).

3. Vælg og Forbered glycan proteiner (Gbps) for glycosylering profilering

Euros målet forskellige mono-eller oligosaccharider kan findes i litteraturen og gennem en søgemaskine udviklet af Haab laboratoriet ²⁹ og holdes på det translationelle Genomics Institute At vælge Euros med høj specificitet og affinitet tilde målrettede glycan epitoper, vælge motiv (epitop) fra drop down menuen, og klik på "søg". Den Euros specifikke for dette motiv (epitop) vil blive opført i henhold til deres logP værdi fra høj til lav orden. Højere logP angiver en stærkere bindingsaffinitet og specificitet til glycan motiv / epitop. Grund af den iboende ikke-specifik binding emne fra lectin, er denne fremgangsmåde stadig ikke så optimalt som antistoffet assay. Derfor anbefaler vi, at anti-glycan antistoffer anvendes, såsom anti-Lewis X eller anti-sialyl Lewis nogle antistoffer, hvis de er tilgængelige. Anvendelse af flere Euros for detektion er en anden strategi til at krydstjekke forskellige bindende profiler og for at få pålidelige bindende data.

4. Dataanalyse

Fordi denne fremgangsmåde anvendes til at detektere native serumproteiner, kan protein-protein-komplekser kan indfanges og detekteres. Western blot eller massespektrometri er gode metoder at validere microarray data. I mellemtiden, Detektion af protein-niveauer ved hjælp af samme mikroarray er en anden metode til at lære detaljerne i glycosylering ændring af proteinet, såsom hvorvidt ændringer var på grund af det totale proteinindhold ændring eller blot at glycosylering niveau forøges på hver af proteinerne.