Una pantalla genética para aislar Toxoplasma gondii Célula huésped-mutantes Egress

Información general

Protocolos se proporcionan para definir primero la dosificación de la mutágeno que conduce a una matanza 70% de los parásitos (protocolo 1). El siguiente procedimiento se ofrece para enriquecer los mutantes inducidos por el egreso de un grupo mutagenizado parásito (el protocolo 2, Figura 2). Esto es seguido por un protocolo para probar la incidencia de los mutantes de egreso en la piscina enriquecido, o para validar el fenotipo de salida en los mutantes individuales (protocolo 3). Finalmente, un protocolo se proporciona para generar clones individuales de parásitos de poblaciones enriquecidas por dilución limitante (protocolo 4).

1. La titulación de mutágeno

Tenga cuidado especial, como guantes dobles, cuando se trabaja con compuestos altamente mutagénicos y líquidos. Recoger los desechos líquidos por separado para su correcta eliminación.

1. Inocular T25 frascos de cultivo de tejidos confluentes con fibroblastos de prepucio humano (HFF), las células con 1 ml de taquizoitos lisadas y crecer 18-25 horas a 37 °; C bajo 5% de CO ₂ en Ed1 medio (D-MEM suplementado con inactivado por calor 1% de suero fetal bovino, 0,2 mM de L-glutamina, 50 U / ml de penicilina, estreptomicina 50 mg / ml, y 0,25 g / ml de anfotericina B ). Véase Roos et al. para el crecimiento general y los medios de comunicación de las células HFF y parásitos ^21.
2. Reemplazar con 10 ml de medio de 0,1% de suero bovino fetal medio (diluido 1:10 Ed1 en D-MEM) y dejar en humidificado incubadora a 37 ° C por debajo del 5% de CO ₂ (denominado "37 ° C incubadora" de aquí en adelante) durante 10 minutos .
3. Añadir 0, 12,5, 25, 50, 100 o ENU l (1 archivo M en DMSO) o SEM (1 archivo M en DMSO) por frasco (diluciones mutágeno de trabajo será 1,25, 2,5, 5, y 10 mM, respectivamente). Añadir DMSO a 100 l por cada matraz. Incubar durante 4 horas en una incubadora a 37 ° C.
4. Lavar tres veces durante 10 segundos a temperatura ambiente mediante enjuague la monocapa con 10 ml de PBS frío (pre-enfriado a 4 ° C).
5. Añadir 5 ml de PBS, raspe la monocapa de suelta con una espátula de caucho (células scraper), pasar las células tomadas por raspado a través de una aguja de 26,5 g para eliminar físicamente al parásito de los fibroblastos (clip del eje fuera de la aguja con unas tijeras de trabajo pesado para no exponer a la aguja), y el filtro de 3,0 micras filtro de policarbonato. Pasajes múltiples agujas aumentará la eficacia de la liberación de los parásitos de la célula huésped.
6. Contar el parásito concentración utilizando un hemocitómetro. Deje que los parásitos se conforme con 5 minutos en el hemocytomer antes del conteo.
7. Diluir los parásitos a 10.000 parásitos por 3 ml de ED1 (de 10 ml 33.333 parásitos son necesarios).
8. Se inoculan un pocillo en una placa de 6 pocillos con 3 ml de los parásitos diluidas (que contiene 10.000 parásitos). Serie diluir los parásitos de 10 veces más de 3 pozos en un confluente placa de 6 pocillos con células HFF que contienen 2,7 ml Ed1 mediante la transferencia de 300 l del primer pozo. Deja placas vírgenes en la incubadora a 37 ° C durante 7 días.
9. Aspirar medio, fijar 15 minutos con 3 ml / pocillo etanol 100%, manchacon 3 ml / pocillo solución violeta cristal (12,5 g de cristal violeta en 125 ml de etanol se mezcla con 500 ml de oxalato amónico al 1%) durante 15 minutos, enjuague con 3 ml / pocillo de PBS (1 minuto) y aire seco. Todo a temperatura ambiente.
10. Contar placas y seleccionar concentración del mutágeno necesaria para lograr una supervivencia de 30% de los parásitos expuestos (70% de destrucción de dosificación: véase la Figura 1). Una dosis de 70% de muerte se ha utilizado históricamente ¹⁴ e indujo a menos de 100 mutaciones puntuales por genoma (Farrell, Marth, Gubbels et al., Manuscrito presentado).

2. Enriquecimiento de mutantes salida (Figura 2)

1. Realizar mutagénesis como se ha descrito anteriormente, utilizando una dosis mutágeno inducir 70% matanza. Crece la población mutado por un pasaje en un nuevo frasco de las células huésped.
2. Infectar a un T25, HFF confluentes frasco de cultivo de tejidos con 120.000 recién parásitos lisados ​​de una población mutado en 10 ml Ed1. Incubar durante 2 horas en una incubadora 35 ° C bajo 5% de CO2 y húmeda (en adelante denominado "incubadora de 35 ° C").
3. Aspirar medio y enjuague de 10 segundos con 10 ml de PBS frío y luego añadir 10 ml Ed1 medio suplementado con 25 mg / ml de sulfato de dextrano (DS) ^13. Incubar durante 26 horas en una incubadora de 40 ° C por debajo del 5% de CO ₂ y humidificado (en adelante denominado "incubadora de 40 ° C").
4. Prepare la solución de trabajo de los potenciadores de salida. Diluir el inductor de salida de elección en la concentración de trabajo en un tubo Falcon de 15 ml que contenía 10 ml HBSSc suplementado con 25 mg / ml de DS. Pre-caliente las diluciones de 30 minutos en un baño de agua a 37 ° C. Ver Tabla 1 para las concentraciones de trabajo.
5. Aspirar medio de los matraces infectados por el parásito y añadir pre-calentado solución inductor de salida. Incubar en la incubadora a 37 ° C durante los tiempos indicados en la Tabla 1.
6. Aspirar medio y enjuague de 10 segundos con 10 ml de PBS frío y luego añadir 10 ml Ed1 suplementado con 25 mg / ml y DS 50 mM pirrolidina ditiocarbamato (PDTC: anunciod 5 l de 100 mM de archivo PDTC en PBS) ^13. Incubar 5 horas en una incubadora 35 ° C.
7. Aspirar a medio y enjuague de 10 segundos una vez con 10 ml de PBS (temperatura ambiente) y, a continuación añadir 10 ml Ed1 medio. Ponga frascos de nuevo en la incubadora de 35 ° C hasta que los parásitos destruyen la monocapa: matraces de agitación diaria. Esta recuperación toma alrededor de 7 días.

3. La validación de fenotipos mutantes mediante ensayos de egreso

Después de realizar la pantalla de enriquecimiento y crecimiento de la población enriquecida por un pasaje en células HFF, los fenotipos necesitan ser confirmados por un ensayo de salida ^11,13. Este ensayo también se debe utilizar para validar los clones individuales después del Protocolo n º 4.

1. Inocular 20.000 parásitos por pozo en una placa de 24 pocillos que contenía células confluentes cultivadas en cubreobjetos HFF (1 ml Ed1 medio por pocillo). Incubar 8 horas en una incubadora 35 ° C y después transferir en una incubadora 40 ° C durante 24 hrs.
2. Lavar con 1 ml / pocillo de PBS (10 segundos a temperatura ambiente). Añadir 1 ml inductores de egreso (incluye un solo DMSO control negativo), pre-calentado y se diluye en HBSSc e incubar durante los tiempos que se describen en la Tabla 1.
3. Aspirar medio y fijar con 1 ml / pocillo de metanol al 100% durante 15 min a temperatura ambiente.
4. Si los parásitos de padres que expresan una proteína autofluorescente fueron utilizados para la mutagénesis, vaya al paso # 3.5 ^13. Si no fluorescentes parásitos que expresan la proteína se utiliza como línea principal, mancha los cubreobjetos fijos con Diff-Quick teñir durante 1 minuto a temperatura ambiente ^11.
5. Lavar 5 minutos con 1 ml / pocillo de PBS en la placa de 24 pocillos a temperatura ambiente.
6. Para los parásitos que expresan proteínas fluorescentes: enjuagar rápidamente el cubreobjetos en _ddH2O (inmersión) y montar en las diapositivas en gelmount para proteger la señal de fluorescencia. Para Diff-Quick parásitos manchadas, lavar 10 segundos en el 100% de etanol y dejar secar al aire antes de montar en la diapositiva.
7. Utilizando un microscopio (fluorescencia) con un40-60x objetivo contar el porcentaje de vacuolas egresados ​​frente a las vacuolas que permanecían intracelular (ver Figura 4).

4. Clonar mutantes de egreso por dilución límite

Después de la validación del fenotipo de la población enriquecida de salida mutante utilizando el protocolo de 3, la población policlonal tiene que ser clonados para obtener clones individuales de parásitos.

1. Contar población de parásitos en un hemocitómetro y se diluye hasta una concentración de 500 parásitos por ml en medio Ed1.
2. En una placa de 384-bien que contiene una monocapa confluente de células HFF, reemplazar el medio con 40 l / pocillo de Ed1 medio utilizando una pipeta de canales múltiples. Como se muestra en la Figura 5, cuatro poblaciones policlonales pueden ser clonados por placa como sigue: pipeta 40 l / pocillo de diluida mutante 1 en pocillos de C3-C12, mutante 2 en pocillos C13-C22, mutante 3 en los pocillos H3-H12, y mutante 4 en los pozos H13-H22 (volumen final en los pozos es ahora 80 l). El uso de un multi-canal de la pipeta, la pipeta del sollución arriba y hacia abajo 5 veces, a continuación, transferir 40 l de la fila debajo de la fila de partida (de la fila C a D o H fila I). Continuar estas diluciones en serie 2-plegado a través de la fila G (mutantes 1 y 2) o fila N (mutantes 3 y 4). Deseche el extra de 40 l de la última fila. Incubar en una incubadora 35 ° C durante 7-10 días sin perturbar la placa.
3. Ver los pocillos en un microscopio invertido con un objetivo 10-20x para la presencia de placas individuales, visible como 'agujeros' en la monocapa.
4. Pick 4 pocillos por mutante con una sola placa y transferir los parásitos en un frasco de cultivo confluente tejido con células HFF y lleno de Ed1 medio. Crecer los parásitos en una incubadora de 35 ° C y agitar los frascos diarios para dispersar a los parásitos extracelulares. Esto suele tardar 7 días.

5. Los resultados representativos

El ENU mutágenos y EMS no son estables cuando se almacenan durante largos períodos de tiempo. Por lo tanto, poniendo a prueba el poder mutagénico delas poblaciones es fundamental para obtener resultados reproducibles. Los resultados típicos de valoración y matar las curvas tanto para ENU y EMS se muestra en la Figura 1. Sin embargo, se recomienda llevar a cabo ensayos de placa para cada experimento de mutagénesis para determinar la dosificación apropiada que se utilizó. Para mantener la diversidad en la población de parásitos mutagenizado, es importante para proceder con la pantalla mutante salida lo más rápidamente posible. Por lo general, un pasaje de los parásitos en un nuevo frasco se lleva a cabo para permitir que los parásitos supervivientes se recuperen antes de seguir adelante con la pantalla. Se debe tener en cuenta que haciendo esto dará como resultado la división de los mutantes. Por lo tanto, no puede excluirse que varios mutantes aislados clonales después de completar el procedimiento en su conjunto contienen exactamente el mismo genotipo. Para evitar el aislamiento de los mismos tiempos de mutantes múltiples, se recomienda aislar sólo un mutante de salida única por mutagénesis, a menos que sus fenotipos (por ejemplo, la sensibilidad diferencial inductor de salida) sonmuy diferentes entre sí. Por otro lado, no todos los resultados de la pantalla en el aislamiento de mutantes con el fenotipo deseado. En particular, el Ca ^{2 +-ionóforo} A23187 fenotipo de resistencia es poco frecuente y requiere de múltiples experimentos de mutagénesis y pantallas para aislar un mutante de salida única. Por lo tanto, se recomienda realizar mutagénesis 10.05 y los experimentos de la pantalla en paralelo.

El poder de enriquecimiento de la pantalla se ensayó mediante la mezcla de un mutante de salida conocido con parásitos de tipo salvaje en diferentes proporciones. Estas mezclas se sometieron a la pantalla y la incidencia del fenotipo mutante en la población enriquecida se evaluó. Mediante el uso de tipo salvaje parásitos que expresan RFP citoplasmática y una línea mutante que expresa YFP citoplasmática las incidencias rápidamente se pudo establecer mediante citometría de flujo (Figura 3) ^13. Los resultados muestran que los fenotipos mutantes puede ser rutinariamente enriquecido al 80% de pureza, comenzando con parásito salida 1 mutante por 10.000 de tipo salvaje parasites ^13. Sin embargo, cuando la salida mutante: tipo salvaje relación de arranque parásito es 1:100.000 parásitos, la población aislada es sólo el 1-2% (1:100) mutantes de salida. Por lo tanto el poder de enriquecimiento de la pantalla es 1.000 veces. Puesto que la pantalla se inicia con la inoculación de 120.000 parásitos, de los cuales típicamente 70% son viables, se suelen realizar dos rondas de enriquecimiento. Los parásitos aislados han crecido entre las dos rondas de enriquecimiento. Este procedimiento da lugar a una población de 100% mutante, incluso cuando a partir de 1:1.000.000 de egreso: mutantes de tipo salvaje parásitos.

El ensayo de salida para validar y caracterizar los fenotipos requiere una multiplicidad de infección de la célula huésped que permite la diferenciación de vacuolas individuales. Esto es especialmente importante cuando se analizan las condiciones con altos porcentajes de egreso ya que los parásitos individuales están esparcidos alrededor. Como se muestra en la Figura 4, si las poblaciones egresados ​​no están bien separadas es fácil subestimar el porcentajede salida contando dos vacuolas egresados ​​como una vacuola. Desde salida y la invasión son procesos relacionados, y algunos fenotipos sensibles a la temperatura mostrar un fenotipo leve a la temperatura más baja, no todos los mutantes tienen eficiencias similares invasión. Estos mutantes por lo tanto, deben ser inoculados en varias veces mayores dosis para obtener una alta densidad vacuola suficiente para una evaluación precisa de su fenotipo de salida. Por otra parte, algunos inductores de egreso no son eficientes estimular la salida de los cuatro parásitos que contienen vacuolas o menos. Como tal, es importante que las vacuolas contienen ocho parásitos o más cuando se inicia el ensayo de salida. En nuestro laboratorio hemos aislado mutantes de la pantalla con un intensificador particular en contra de salida potenciadores de egreso otros. Al presentar su reactividad cruzada de los mutantes se pueden agrupar en diferentes categorías. Por último, no todos los mutantes de egreso será sensible a la temperatura. En particular, los mutantes aislados con inductores de egreso de disparo pasos antes de la liberación de intracellular Ca ^{2 +} son propensos a no fenotipos sensibles de temperatura. Esto es debido a los caminos paralelos que pueden conducir a la salida antes de la señal converge sobre la liberación de Ca ^{2 +} intracelular.

Figura 1. Químico mutágeno titulación de dosificación. Ensayos de A. La placa realizada en una placa de 6 pocillos utilizando diferentes concentraciones de EMS y números diferentes de parásitos por pozo, como se indica. Las manchas blancas son parásitos placas formadas en la monocapa HFF. B, C. curvas de supervivencia de los parásitos a la exposición a diversas dosis de EMS (B) y ENU (C). La supervivencia fue evaluada por ensayos de placa. Una dosis inducir 70% matanza se elige para experimentos de mutagénesis. Los promedios de tres experimentos independientes + / - desviación estándar se muestran.

et al. ^13.

Figura 3. Típico de enriquecimiento de egreso fenotipos mutantes. Resultados de enriquecimiento de un mutante de salida mezclada en los de tipo salvaje parásitos en diferentes proporciones (eje X). El porcentaje de egreso fenotipos mutantes en la población creció después de la pantalla se dibuja en el eje y, y se evaluó por citometría de flujo (de egreso parásitos mutantes expresó YFP citoplasmática, de tipo salvaje parásitos expresó cytoplasmic RFP). Los resultados de tres experimentos independientes están representados por puntos de datos de color rojo, azul y verde. Adoptado de Eidell et al. ^13.

Figura 4. Los resultados típicos de un ensayo de salida. A Flechas. Marcar cuatro diferentes vacuolas que contienen parásitos intactos 4-8. B. Las flechas señalan cuatro grupos de parásitos aislados que reflejan cuatro vacuolas egresados ​​independientes. Egreso fue inducida por A23187 (B) o DMSO como un control negativo (A). Los parásitos expresar citoplasmática YFP ^22.

Figura 5. Diluciones seriadas de las líneas clonales de parásitos. Cuatro poblaciones policlonales (rojo, azul, amarillo, verde) se diluyen en serie en una sola placa confluente de 384 pocillos con células HFF. Fila C y recibo 10 parásitos por pozo yson 2-veces diluido (40 l + 40 l) hasta que las filas H y N, respectivamente. El tono de gris indica la disminución del número de parásitos por pozo. Típicamente, los clones individuales se encuentran en filas DF y JL.

* Nigericina no puede ser utilizado en el enriquecimientopantalla de ambiente como los parásitos no sobreviven a la estimulación nigericina, usar solamente nigericina en la validación de los mutantes de salida.

Tabla 1. Egress inductores utilizados en los procedimientos. Diluir en 10 ml HBBSc contiene 25 mg / ml para la pantalla de DS o DS no para la validación de mutante (prueba de salida). Todos los compuestos de Sigma-Aldrich.

El protocolo descrito proporciona un método eficiente para aislar mutantes Toxoplasma con un defecto de salida. Hemos aislado con éxito mutantes a lo largo de diversas etapas de la vía de salida, algunos de los cuales tienen un fenotipo invasión de doble ^13. Los efectos potenciales sobre la invasión se puede determinar utilizando el llamado ensayo de rojo-verde, que distingue invadido de no invadido por parásitos tinción diferencial anticuerpo ^23,24. Para ambos ensayos de invasión y la salida podría ser conveniente expresar una proteína marcadora autofluorescente en el citoplasma de las ^13,22 parásitos. Sin embargo, si los parásitos que se mutagenizó ya expresar una proteína fluorescente que esto podría interferir con la caracterización adicional fenotípica por inmunofluorescencia más adelante. Siempre es posible añadir un marcador fluorescente para un mutante después de su aislamiento. Como se ha descrito, un simple, no fluorescente alternativa es Diff-Quick tinción para la salida.

Aunque una variedad de inductores de egreso de activación diferentes aspectos de la vía de señalización se describen en la Tabla 1, hay otros agentes farmacológicos conocidos para actuar sobre los procesos necesarios para la salida. Por ejemplo, la cafeína se ha demostrado que induce la secreción de microneme en parásitos extracelulares, que se requiere para ambosde salida y la invasión ^7,26,27. Sin embargo, la cafeína no se puede utilizar para accionar salida a partir de células huésped infectadas, probablemente debido a la cafeína no eficientemente difusa a través de la célula huésped hacia los parásitos que viven en un compartimento vacuolar. De manera similar, un gatillo de salida es la acumulación de ácido abscísico, pero es imposible para la detección de los mutantes en esta vía ya que el ácido abscísico no se difunde en la célula huésped ^28. Y como se indica en la Tabla 1, el K +-ionóforo nigericina es un inductor de salida eficiente ^5, sin embargo, los parásitos no sobreviven estimulación nigericina. Por lo tanto este compuesto no es adecuado también para la pantalla. En un procedimiento alternativo, el cribado más elaborado para los mutantes ionóforos se informó de que muchos mutantes con un retraso en la salida ionóforo inducida por sobrevivir a la exposición prolongada extracelular ionóforo ^11. Sin embargo, no mutantes resistentes a los ionóforos de egreso de salida inducida fueron aislados en esta pantalla, haciendo que los fenotiposmás débil. Actualmente, no es claro si mutantes con resistencia a la exposición prolongada a los inductores de egreso otros se puede obtener.

Dado que no parece haber varias vías paralelas que pueden conducir a la salida, se plantea la cuestión de cuál sería el más relevante en una infección (experimental). Parece que los ataques del sistema inmunológico en las células infectadas son el principal desencadenante de la salida ^29. Es posible utilizar activadores tales en la pantalla mutante. Por ejemplo, células T CD8 puede estimular la salida a través de un tanto mediada por Fas y una vía de la perforina mediada por ^30. Por lo tanto, mediante el uso de un FasL expresando las células T humanas como una célula huésped en la pantalla de salida, la salida puede ser desencadenada por la incubación con un anticuerpo anti-Fas para enriquecer los mutantes en esta vía.

Para asignar las mutaciones que subyacen genéticamente a los fenotipos de egreso, dos enfoques diferentes están disponibles en el Toxoplasma. A diferencia de los organismos modelos genéticos, todosElic la segregación por el cruce no es una opción ya que el ciclo sexual del parásito sólo puede ser activado en el intestino del gato. Aparte de la impracticabilidad y una pobre eficiencia de este proceso, cepas de parásitos cultivados en el laboratorio muy rápidamente pierde la capacidad de infectar gatos. Para evitar este problema un eficiente método de tipo salvaje cósmido complementación biblioteca ha sido desarrollado, el cual complementa el 90% de los mutantes de la división celular ^18. Además, hemos establecido genoma completo resecuenciación protocolos para identificar todas las mutaciones inducidas en el genoma (Farrell, Marth, Gubbels et al., Manuscrito presentado). Por lo general se identifican 20-70 polimorfismos de nucleótido único en mutantes inducidos químicamente. Entre estos dos enfoques que hemos sido capaces de identificar la mutación causal en todos los mutantes inducidas químicamente caracterizados hasta la fecha.

En conjunto, la pantalla descrita proporciona una herramienta versátil que permite la disección genética de interéslas vías de salida. Esperamos que esto permitirá determinar qué aspectos varios de la vía de señalización sabe que existen sobre la base de datos farmacológicos, pero para los que no los genes candidatos buenos podrían ser identificados en el genoma de Toxoplasma.