JoVE   
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Biology

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Neuroscience

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Immunology and Infection

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Clinical and Translational Medicine

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Bioengineering

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Applied Physics

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Chemistry

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Behavior

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Environment

|   

JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms I

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms II

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Essentials of
Neuroscience

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Automatic Translation

This translation into Hebrew was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Immunology and Infection

גידול של שחפת Mycobacterium Biofilms

1, 2, 1

1Department of Infectious Diseases and Microbiology, University of Pittsburgh, 2Department of Biological Sciences, University of Pittsburgh

Article
    Downloads Comments Metrics

    You must be subscribed to JoVE to access this content.

    This article is a part of   JoVE Immunology and Infection. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

    Recommend JoVE to Your Librarian

    Current Access Through Your IP Address

    You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

    IP: 54.80.121.186, User IP: 54.80.121.186, User IP Hex: 911243706

    Current Access Through Your Registered Email Address

    You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

     

    Summary

    שחפת Mycobacterium מהווה biofilms סמים סובלניים כאשר בתרבית בתנאים מסוימים. כאן אנו מתארים שיטות culturing מ ' שחפת biofilms וקביעת תדירות persisters סמים סובלניים. פרוטוקולים אלה יהיה שימושי למחקרים נוספים לתוך מנגנוני עמידות לתרופה בתוך: מ ' שחפת.

    Date Published: 2/15/2012, Issue 60; doi: 10.3791/3820

    Cite this Article

    Kulka, K., Hatfull, G., Ojha, A. K. Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms. J. Vis. Exp. (60), e3820, doi:10.3791/3820 (2012).

    Abstract

    Mycobacterium שחפת, סוכן האטיולוגי של שחפת האדם, יש יכולת יוצאת דופן לשרוד כנגד לחצים סביבתיים, כולל אנטיביוטיקה. למרות הלחץ הסובלנות של מ ' שחפת היא אחד התורמים צפוי כימותרפיה 6 חודשים ארוכה של שחפת 1, המנגנונים המולקולריים שבבסיס זה פנוטיפ אופייני הפתוגן עדיין אינן ברורות. מינים רבים של חיידקים פיתחו כדי לשרוד בסביבות מלחיצים על ידי הרכבה עצמית על פני השטח, מאורגן המצורפת, ו מטריקס מבנים כמוס קרא biofilms 2-4. הגידול ביישובים נראה האסטרטגיה המועדפת הישרדות של חיידקים, והיא מושגת באמצעות רכיבים גנטיים המווסתים מצורף משטח, תקשורת אינטר, וסינתזה של חומרים פולימריים תאיים (EPS) 5,6. עמידות ללחץ סביבתי הוא הקל ככל הנראה על ידי EPS, ואולי על ידי physioloההסתגלות של החיידקים gical הפרט microenvironments הטרוגניות בתוך הארכיטקטורה המורכבת של biofilms 7.

    בסדרה של מאמרים האחרונות הקמנו כי מ ' שחפת Mycobacterium smegmatis יש נטייה חזקה לגדול מבנים תאיים מאורגנים, קרא biofilms, שיכול לשאת יותר מ -50 פעמים הריכוזים מעכבות מינימלי של שחפת תרופות נוגדות isoniazid ו 8-10 ריפאמפיצין. מ ' השחפת, לעומת זאת, מסקרן דורש תנאים מסוימים כדי ליצור biofilms בוגרים, ב 09:01 יחס מסוים של אמיץ: מדיה, כמו גם חילופי מוגבלת של אוויר עם אווירה 9. דרישות של תנאי סביבה מיוחדים יכול להיות קשור לעובדה מ ' שחפת היא הפתוגן האנושי מחייבים ולכן יש להתאים לסביבות רקמות. בפרסום זה אנו מדגימים שיטות culturing מ ' שחפתbiofilms בבקבוק בתבנית של 12 גם צלחת, שהוא נוח מחקרים בקטריולוגי כמו גם גנטיים. תיארנו פרוטוקול זן מוחלש של מ ' שחפת, mc 2 7000, עם המחיקה בשני לוקוסים, panCD ו RD1, כי הם קריטיים עבור vivo בצמיחה של 9 הפתוגן. זן זה בטוח לשימוש על מנת להבין את הביולוגיה הבסיסית של הפתוגן שחפת וכך למנוע את הדרישה של מתקן BSL-3 יקר הכלה BSL-2. השיטה ניתן להרחיב, עם שינויים מתאימים בתקשורת, לגדול biofilm של מינים אחרים mycobacterial culturable.

    באופן כללי, פרוטוקול אחיד של biofilms culturing mycobacterial יעזור לחוקרים המעוניינים ללמוד את המאפיינים הבסיסיים של mycobacteria וגמיש. בנוסף, שיטה ברורה ותמציתית של biofilms mycobacterial גדל גם יעזור Inv קליני התרופותestigators כדי לבחון את היעילות של התרופה הפוטנציאלית.

    Protocol

    1. Biofilms גידול של מ ' שחפת בבקבוק 250 מ"ל בורג כתרים

    1. הכנה מדיה: ממיסים 0.5g של KH 2 PO 4, 0.5g של MgSO 4, 4G של Asparagine-L, 2G של חומצת לימון, 0.05g של אמוניום ציטראט Ferric, 60mL של גליצרול ב 900mL של מים. להתאים את ה-pH 7.0 ל עם NaOH. , החיטוי קריר זמן קצר לפני תחילת הניסוי, להוסיף ZnSO סטרילית 4 לריכוז הסופי של 0.1% w / נ מאז 7000 הוא mc 2 auxotroph pantothenate זן זה דורש גם חומצה פנטותנית ב 10μg/mL הריכוז הסופי.

    הערה: זהו ההרכב רמת התקשורת של Sauton המשמשים מ שחפת. עם זאת, אם נדרש מדיה מיוחדים אחרים יכולים לשמש גם עבור מינים mycobacterial אחרים.

    1. הכנה Inoculums: לגדול מ ' שחפת 7H9OADC עם 0.05% Tween-80 למשך שבוע, או 600 OD של 0.7-1.0. מ"קlture ניתן להשתמש ישירות על דילול 1:100 הבידוד.
    2. לוותר 25mL של התקשורת Sauton כדי בקבוק 250 מ"ל קלקר כתרים בורג (Corning). הוסף 250μl של הבידוד עד בינוני, מכסה את הבקבוק בחוזקה ומניחים אותו ללא הפרעה humidified 37 ° C החממה למשך 3 שבועות. שים את הבקבוק פעם אחת בכל יום על מנת להבטיח כי יש זיהום לא.
    3. בסוף השבוע השלישי, לשחרר את הפקק של הבקבוק כדי לאפשר צמיחה נוספת של מ ' שחפת על הממשק. אם הכובע לא משוחרר בשלב זה אז ריכוז חמצן מספיק במיכל יהיה לעכב צמיחה נוספת של חיידקים.

    2. גידול של מ ' שחפת biofilms ב 12 גם צלחות

    1. מכינים את התקשורת הבידוד של mc 2 7000, כמתואר בסעיפים A1 ו-A2.
    2. מערבבים 60mL של התקשורת עם 600μl של הבידוד. לוותר על 4.5mL של התערובת לתוך כל אחד גם הצלחת. מכסים את הצלחת עם מכסה. לעטוף את הצלחת כמה פעמים עם parafilm. דגירה צלחת ללא הפרעה חממה humidified על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 שבועות.

    3. קביעת תדירות persisters סמים סובלניים בתוך: מ ' שחפת biofilms

    1. לגדול מ biofilms שחפת בתבנית של 12 גם כמתואר בסעיף ב 'זה ייקח כולל של כ 5-שבועות.
    2. לאחר biofilms הם התבגר (אחרי 5 שבועות של דגירה) להזריק בחירתך אנטיביוטיקה בריכוז הרצוי לתוך התקשורת שמתחת biofilms באמצעות microtip ב פיפטה.

    הערה: היקף בתקשורת מתחת pellicles מפחית בכ 3.0mL. אז החוקרים צריכים בהתאם לחשב את כמות התרופה.

    1. לערבל את הצלחת בעדינות כך אנטיביוטיקה היא מתפזרת היטב במדיום. לקבלת תוצאות משמעותיות מבחינה סטטיסטית, להזריק antibiotic ארבע בארות. במקביל, להזריק באותו נפח של הממס שבו אנטיביוטיקה פורקה בארבע בארות אחרות, ולהשאיר האחרונים ארבע בארות של צלחת ללא שינוי. מכסים את הצלחת עם מכסה ולשים שכבות חדשות של parafilm סביב הצלחת. מניחים אותו בחזרה חממה פרק הזמן הרצוי.
    2. בסוף הדגירה, פתח את צלחת ולהוסיף Tween-80 לריכוז הסופי של 0.1% (נפח / נפח) בכל אחת הבארות. לערבל את כל הצלחת בעדינות לפיזור אחיד של חומר ניקוי. דגירה צלחת בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. מערבבים היטב את התוכן של כל אחד מהם מספר פעמים פיפטה כך התוכן ניתן להעביר באופן אחיד על צינור חרוטי 15 מ"ל.
    3. לסובב את התוכן של הצינור על 4000rpm במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. Resuspend גלולה ב 5 מ"ל של חיץ לשטוף טרי (PBS עם גליצרול 10% ו 0.05% tween-80). חזור על כביסה שלוש פעמים. Resuspend גלולה ב 5 מ"ל של חיץ הכביסה. שמור את זה על כיסא הנדנדה של overnight ב 4 ° C.

    הערה: למרות הטמפרטורה הנמוכה פותחה במקור עבור מ 'smegmatis (כדי למזער את צמיחתה במהלך פיזור) ושימשו שחפת מ' גם כן, מינים הגדלים איטי יכול כנראה להיות התנדנד בטמפרטורת החדר מבלי להשפיע על התוצאה. נדנדה בטמפרטורת החדר יכול להיות הכרחי אם עובדים במתקן BSL-3.

    1. להכין מזרק סטרילי מצויד microtip (2-200μl) על ידי חיתוך קצה הרחב לגודל מתאים, הולם אותו מזרק, וכרך אותו עם parafilm. להעביר את כל התוכן של הצינור באמצעות מזרק קצה מצויד ולאסוף בעוד כמה צינורות 15 מ"ל טריים. חזור על שלב 5 עד 6 פעמים עד שאתה רואה ההשעיה הומוגנית למדי.
    2. הכינו סדרה של דילולים ההשעיה ואת הצלחת דילולים על הצלחת 7H11OADC כדי לקבוע את מספר מושבות קיימא ב היטב כל אחד מהם. דגירה צלחות במשך שלושה שבועות 37 ° C חממה. קבע את frequenלסי של persisters באוכלוסייה biofilm על ידי חישוב היחס בין מספר המושבות שהתקבלו טיפול אנטיביוטי לאלו שהושגו על צלחות שטופלו ממס.

    4. נציג תוצאות

    כאשר בתרבית בבקבוק, גידול של מ ' שחפת ניתן לראות בבסיס הבקבוק עד סוף השבוע הראשון. בסוף השבוע השני, צמיחה של חיידקים בלתי סדיר על ממשק האוויר התקשורת ניתן לראות, אם כי הצמיחה בממשק אוויר מדיה גלוי באופן עקבי בסוף השבוע השלישי (איור 1 א). בשלב זה החיבור של החיידקים לדופן המיכל הוא ציין גם. מנקודה זו ואילך הצמיחה של התרבות מתרחשת בעיקר על ממשק האוויר בתקשורת. נוזלים מתחת לפני השטח הצמיחה הוא ברור. בדרך כלל, מבנה מתבגר עד סוף השבוע 5 (איור 1 ב). אם הדגירה ממושכת, מבנים יתחילו לשקוע בתחתית המיכל. מעניין לגלותהידוק המכסה עד סוף השבוע השלישי הוא שלב חשוב בתהליך, ומסיבות לא ידועות בקבוק רופף הכתיר מפגרים באופן משמעותי את תחילת הצמיחה בממשק 9.

    בתבנית של 12 היטב, biofilm חזק על הממשק אוויר התקשורת נתפסת בכל אחת הבארות בתום חמישה שבועות (איור 2 א). אם הצלחות אינן לכיסוי מלא ואז הצמיחה biofilm ההפרש הוא ציין. במקרה הגרוע ביותר, משמעותית אידוי התקשורת יכול לעכב את הצמיחה של החיידקים (איור 2 ב). לכן, גלישת הצלחת יש גם כדי למנוע אידוי וגם כדי לספק סביבה ליצירת biofilm (ראה סעיף קודם).

    מספר החיידקים קיימא biofilms שנקבעו עם טכניקה זו היא לשחזור למדי. תגובת מ ' שחפת biofilms משתנה אופיו של אנטיביוטיקה. על אנטיביוטיקה bactericidal כגון ריפאמפיצין, אובדן הכדאיות כדלקמן bipha כך במקור מגמה 9. ירידה מהירה של כדאיות במשך שלושה עד ארבעה ימים הראשונים ואחריהם שלב מתמשך שבו אחוז קטן מהאוכלוסייה נשאר הסרבן לחלוטין לאנטיביוטיקה ללא קשר ריכוז של אנטיביוטיקה או זמן החשיפה. איור 3 מציג את מספר החיידקים קיימא biofilms בוגרים לאחר חשיפה 7 ימים כדי 50μg/mL (50 פעמים גבוה יותר מאשר MIC) של ריפאמפיצין.

    איור 1 א.
    איור 1 א. הופעה מוקדמת של מ ' שחפת החיידקים בממשק אוויר התקשורת של החיידקים לאחר 3 שבועות של דגירה.

    איור 1 ב.
    איור 1 ב. התבגר biofilms של מ ' שחפת בממשק אוויר התקשורת לאחר חמישה שבועות של דגירה.

    820/3820fig2A.jpg "/>
    איור 2 א. 5 שבועות biofilms הישנים של מ ' שחפת גדל בתבנית של 12 גם כן.

    איור 2 ב.
    איור 2 ב. ניסיון כושל לגדל יג biofilms שחפת בצלחת 12 גם בלי parafilm.

    איור 3.
    איור 3. העלילה נציג מראה את שכיחות persisters סמים סובלניים בתוך: מ ' שחפת biofilms גדל בתבנית של 12 היטב חשופים 50μg/mL של ריפאמפיצין במשך שבעה ימים.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    שחפת (TB), נגרמת על ידי זיהום של Mycobacterium שחפת, נותר איום משמעותי על בריאות הציבור העולמית. כמעט שליש מאוכלוסיית העולם מוערך להידבק asymptomatically ידי פתוגן, כ -9 מיליון מקרים חדשים מופיעים במרפאה כל שנה עם תסמינים של שחפת פעילה על 1,700,000 מתים מזיהום מדי שנה 11. נטל עצום של המחלה תרם בעיקר על ידי חוסר החיסון ואת כימותרפיה מסובך מאוד כי מדובר במשטר multidrug מנוהל על שישה עד תשעה חודשים. כימותרפיה ממושכת מיוחסת במידה רבה סובלנות פנוטיפי של subpopulation קטנה של הפתוגן שדרשה חשיפה ממושכת של אנטיביוטיקה 12. תוך מיקוד אלה persisters הוא קריטי לטיפול קצר ויעיל של שחפת, המנגנונים העומדים בבסיס הפיתוח של persisters אלה עדיין אינן ברורות.

    חיידקים ביותר species בסביבתם הטבעית באופן ספונטני לגדול עצמית התאספו, מצורפים השטח קהילות תאיים בשם biofilms, שהם סובלניים מאוד אנטיביוטיקה 3. לאחרונה, הוכח כי מספר מינים mycobacterial, יש נטייה חזקה לגדול במבחנה כמו biofilms, המספקים microenvironment כי לקדם את הפיתוח של תרופות persisters סובלניים 9,13-15. בעוד גדל מהר מינים סביבתיים כגון מ ' smegmatis יכול בקלות ליצור biofilms של חומר ניקוי ללא מדיה, גידול איטי מינים פתוגניים מ ' שחפת דורשים תנאים ספציפיים ליצירת מבנים תאיים 9. מאז culturing מ ' שחפת biofilms יכול לספק תובנה משמעותית לתוך המנגנונים של סובלנות והתמדה סמים, הפצת פרוטוקול מפורט עבור culturing הפתוגן ב biofilms דרך מקור פתוח יהיה יקר לחקר מחלת השחפת, במיוחד countr משאב מוגבלy.

    כאן אנו מתארים את שיטת גידול מ ' שחפת biofilms בפירוט. כמו כן אנו מספקים פרוטוקול לשבור את biofilms ולקבוע את מספר החיידקים קיימא באוכלוסייה. טכניקה זו ניתן להשתמש כדי לקבוע את מספר persisters סמים סובלניים בתרבות. שלושת השלבים הקריטיים ביותר biofilms culturing הם: 1) בחירה של עם חומרי ניקוי ללא התקשורת המתאימים, סגרה מיכל התרבות במהלך שלושת השבועות הראשונים, ואת מיכל פתוח הדגירה לאחר מכן. יתר על כן, שמירה על מיכל במצב humidified חיוני גם כדי למנוע אידוי של התקשורת במהלך הדגירה 5 שבועות. זה יכול לעכב באופן משמעותי שחזור של התוצאות.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    אין לנו מה למסור.

    Acknowledgements

    העבודה בוצעה עם תמיכה כספית מהמכון הלאומי לבריאות האמריקאי איגוד הריאות.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Incubator VWR international Model # 1923/25
    Polystyrene culture bottles Fisher Scientific 03-374-300
    12-well tissue culture plate VWR international 62406-165
    50-mL conical tubes VWR international 89039-660
    Rocker Thermo Fisher Scientific, Inc. 57019-662
    Chromatographic refrigerator VWR international 55702-520
    petri dish VWR international 25384-342
    KH2PO4 (monobasic) EMD Millipore PX1565-1
    MgSO4 Fisher Scientific M65-500
    L-asparagine Sigma-Aldrich A4284-100G
    citric acid Sigma-Aldrich C1857-100G
    ferric ammonium citrate Sigma-Aldrich F5879-100G
    glycerol EMD Millipore GX0185-5
    NaOH Sigma-Aldrich S8045-500G
    ZnSO4 Sigma-Aldrich Z4750-500G
    D-pantothenic acid Sigma-Aldrich P2250-25G
    Difco Middlebrook 7H9 Broth BD Biosciences 271310
    Middlebrook OADC Enrichment BBL 212351
    Tween-80 Fisher Scientific T164-500
    250mL storage bottle Corning 430281
    12 well plates Falcon BD 353043
    rifampicin Sigma-Aldrich R3501-1G
    methanol JT Baker 9070-05
    10mlLsyringe BD Biosciences 301604
    1-200μL pipet tips VWR international 89079-458
    parafilm M VWR international PM-996
    15mL centrifuge tube Greiner Bio-One 188-285
    Difco Mycobacteria 7H11 Agar BD Biosciences 283810
    NaCl Fisher Scientific BP358-1
    KCl Sigma-Aldrich P9333-500G
    Na2HPO4 (dibasic) Sigma-Aldrich S0876-500G

    References

    1. Saltini, C. Chemotherapy and diagnosis of tuberculosis. Respir. Med. 100, 2085-2097, doi:S0954-6111(06)00457-4 [pii] 10.1016/j.rmed.2006.09.015 (2006).
    2. Hall-Stoodley, L. & Stoodley, P. Biofilm formation and dispersal and the transmission of human pathogens. Trends Microbiol. 13, 7-10 (2005).
    3. Costerton, J.W., Stewart, P.S., & Greenberg, E.P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
    4. Blankenship, J.R. & Mitchell, A.P. How to build a biofilm: a fungal perspective. Curr Opin Microbiol. 9, 588-594 (2006).
    5. Henke, J.M. & Bassler, B.L. Bacterial social engagements. Trends Cell Biol. 14, 648-656 (2004).
    6. Kolter, R. & Losick, R. One for all and all for one. Science. 280, 226-227 (1998).
    7. Branda, S.S., Vik, S., Friedman, L., & Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).
    8. Ojha, A., et al. GroEL1: a dedicated chaperone involved in mycolic acid biosynthesis during biofilm formation in mycobacteria. Cell. 123, 861-873 (2005).
    9. Ojha, A.K., et al. Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria. Mol. Microbiol. 69, 164-174, doi:MMI6274 [pii] 10.1111/j.1365-2958.2008.06274.x (2008).
    10. Ojha, A.K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., & Hatfull, G.F. Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms. J. Biol. Chem. 285, 17380-17389, doi:M110.112813 [pii]10.1074/jbc.M110.112813 (2010).
    11. Dye, C., Lonnroth, K., Jaramillo, E., Williams, B.G., & Raviglione, M. Trends in tuberculosis incidence and their determinants in 134 countries. Bull World Health Organ. 87, 683-691, doi:S0042-96862009000900012 [pii] (2009).
    12. Jindani, A., Dore, C.J., & Mitchison, D.A. Bactericidal and sterilizing activities of antituberculosis drugs during the first 14 days. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 167, 1348-1354 (2003).
    13. Carter, G., Wu, M., Drummond, D.C., & Bermudez, L.E. Characterization of biofilm formation by clinical isolates of Mycobacterium avium. J. Med. Microbiol. 52, 747-752 (2003).
    14. Hall-Stoodley, L. & Lappin-Scott, H. Biofilm formation by the rapidly growing mycobacterial species Mycobacterium fortuitum. FEMS Microbiol. Lett. 168, 77-84, doi:S0378-1097(98)00422-4 [pii] (1998).
    15. Alibaud, L., et al. Temperature-dependent regulation of mycolic acid cyclopropanation in saprophytic mycobacteria: role of the Mycobacterium smegmatis 1351 gene (MSMEG_1351) in CIS-cyclopropanation of alpha-mycolates. J. Biol. Chem. 285, 21698-21707, doi:M110.125724 [pii] 10.1074/jbc.M110.125724 (2010).

    Comments

    0 Comments

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter