Teelt van menselijke neurale progenitorcellen in een 3-dimensionale Zelf-assemblage Peptide Hydrogel

1. Deel 1: Cultuur van hNPCs in PuraMatrix

1. Vooraf aan de generatie van een steiger met een PuraMatrix concentratie van 0,25% zonder laminine moet men de voorbereiding van de volgende oplossingen
2. Bereid een oplossing met 20% sucrose en een oplossing van 10% sucrose opgelost in steriel gedistilleerd water.
3. Voor oplossing een mix 120 ul van de 20% sucrose-oplossing met 120 ul van gedistilleerd water in een 1,5 ml conische buis.
4. Voor oplossing 2 mix 60 pl van de PuraMatrix oplossing met 60 ul van 20% sucrose oplossing in een 1,5 ml conische buis.

Voor een preparaat van een steiger met een PuraMatrix concentratie van 0,25% aangevuld met laminine (8 ug per 100 ul Matrix) moet men de volgende oplossingen voor te bereiden.

1. Voor oplossing een mix 72 ul van gedistilleerd water met 120 ul van 20% sucrose-oplossing en 48 ul laminine in een 1,5 ml conische buis.
2. Voor oplossing 2 mix 60 ul PuraMatrix oplossing met 60 ul van de 20% sucrose oplossing in een 1,5 ml conische buis.

5. Voor de inbedding van cellen in de PuraMatrix bereiden een vier-en celcultuur plaat en plaats een gesteriliseerde glazen dekglas (diameter 13 mm) in twee putten. Bewaar de plaat in de schone bank voor het latere gebruik. Glazen dekglaasjes worden alleen gebruikt voor de immunocytochemische studies. Als er geen immunocytochemische kleuringen zijn bedoeld, kan de stap worden overgeslagen.

Ter voorbereiding van de hNPCs voor inkapseling in 3D steigers men ter voorbereiding van de volgende oplossingen. Verdun de Benzonase in de trypsine / EDTA-oplossing, met behulp van een verdunningsfactor van 1:10.000. Voor een Trypsin-Inhibitor/Benzonase oplossing te mengen: DMEM/F12 + Benzonase 25U/μl + 1% HSA + trypsine-remmer (0.5mg/ml).

6. Maak de cellen door het toevoegen van 500 pi Trypsine / Benzonase oplossing en incubeer gedurende 5 min in een incubator (37 ° C, 5% CO ₂₎. Stop de reactie met Trypsin-Inhibitor/Benzonase oplossing. Vervolgens centrifuge de vrijstaande cellen gedurende 5 min bij 3000 x g. Was de cellen met 5 ml 10% sacharoseoplossing en centrifuge opnieuw. Verwijder het supernatant.
7. Resuspendeer de cellen in 10% sucrose-oplossing, moet de laatste cel oplossing bevat 1x10 ⁶ cellen / ml.

De volgende stappen, 1,8 tot 1,11, gedaan moet worden zo snel mogelijk, vanwege de lage pH van de PuraMatrix oplossing, die mogelijk schadelijk zijn voor de cellen.

8. Mix 60 pi celsuspensie met de oplossing: 1.
9. Voeg 120 ul van oplossing 1, waarin de cellen, de conische buis met oplossing 2 en meng voorzichtig.
10. Plaats 100 pi van het mengsel direct op elke dekglaasjes verbleven in het 4-well plaat.
11. Voeg langzaam 200 ul celcultuurmedium per goed en na 2-3 minuten nog een 200 pi. Hiermee start u de zelf-assemblage van de matrix.
12. Incubate cells bij 37 ° C, gedurende 1 uur in de schone bank op een verwarmingsplaat of het verwarmde gedeelte van uw schone bank. Zo veel mogelijk bewegen niet de plaat als dit kan schadelijk zijn voor de montage van de matrices.
13. Verwijder het merendeel van het medium, maar niet alle, om te voorkomen dat de matrices vallen droog, met een 1000 ui pipet. Voeg 500 ul medium om matrices te wassen gedurende 10 minuten. Verwijder tenslotte het medium en voeg 500 ul vers medium en plaats de cultuur plaat in een incubator (37 ° C, 5% CO _2). Als de matrices gevoelig zijn voor schokken de platen moeten worden verplaatst zo weinig mogelijk en opgeslagen, indien mogelijk, in een aparte incubator.
14. De hier gebruikte hNPCs waren verspreidden zich gedurende 7 dagen in de 3D-steigers en differentiatie is een initiatief van intrekking van de groeifactoren ^13. Medium werd veranderd om de 2-3 dagen.

2. Deel 2: immunocytochemische kleuring van het hele matrices

1. Van tevoren bij de kleuringsprocedure moet men voor te bereiden op: abvergrendeling bufferoplossing die bestaat uit 5% normaal geit serum en 0,3% van de Triton X-100 opgelost in PBS, een 4% paraformaldehyde oplossing op basis van 0,1 M PBS en indien nodig een oplossing met 4 ',6-Diamidin-2'-phenylindoldihydrochlorid ( DAPI) voor een kernen kleuren met 100 ng DAPI / ml opgelost in PBS. Monsters werden gemonteerd met een mengsel van Mowiol en DABCO.
2. Te wassen de matrices het medium verwijderen met een 1000 ui pipet en een keer was de steigers met PBS gedurende 5 minuten.
3. Om vast te stellen de steigers te verwijderen van de PBS en voeg 400 ul van paraformaldehyde (4% in 0,1 M PBS) aan elk putje en incubeer de matrices voor de 30 minuten bij kamertemperatuur. Vaste Stellingen kunnen worden opgeslagen in PBS aangevuld met 0,02% NaN ₃ bij 4 ° C gedurende enkele weken tot enkele maanden.
4. Vooruitlopend op een verkleuring was de steigers met PBS gedurende 5 minuten.
5. Incubeer de steigers in het blokkeren van bufferoplossing. Het blokkeren van oplossing werd driemaal gewijzigd om de 2-3 uur en subsequently steigers werden geïncubeerd in het blokkeren oplossing over een periode 's nachts bij 4 ° C.
6. Verwijder de blokkering bufferoplossing en voeg het primaire antilichaam opgelost in PBS aangevuld met 1% normaal geit serum en incubeer de matrices 's nachts bij 4 ° C.
7. Verwijder het primaire antilichaam oplossing weg en was steigers vier keer voor 2 uur en vervolgens gedurende de nacht bij 4 ° C met PBS.
8. Verwijder de PBS en voeg de oplossing met het secundaire antilichaam, opgelost in PBS aangevuld met 1% normaal geit serum, gedurende 4 uur bij kamertemperatuur in het donker.
9. Was de monsters met PBS 4-6 keer gedurende 1 uur en vervolgens gedurende de nacht bij 4 ° C in het donker.
10. Voor een kernen vlekken kan men toevoegen 400 ul van de DAPI oplossing gedurende 30 minuten.
11. De monsters moet men microscoop dia's te monteren. Voeg 50 ul Mowiol / Dabco op de objectglaasjes. Verwijder de dekglaasjes van de 4-wells plaat en zorgvuldig leg ze op de montage medium.
12. Hier hebben we gebruik gemaakt van een Biozero 8000microscoop (Keyence, Duitsland, Karlsruhe) om een ​​enkele microfoto en z-stacks te verkrijgen. Elke stapel bevat 30 afzonderlijke foto's met een afstand van 1-2 um. Met behulp van de bijbehorende analyse-software de onscherpte die inherent zijn aan fluorescentie werd verwijderd voordat vol projecties van de z-stacks werden geproduceerd.

3. Deel 3: Release van hNPCs uit de steigers voor flowcytometrie-analyse

1. Vooraf aan de release van de cellen van steigers was de steigers met 500 pi HBSS.
2. Breng de steigers door middel van een 1000 ui pipet aan op een 15 ml conische buis met celkweekmedium.
3. Te verstoren de steigers mechanisch resuspendeer de cel oplossing meerdere malen met een 1000 ui pipet en vervolgens de oplossing centrifuge bij 3000 xg gedurende 5 minuten.
4. Verwijder de bovenstaande vloeistof met een pipet, voeg 500 ul van trypsine / Benzonase oplossing en resuspendeer de celpellet meerdere malen.
5. Incubeer de cellen gedurende 5 minutenbij 37 ° C in de trypsine / Benzonase oplossing. Om te stoppen met de reactie voeg 1 ml Trypsin-inhibitor/Benzonase-oplossing en pipetteer op en neer meerdere malen.
6. Centrifugeer de celsuspensie 5 min bij 3000 xg, verwijder het supernatant en was de cellen met 2 ml HBSS buffer. Herhaal deze stap twee keer. Deze procedure zal verwijderen matrix puin.
7. Passeren de celsuspensie oplossing via een cel zeef (poriegrootte 70 micrometer) om aggregaten te verwijderen en het verzamelen van de cellen in celkweek medium. De verkregen cellen kunnen worden gezaaid weer bijvoorbeeld op dekglaasjes voor functionele studies als patch clamp of fluometric metingen. Voor de verwerking van de cellen voor flowcytometrie, onmiddellijk de cellen (zie 4.1).

4. Deel 4: Kwantificering van βIII-tubuline positieve cellen door flowcytometrie

1. Bevestig de vrijgekomen cellen verkregen in stap 3.7 met 1% PFA gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
2. Centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 minuten bij 3000 xg en uitneeme het supernatant. Indien nodig, kunnen de cellen bereid zijn om te worden bewaard bij 4 ° C voor latere analyse. Daarom hersuspenderen cellen in wasbuffer (PBS aangevuld met 0,5% BSA en 0,02% Na-azide).
3. Om verder te gaan met de voorbereiding voor de flowcytometrie, centrifuge de celsuspensie gedurende 10 minuten bij 350 xg, verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 25 ul van het antilichaam oplossing. Daarom is de eerste antilichaam wordt gemengd met saponine buffer bij een concentratie 1:100 bijvoorbeeld βIII-tubuline. De saponine buffer bestaat uit PBS met een saponine concentratie van 0,5%, een BSA concentratie van 0,5% en een Na-azide concentratie van 0,02%.
4. Incubeer de celsuspensie met het eerste antilichaam gedurende 2 uur bij kamertemperatuur op een shaker. Als een negatieve controle voor te bereiden een monster zonder de eerste antilichaam.
5. Voor de eerste wasstap direct toe te voegen 300 ul saponine buffer naar de cellen. Centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 min bij 350 x g. Voor de tweede wasstap, gooihet supernatant, voeg 300 ul buffer en centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 min bij 350 x g.
6. Verwijder de bovenstaande vloeistof en voeg 25 ul oplossing die het secundaire antilichaam (bijv. Alexa Fluor 647, 1:1000, opgelost in saponine buffer). Incubeer cellen met het secundaire antilichaam 1 uur op kamertemperatuur, in het donker.
7. Voor de eerste wasstap direct toe te voegen 300 ul saponine buffer naar de cellen. Centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 min bij 350 x g. Voor de tweede wasstap, gooi het supernatant, voeg 300 ul buffer en centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 min bij 350 x g.
8. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 500 pi wasbuffer voor de flowcytometrie-analyse.

5. Representatieve resultaten

Een voorbeeld van hNPCs gekweekt in de zelf-assemblage hydrogel scaffold PuraMatrix is ​​weergegeven in figuur 1. De hNPCs groeien in sferische achtige structuren in ongewijzigde PM. In deze cultuur staats,-cellen kan nauwelijks worden erkend in een transmissie-licht, hoewel bundels van de processen tussen de bollen zichtbaar zijn (fig. 1A). Afhankelijk van de cultuur voorwaarden van het gebruikte celtype, kan de matrix bijvoorbeeld worden aangepast door toevoeging van laminine. Voor de hNPC cellijn ReNcell VM (Millipore) laminine nodig is om een ​​groei patroon met minder dichte aggregaten, maar een meer homogene verdeling van de cellen (fig. 1B) veroorzaken. Onafhankelijk van wijzigingen, kan de matrix worden gebruikt om bijvoorbeeld neuronale differentiatie te bestuderen. Figuur 1C toont een kleuring van de hNPCs voor de neuronale marker βIII-tubuline. In dit voorbeeld is de cellen werden gekweekt gedurende 7 dagen in de matrix en vervolgens gedifferentieerd gedurende 4 dagen, waar differentiatie werd geïnduceerd door intrekking van de groeifactoren EGF en bFGF. Cell ¹³ lichamen en een dicht netwerk van processen opgebouwd door de cellen kunnen worden makkelijk te herkennen. Maar het is duidelijk dat een kwantificering van het aantal cellen is tijdrovend, omdat een groot aantalfoto's van verschillende regio's van de matrix moet worden geanalyseerd, het verkrijgen van een betrouwbare gegevensbank voor een statistische analyse. In fig. 1D ziet men een voorbeeld van cellen uit de matrix vrijkomt en vervolgens gevlochten op dekglaasjes. Deze cellen kunnen worden gebruikt voor functionele studies.

De release van de cellen van de 3D-steigers biedt de mogelijkheid om verschillende parameters te analyseren als uitdrukking van marker-eiwitten of overleving van de cellen door AnnexinV / PI vlekken of een TUNEL assay. Figuur 2 toont een voorbeeld van een flowcytometrie-analyse van het percentage van βIII-tubuline ⁺ cellen. De negatieve controle (cellen die niet gemarkeerd voor βIII-tubuline) is weergegeven in figuur 2A. Deze controles worden gebruikt om de poort voor de latere detectie van βIII-tubuline ⁺ cellen (fig. 2B) te bepalen. Een vergelijking van een handmatige telling van cellen en een analyse van flowcytometrie is weergegeven in figuur 2C. Het percentage βIII-tubuline ⁺ cellen werd bepaald tenINED door het tellen van het totaal aantal cellen (door middel van een nucleaire DAPI kleuring) en het aantal βIII-tubuline ⁺ cellen in de fluorescentie foto's.

Figuur 1. hNPCs gekweekt in de zelf-assemblage peptide hydrogel PuraMatrix. A) hNPCs ingekapseld in PuraMatrix (PM) groeien in sferische, dichte verpakt structuren, waarbij de diameter van de bollen kan oplopen tot enkele honderden micrometer. Tussen de bollen kan men herkennen bundels van processen door de cellen (pijlen) gebouwd. B) De cellen ingekapseld in PuraMatrix aangevuld met laminine (PML) groeien in minder dichte structuur, meer homogeen verdeeld. In de laminine aangevuld matrix kan men enkele cellen herkennen in minder dichte gebieden (pijlen), maar het is nauwelijks mogelijk te kwantificeren van het aantal cellen. C) hNPCs gedifferentieerd voor 4 dagen in PML express neuronale marker, zoals βIII-tubuline (groen). Aan evaluatieste van het percentage positieve cellen moet men het totale aantal cellen te bepalen door een kernen kleuring, zoals DAPI (blauw). De microphotograph presenteert de volledige projectie van een z-stack van de foto's die met Biozero-8000 microscoop. D) De cellen uit de matrix vrijkomt kan worden ingedeeld op bijvoorbeeld dekglaasjes voor de verdere functionele studies. De microphotograph toont cellen gekweekt voor 3D, en vervolgens de release procedure. De kleuring voor βIII-tubuline (rood) laat een vergelijkbare morfologie van de cellen gehost in de 3D-schavot.

Figuur 2. Flowcytometrie analyse cellen vrijgelaten uit PuraMatrix. Om de tijdrovende kwantificering van microfoto's gebruikten we een protocol om cellen gekweekt in PuraMatrix die toegang geeft tot een snellere analyse door flowcytometrie los te overwinnen. A) ongekleurde cellen werden gebruikt als negatieve controle, naar de gate (zwart frame) ingesteld voor de analyse achterafvan bijvoorbeeld βIII-tubuline cellen. B) Om het percentage van βIII-tubuline ⁺ cellen van dezelfde poort, gelegen in de negatieve controle, werd gebruikt kwantificeren. Positieve cellen in het rechter gedeelte van de x-as, waar ook een tussentijdse populatie werd waargenomen (stippellijn), het meest waarschijnlijk vertegenwoordigen celresten. C) De vergelijking van handmatige geteld cellen en cellen geteld door flow cytometrie bleek een veel groter deel van de positieve cellen, waar de tijd afhankelijk van het aantal βIII-tubuline ⁺ was vergelijkbaar, met vermelding van de betrouwbaarheid van de flow cytometrie protocol.

Het gebruik van 3D-scaffolds biedt de mogelijkheid om de ontwikkeling van verschillende celtypes studie in een celkweek situatie dichter bij de in vivo situatie. Echter, met betrekking tot de analyse van bijvoorbeeld neuronale differentiatie of functionele studies men moet een aantal obstakels overwinnen om betrouwbare gegevens voor bijvoorbeeld de kwantificering van celtypen te krijgen.

Hier beschrijven we de cultuur van hNPCs in het peptide hydrogel op basis van steiger PuraMatrix en het vervolgens vrijgeven van de cellen worden gebruikt voor de studies in een 2D situatie biedt een gemakkelijke toegang tot tools als FACS of functionele assays. Onlangs toonden we de invloed van de PuraMatrix concentratie op de vorming van de 3D-steiger door atomaire kracht microscopie en de invloed op de overleving en differentiatie van de cellen. ¹³ Men dient echter in gedachten te houden dat elk celtype kunnen andere cultuur nodig voorwaarden of matrices die bestaan ​​uit andere materialen, bijv. matrigel of collageen.

Het protocol bij de cellen release is gebaseerd op een protocol van de fabrikant ¹⁸ en is vergelijkbaar met de protocollen die worden gebruikt om bijvoorbeeld primaire neuronale culturen waar een mechanische isolatie van de cellen wordt gevolgd door een afbraak van omringende materiaal door enzymen te bereiden. De cellen tolereren deze procedure en het verblijf van vitaal belang en opgebouwd processen en uiten neuronale marker, zoals βIII-tubuline, als ze eenmaal weer gezaaid op een laminine gecoat oppervlak. Hier hebben we flowcytometrie studies uitgevoerd met vrijgekomen cellen tot het bedrag van βIII-tubuline ⁺ cellen te kwantificeren. De vergelijking met een kwantificering gedaan "handmatig" door het tellen van cellen in microscopisch onderzoek toonde een veel groter deel van βIII-tubuline ⁺ cellen. Dit is het meest waarschijnlijk te wijten aan het hogere aantal cellen geteld door de flowcytometer (50.000 per sonde) in vergelijking met de handleiding analyse (enkele honderden per sonde). Echter, de kinetiek van het aantal & beta, III-tubuline ⁺ cellen volgt hetzelfde patroon in beide steekproeven, waar we een daling van βIII-tubuline ⁺ cellen te detecteren over de tijd. Dit is in overeenstemming met studies met behulp van de ReNcell VM cellen. ^15-17 Andere hindernissen te overwinnen tijdens een handmatige analyse zeer dichte gebieden van matrices die nauwelijks kan worden geanalyseerd of hoge achtergrond van het matrixmateriaal wat resulteert in een onderschatting van de "echte" aantal cellen. We zijn ervan overtuigd dat dit protocol kan worden aangepast aan andere soorten cellen die een snelle en betrouwbare methode om verschillende aspecten van de proliferatie, differentiatie of overleving van de cellen te kwantificeren.