JoVE   
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Biology

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Neuroscience

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Immunology and Infection

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Clinical and Translational Medicine

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Bioengineering

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Applied Physics

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Chemistry

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Behavior

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Environment

|   

JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms I

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms II

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Essentials of
Neuroscience

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Automatic Translation

This translation into Danish was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Clinical and Translational Medicine

In vitro mesothelial Clearance Assay at modeller de tidlige stadier af kræft i æggestokkene Metastase

1, 1, 1

1Department of Cell Biology, Harvard Medical School

Article
    Downloads Comments Metrics

    You must be subscribed to JoVE to access this content.

    This article is a part of   JoVE Clinical and Translational Medicine. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

    Recommend JoVE to Your Librarian

    Current Access Through Your IP Address

    You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

    IP: 54.211.137.77, User IP: 54.211.137.77, User IP Hex: 919832909

    Current Access Through Your Registered Email Address

    You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

     

    Summary

    Den mesothelial clearance analysen beskrevet her drager fordel af fluorescens mærkede celler og time-lapse video mikroskopi til at visualisere og kvantitativt at måle samspillet mellem kræft i æggestokkene flercellede kugler og mesothelial cellemonolag. Dette assay modellerer de tidlige trin af ovariecancer metastase.

    Date Published: 2/17/2012, Issue 60; doi: 10.3791/3888

    Cite this Article

    Davidowitz, R. A., Iwanicki, M. P., Brugge, J. S. In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis. J. Vis. Exp. (60), e3888, doi:10.3791/3888 (2012).

    Abstract

    Kræft i æggestokkene er den femte hyppigste årsag til kræft dødsfald i USA 1. Trods en positiv indledende respons på behandlinger, udvikle 70 til 90 procent af kvinder med kræft i æggestokkene nye metastaser, og fornyet ofte er dødelig 2. Det er derfor nødvendigt at forstå, hvordan sekundære metastaser opstår for at udvikle bedre behandlinger for mellemprodukt og sen fase ovariecancer. Ovariecancer metastase opstår, når maligne celler løsnes fra det primære tumorsted og sprede hele den peritoneale kavitet. De formidlede celler kan danne multicellulære klynger eller sfæroider, som enten vil forblive separate eller implantat på organer i den peritoneale kavitet 3 (figur 1, film 1).

    Alle organerne i den peritoneale kavitet er foret med en enkelt, kontinuerlig lag af mesotelceller 4-6 (fig. 2). Imidlertid mesotelceller er fraværende nedefraperitoneale tumormasser, som afsløret ved elektronmikrografi undersøgelser af udskårne humane tumor vævssnit 3,5-7 (figur 2). Dette antyder, at mesotelceller er udelukket fra undersiden af ​​tumormassen af ​​en ukendt fremgangsmåde.

    Tidligere in vitro-forsøg viste, at primære ovariecancerceller vedhæfte mere effektivt til ekstracellulær matrix end mesotelceller 8, og nyere undersøgelser viste, at primære peritoneale mesotelceller faktisk tilvejebringe en barriere mod ovariecancer celleadhæsion og invasion (sammenlignet med adhæsion og invasion på substrater, der ikke var dækket med mesothelial celler) 9,10. Dette tyder på, at mesotelceller virke som en barriere mod ovariecancer metastase. De cellulære og molekylære mekanismer, som ovariecancerceller overtræde denne barriere, og udelukke mesothelium har indtil for nylig, forblev ukendt.

    Her beskriver vi the metode til et in vitro assay, der modellerer den interaktionen mellem ovariecancer celle sfæroider og mesoteliale celler in vivo (figur 3, film 2). Vores protokol blev tilpasset fra tidligere beskrevne fremgangsmåder til analyse af ovariale tumorer celleinteraktioner med mesoteliale monolag 8-16, og blev først beskrevet i en rapport, der viser, at ovarie tumorceller anvender et integrin-afhængig aktivering af myosin og trækkraft for at fremme udelukkelse af mesotelceller fra under en tumor sfæroid 17. Denne model udnytter tidsforløb fluorescensmikroskopi for at overvåge de to cellepopulationer i realtid, giver rumlig og tidsmæssig information om interaktionen. De ovariecancerceller udtrykker røde fluorescerende protein (RFP), medens de mesoteliale celler udtrykker grønt fluorescerende protein (GFP). RFP-udtrykke kræft i æggestokkene celle sphæroider tillægger GFP-udtrykkende mesothelial monolag. Den sfæroider spredning, invaderer ogtvinge mesotelceller side skaber et hul i monolag. Dette hul er visualiseret som den negative rum (sort) i GFP-billedet. Det område af hullet kan derefter måles kvantitativt at analysere forskelle i afstand aktivitet mellem kontrol-og forsøgsdyr populationer af ovariecancer og / eller mesotelceller. Dette assay kræver kun et lille antal af ovariecancerceller (100 celler pr kugleformede X 20-30 sfæroider pr tilstand), så det er muligt at udføre dette assay under anvendelse kostbare primær tumor celleprøver. Endvidere kan dette assay kan let tilpasses til high throughput screening.

    Protocol

    1. Kræft i æggestokkene Cell klumpformet Dannelse

    1. RFP-udtrykkende ovariecancerceller dyrkes i 10% basemedium (en brugerdefineret celledyrkningsmedium indeholdende en 50:50 blanding af 199 og MCDB105, 10% inaktiveret føtalt bovint serum og 1% pen-strep). For at udtrykke RFP i umærkede ovariecancerceller, transficere cellerne med et plasmid indeholdende RFP og selektere for celler, der udtrykker RFP. Alternativt kan virale vektorer kan anvendes til transient udtrykker fluorescerende proteiner, eller cellerne kan være præ-inkuberes med et rødt fluorescerende celler tracker farvestof (Invitrogen).
    2. Forud for dannelse af ovariecancer sfæroider, er det nødvendigt at fremstille lav adhæsion 96-brønds rundbundet dyrkningsskåle. Til fremstilling af lav-adhæsion dyrkningsplader, 30μl poly-HEMA (6mg polyhydroxyethylmethacrylat i 1 ml 95% EtOH) tilsættes til hver brønd i en 96 brønds Corning celledyrkningsskål. De 96 brønds plader inkuberes i et 37 ° C ikke-befugtet inkubator for at afdampe ethanol, leaving en film af poly-HEMA på hver brønd. Dette poly-HEMA film forhindrer celler i at binde til bunden af brønden, hvilket tvinger cellerne til at vokse i suspension 18. [Alternativt kan ultralav Attachment dyrkningsplader (Corning) anvendes i stedet for poly-HEMA overtrukne skåle.]
    3. Efter at den lave friktion dyrkningsplader fremstilles, Trypsinisér en plade af ovariecancerceller og pelletere cellerne i en bordcentrifuge (Heraeus) ved 900 RCF i 3 minutter, indsuges supernatanten og resuspender i 10% basemedium.
    4. Tæl cellerne med et hæmocytometer.
    5. Justere koncentrationen af ​​celler, således at der er 100 celler pr 50 pi af 10% basemedium.
    6. Tilsættes 50 pi af ensartet suspenderet fortyndede cellesuspension til hver brønd på 96-brønds poly-HEMA overtrukket dyrkningsskål.
    7. Inkubér pladen med 96 brønde i en 37 ° C cellekultur inkubator i 16 timer (denne tid skal forøges eller formindskes afhængigt af mængden af ​​tid, det tager foren særlig cellelinie til dannelse af multicellulære sfæroider eller ønskede eksperimentelle betingelser) for at tillade ovariecancerceller til klynge sammen og danner en enkelt multicellulært sfæroid i hver brønd. Nogle tumorceller kan undergå apoptose i denne periode, så det er vigtigt at vælge et tidspunkt forud for induktion af apoptose.

    2. Mesothelial cellemonolaget Dannelse

    1. I en cellekultur hætte, præ-coate brøndene i en 6 brønds glasbund Mattek skål med fibronectin ved tilsætning 2 ml af en 5 ug fibronectin / ml PBS-opløsning til hver brønd af skålen og inkubering ved stuetemperatur i 30 minutter. Den optiske kvalitet af glas-bundene i Mattek retter tillader høj opløsning mikroskopisk billeddannelse.
    2. GFP-udtrykkende mesoteliale celler dyrkes i 10% basemedium. Trypsinisér en plade af mesothelial celler, spin ned i en bordplade centrifuge (Heraeus) ved 900 o i 3 minutter, opsug supernatanten, og re-suspenderes i 10% Base Medium. Denmesotelceller, der anvendes her allerede udtrykte GFP, når de blev opnået, men umærkede mesotelceller kan fremstilles ved transfektion med et plasmid indeholdende GFP-cDNA, eller præinkubation af cellerne i et grønt fluorescerende celle tracker farvestof (Invitrogen).
    3. Efter 30 minutters fibronectin inkubering (i trin 2.1), vaskes brøndene i Mattek skål med 2 ml PBS.
    4. Aspirer PBS og pladen 6 x10 5 mesothelial brønd i hver brønd i 6 brønds Mattek skål. Inkubér Mattek skålen i et 37 ° C cellekultur inkubator natten over for at tillade mesotelceller at fastgøre skålen og danne et monolag.

    3. Mesothelial Cell Clearance Assay

    1. Anvende en pipette til at indsamle de ovariecancer sfæroider fra 96-brønds poly-HEMA overtrukne plade.
    2. Aspirer mediet fra en brønd i 6 brønds Mattek skål indeholdende en mesothelial cellemonolag. Vaskes en gang med 2 ml PBS. Tilsættes alle sfæroider fra 96-brønds psen til en brønd på Mattek skålen (~ 3x antallet af sfæroider, der vil blive afbildet på grund af sfæroider lander på den del af skålen, der ikke kan afbildes).
    3. Anbring Mattek fadet på stadiet for en omvendt widefield fluorescensmikroskop stand til at udføre tidsforløb billeddannelse for varigheden af ​​mindst 8 timer. Brug en motoriseret etape til billede flere positioner i fad, med flere kugleformede interkalationsforbindelser begivenheder, i et enkelt eksperiment. Vi bruger en Nikon Ti-E Inverteret Motoriseret Widefield Fluorescens time-lapse mikroskop med integreret Perfekt Focus System og lav [20x-0,75 numerisk åbning (NA)] forstørrelse / Na differentielle interferens kontrast (DIC) optik, et Nikon halogen transilluminator med 0,52 NA lang arbejdsafstand (LWD) kondensator, Nikon hurtigt (<100 millisekunders koblingstid) excitations-og emissions-filtre (GFP Ex 480/40, Em 525/50, RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50), Sutter hurtigt overføres og epifluorescens lysvej Smart Shutkuld, en Nikon lineær-kodet motoriseret scene, en Hamamatsu ORCA-AG afkølet charge-coupled device (CCD) kamera, en specialbygget mikroskop inkubation kammer med temperatur og CO 2-kontrol, Nikon NIS-Elements AR software version 3, og en TMC vibrationsisolering tabel.
    4. De ovariecancer celle sphæroider vil falde til bunden af ​​fadet og sæt det mesothelial cellemonolaget. Indsamle GFP, RFP og fasebillederne af 20 + kugleformede / monolag interaktioner, hvert 10. minut, i 8 timer.
    5. RFP-udtrykkende ovariecancer celle sfæroider vil invadere i GFP-udtrykkende mesothelial cellemonolaget skabe et hul i monolag. Efter 8 timer måle størrelserne af hullerne ved at spore de sorte hullerne i GFP-billeder af elementer software (eller en anden egnet software, såsom billede J). Normalisere hulstørrelse den indledende sfæroid størrelse ved at dividere hulstørrelsen på 8 timer med størrelsen af ​​den sphæroide i det tilsvarende RFP billedet ved tiden nul. I denne exrigelig, blev hullet størrelse kun målt én gang, men det kan måles flere gange i løbet af otte timer eksperiment for bedre at forstå dynamikken i intercalation.

    4. Repræsentative resultater

    I dette eksempel sammenlignes vi mesothelial clearance evne OVCA433 ovariecancer celle sfæroider der har svækket ekspression af talin-1 til at styre OVCA433 sfæroider. OVCA433 sfæroider fra hver gruppe blev tilsat til en Mattek skål indeholdende ZT mesoteliale cellemonolag. Seks sfæroider fra hver gruppe blev afbildet hvert 10. minut i otte timer (figur 4, film 3, film 4). Hullerne er produceret i monolag af spreading sfæroider blev målt og seks positioner fra hver gruppe blev beregnet. Figur 4 viser, at den gennemsnitlige afstand rum, som talin 1 knockdown sfæroider var betydeligt mindre end det gennemsnitlige areal skabt af kontrol sfæroider, hvilket antyder, at talin kræves for mesothelial clearance af OVCA433 ovariecancer sfæroider.

    Figur 1
    Figur 1. Ovariecancer metastase. Primære tumorer i æggestokkene udvikle enten fra æggestokkene overfladeepitelet eller æggeledere. Tumorceller / klynger brække af fra den primære tumor og opsamles i det peritoneale hulrum. Tumorceller kan derefter aggregerer til dannelse af multicellulære sfæroider. Sphæroider derefter tillægger mesothelial cellemonolagene foring bughulen. De mesotelceller er udelukket fra undersiden af ​​vedlagte ovariecancer sfæroid, så sfæroiderne at få adgang til den underliggende basalmembran.

    Movie 1. Kræft i æggestokkene Metastase. Klik her for at se filmen .

    Figur 2
    Figur 2.

    Figur 3
    Figur 3. Mesoteliale Clearance assay. Ovariecancer sfæroider er dannet ved at inkubere 100 RFP-udtrykkende ovariecancerceller per brønd i en poly-HEMA coatede 96-brønds rundbundet dyrkningsskål ved 37 ° C i 16 timer. Poly-HEMA forhindrer celler i at binde til dyrkningsskålen, tillader cellerne at forblive i suspension og klæber til hinanden til dannelse af en enkelt klynge per brønd. Mesoteliale cellemonolagene fremstilles ved at udplade 6x10 5 mesoteliale celler per brønd i en fibronectin coatet med 6 brønde Mattek skål og inkubere pladen ved 37 ° C i 16 timer. Sfæroiderne overføres derefter til Mattek skål med mesothelial monolag og de to cellepopulationer afbildes hvert 10. minut i 8 timer under anvendelse af et Nikon Ti-EInverted Motoriseret Widefield Fluorescens time-lapse mikroskop og Elements software.

    Movie 2. Mesothelial Clearance Assay. Klik her for at se filmen .

    Figur 4
    Figur 4. Dæmpning af talin 1 udtryk i OVCA433 kugler falder mesothelial clearance evne. OVCA433 sfæroider (rød) med og uden svækkede ekspression af talin en fik lov at vedhæfte sig til og invadere i en ZT mesothelial monolag (grøn). De to cellepopulationer blev afbildet hvert 10. minut i 8 timer under anvendelse af et Nikon Ti-E Inverteret Motordrevet Widefield Fluorescens tidsforløb mikroskop og elementer software. Grafen viser, at talin en dæmpningsignifikant nedsætter mesothelial celle clearance (fraktilestime plot med grønne bjælker midlerne).

    Movie 3. Kontrol OVCA433 kugler (rød) invaderende i en mesothelial monolag (grøn). Klik her for at se filmen .

    Movie 4. Dæmpning af talin 1 udtryk i OVCA433 kugler (rød) reducerer mesothelial (grøn) clearance evne. Klik her for at se filmen .

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Den "mesothelial Clearance Assay" præsenteres her bruger time-lapse mikroskopi til at overvåge samspillet mellem kræft i æggestokkene flercellede kugler og mesothelial cellemonolag, i stor rumlig og tidsmæssig detaljer. Tidligere havde flere grupper 8-14 bruges endpoint-analyser til at vise, at ovariecancerceller lægger til og invadere ind mesothelial cellemonolag. Dette assay er enestående ved, at den anvender fluorescensmærkede celler at skelne tumorceller fra mesotelceller, således at dynamikken i disse to cellepopulationer kan overvåges under hele assayet. Processen intercalation kan visualiseres i realtid og hastigheden af ​​mesothelial clearance kan kvantitativt måles over tid. Brugen af ​​timelapse mikroskopi giver en nøje overvåge dynamikken i samspillet mellem de to cellepopulationer under forskellige eksperimentelle betingelser. Yderligere kan en lille procentdel af enten mesotelceller eller ovariecancer ceLLS kan mærkes med en tredje fluorescerende markør til at overvåge dynamikken af ​​individuelle celler i populationen. Ved sporing af individuelle celler over tid, kan retningen og hastigheden af ​​vandringen beregnes. For at udføre højere opløsning analyser af mesothelial clearance, kan total intern refleksion fluorescens (TIRF) mikroskopi anvendes. Hvis fokale adhæsioner er mærket i mesotelceller, kan dissociationen af mesoteliale adhæsioner ved protrusive forlængelser af tumorcellerne overvåges som beskrevet i vores tidligere publikation 17.

    Dette assay kan anvendes til at sammenligne invasion evne ovariecancer celle sfæroider, som er blevet genetisk eller farmakologisk modificerede til at belyse de molekylære mekanismer, hvorved ovariecancer celle sfæroider rydde mesothelial monolag eller til at identificere inhibitorer med små molekyler af processen. Endvidere assay kræver et meget lille antal af ovariecancerceller, så den primære Tumor celler fra flydende udsondringer kan anvendes (se begrænsninger nedenfor), hvis mærket ved at præinkubere cellerne med cytotracker farvestoffer (Invitrogen). Assayet er også egnet til high throughput analyse. At udføre højt gennemløb genetiske eller farmakologiske undersøgelser, kan ovariecancerceller transficeres med forskellige siRNA vektorer eller behandlet med forskellige farmakologiske inhibitorer i hver brønd i 96-brønds plade. Mesoteliale cellemonolagene kan udplades i 96 brønds glasbund dyrkningsskåle, og sfæroider kan overføres 01:01 fra poly-HEMA plader til monolag-holdige plader. Alle disse trin kan optimeres til anvendelse med screening robotter, således at hundrede siRNAs eller inhibitorer kan screenes på en gang.

    En af fordelene ved dette assay er at være i stand til at modellere den kraft-afhængige interkalation af ovariecancerceller i mesothelial monolag. Vores laboratorium anvendt trækkraft mikroskopi (TFM) at afgøre, om mekanisk foRCE regulerer mesothelial clearance 17. Vi fandt, at overekspression af a5 integrin øget kontraktionsevne af celler udpladet på en fibronectin-coatede substrat, medens RNAi-medieret knockdown af talin eller myosin II reduceret cellesammentrækningsevne 17. Siden nedregulering af α5 integrin, Tallinn, eller myosin II i æggestokkene kræftceller sfæroiderne også faldet mesothelial clearance, vores TFM målinger støtter tanken om, at mesothelial clearance i en begivenhed afhænger af cellulære kontraktile kræfter, hvor celler med højere kontraktile kræfter forårsaget større mesothelial clearance. Derfor kan mesothelial clearance-assay anvendes til yderligere at forstå interkalationsforbindelser begivenheder associeret med ovarie sfæroid metastase, som er afhængige af mekaniske kræfter.

    Denne analyse har nogle begrænsninger at overveje. Første, for at danne multicellulære sfæroider, skal cellerne dyrkes i suspension i mindst 6 timer. Hviscellerne er i stand til at overleve uden matrix kontakte deres clearance kapacitet vil blive kompromitteret. Det andet er det fordelagtigt at anvende ovariecancerceller, der danner ensartede kompakte multicellulære sfæroider. Hvis ovariecancerceller kun danne løse klynger, kan de bryde ud i overførslen fra polyHEMA-coatede plade til fadet indeholder mesothelial monolag, skaber kugler i forskellige former og størrelser, der vil tilføje variation i data. Tredje, hvis de anvendte celler er heterogene, vil tilføje yderligere variation til størrelsen af ​​hullerne skabt i monolaget. Det er vigtigt at anvende multiple gentagne brønde (10-20/sample) på grund af variation i graden af ​​intercalation efter otte timer. I assays beskrevet her, blev veletableret ovariecancer (OVCA433) og mesoteliale (ZT) cellelinier anvendes. At gøre dette assay mere klinisk relevant, kan primære ovariecancerceller, fra ascitesvæsken fra patienter, der anvendes. Det ville være interessant på bestemmelse afIne hvis in vitro mesothelial celle clearance evne korrelerer med klinisk udfald. Ovenfor nævnte begrænsninger er særligt vigtige, når man anvender delprøver, idet antallet af primære celler til rådighed, er en begrænsende faktor. Desuden er det vigtigt at kontrollere integriteten af ​​mesothelial monolag, før udførelse af dette assay. Mesothelial monolag kan fikseres og farves for celle-celle junction-proteiner for at sikre, at mesoteliale celler junctions er intakte.

    Endelig kan mesothelial clearance analysen kan let modificeres til at besvare specifikke eksperimentelle spørgsmål. Her har vi anvendt fibronectin som ECM komponenten, der tillader ovarie-og mesotelceller at klæbe til glasset bund dyrkningsskåle, imidlertid kan andre ECM komponenter anvendes, herunder collagen og laminin. Endvidere kan andre celletyper, der findes under basalmembranen, herunder fibroblaster, tilsættes til denne eksperimentelle system til at vurdere rollenaf disse celletyper i mesothelial clearance 9,19,20. Endelig kan interaktioner af andre typer af tumorceller (f.eks pancreas, bryst, osv.) med mesotelceller også modelleres ved hjælp af denne assay. Og det er muligt at undersøge interaktionen mellem cancerceller og en endotelmonolaget under anvendelse af dette assay til at efterligne intravasation eller ekstravasation (Lignende assays er blevet beskrevet i: 15,16,21-27).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Vi har intet at afsløre.

    Acknowledgements

    Vi vil gerne takke Nikon Imaging Center på Harvard Medical School, især Jennifer Waters, Lara Petrak og Wendy Laks, for uddannelse og brug af deres timelapse mikroskoper. Vi vil også gerne takke Rosa Ng og Achim Besser for værdifulde diskussioner. Dette arbejde blev støttet af NIH Grant 5695837 (til M. Iwanicki) og GM064346 til fælles kontrolinstans, af en bevilling fra Dr. Miriam og Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation (til JSB).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    OVCA433 Ovarian Cancer Cells Gift from Dr. Dennis Slamon
    ZT Mesothelial Cells Gift from Dr. Tan Ince
    Medium 199 GIBCO, by Life Technologies 19950
    MCDB105 Cell Applications Inc. 117-500
    FBS-heat inactivated GIBCO, by Life Technologies 10082
    Pen-Strep GIBCO, by Life Technologies 15070
    96 well plates Corning 3799
    Polyhydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA) Sigma-Aldrich 192066-25G For poly-HEMA solution dissolve 6mg poly-HEMA powder in 1ml of 95% EtOH
    EtOH Pharmco-AAPER 111ACS200 Dilute to 95% in dH20
    Cell culture hood Nuaire NU-425-300
    Tissue culture incubator Thermo Fisher Scientific, Inc. 3110
    incubator for poly-HEMA plates Labline Instruments Imperial III 305
    Tabletop centrifuge Heraeus Instruments 75003429/01
    6 well glass-bottom dish MatTek Corp. P06G-1.5-20-F
    Fibronectin Sigma-Aldrich F1141-1MG
    PBS Cellgro 21-040-CV
    Microscope Nikon Instruments Ti-E Inverted Motorized Fluorescence time-lapse microscope with integrated Perfect Focus System
    Lens Nikon Instruments 20X-0.75 numerical apeture
    Halogen transilluminator Nikon Instruments 0.52 NA long working distance condenser
    Excitation and emission filters Chroma Technology Corp. GFP Ex 480/40, Em 525/50 RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50
    Transmitted and Epifluoresce light path Sutter Instrument Co. Smart Shutters
    Linear-encoded motorized stage Nikon Instruments
    Cooled charged-coupled device camera Hamamatsu Corp. ORCA-AG
    Microscope incubation chamber with temperature and CO2 control Custom Made
    Vibration isolation table TMC
    NIS-Elements software Nikon Instruments Version 3

    References

    1. Jemal, A. CA Cancer J. Clin. 59, 225-249 (2009).
    2. Ries, L. G., Melbert, D., Krapcho, M., Stinchcomb, D. G., Howlader, N., Horner, M. J., Mariotto, A., Miller, B. A. SEER Cancer Statistics Review, 1975-2005. National Cancer Institute Bethesda, MD Available from: http://seer.cancer.gov/csr/1975_2005 (2007).
    3. Burleson, K. M. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers. Gynecol. Oncol. 93, 170-181 (2004).
    4. Birbeck, M. S., Wheatley, D. N. An Electron Microscopic Study of the Invasion of Ascites Tumor Cells into the Abdominal Wall. Cancer Res. 25, 490-497 (1965).
    5. Witz, C. A., Monotoya-Rodriguez, I. A., Schenken, R. S. Whole explants of peritoneum and endometrium: a novel model of the early endometriosis lesion. Fertil. Steril. 71, 56-60 (1999).
    6. Zhang, X. Y. Characteristics and growth patterns of human peritoneal mesothelial cells: comparison between advanced epithelial ovarian cancer and non-ovarian cancer sources. J. Soc. Gynecol. Investig. 6, 333-340 (1999).
    7. Kenny, H. A., Nieman, K. M., Mitra, A. K., Lengyel, E. The First Line of Intra-abdominal Metastatic Attack: Breaching the Mesothelial Cell Layer. Cancer Discovery. 1, 100-102 (2011).
    8. Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. J. Interactions of human ovarian tumor cells with human mesothelial cells grown on extracellular matrix. An in vitro model system for studying tumor cell adhesion and invasion. Exp. Cell. Res. 160, 499-513 (1985).
    9. Kenny, H. A., Krausz, T., Yamada, S. D., Lengyel, E. Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells to the omentum. Int. J. Cancer. 121, 1463-1472 (2007).
    10. Ksiazek, K. Senescent peritoneal mesothelial cells promote ovarian cancer cell adhesion: the role of oxidative stress-induced fibronectin. Am. J. Pathol. 174, 1230-1240 (2009).
    11. Burleson, K. M., Boente, M. P., Pambuccian, S. E., Skubitz, A. P. Disaggregation and invasion of ovarian carcinoma ascites spheroids. J. Transl. Med. 4, 6-6 (2006).
    12. Heyman, L. Vitronectin and its receptors partly mediate adhesion of ovarian cancer cells to peritoneal mesothelium in vitro. Tumour. Biol. 29, 231-244 (2008).
    13. Heyman, L. Mesothelial vitronectin stimulates migration of ovarian cancer cells. Cell. Biol. Int. 34, 493-502 Forthcoming.
    14. Lessan, K., Aguiar, D. J., Oegema, T., Siebenson, L., Skubitz, A. P. CD44 and beta1 integrin mediate ovarian carcinoma cell adhesion to peritoneal mesothelial cells. Am. J. Pathol. 154, 1525-1537 (1999).
    15. Leroy-Dudal, J., Heyman, L., Gauduchon, P., Carreiras, F. Adhesion of human ovarian adenocarcinoma IGROV1 cells to endothelial cells is partly mediated by the alphav integrins-vitronectin adhesive system and induces an alteration of endothelial integrity. Cell. Biol. Int. 29, 482-488 (2005).
    16. Leroy-Dudal, J. Transmigration of human ovarian adenocarcinoma cells through endothelial extracellular matrix involves alphav integrins and the participation of MMP2. Int. J. Cancer. 114, 531-543 (2005).
    17. Iwanicki, M. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discovery. 1, 144-157 (2011).
    18. Folkman, J., Moscona, A. Role of cell shape in growth control. Nature. 273, 345-349 (1978).
    19. Gregoire, L., Munkarah, A., Rabah, R., Morris, R. T., Lancaster, W. D. Organotypic culture of human ovarian surface epithelial cells: a potential model for ovarian carcinogenesis. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 34, 636-639 (1998).
    20. Roberts, P. C. Sequential molecular and cellular events during neoplastic progression: a mouse syngeneic ovarian cancer model. Neoplasia. 7, 944-956 (2005).
    21. Okada, T., Okuno, H., Mitsui, Y. A novel in vitro assay system for transendothelial tumor cell invasion: significance of E-selectin and alpha 3 integrin in the transendothelial invasion by HT1080 fibrosarcoma cells. Clin. Exp. Metastasis. 12, 305-314 (1994).
    22. Zervantonakis, I. K., Kothapalli, C. R., Chung, S., Sudo, R., Kamm, R. D. Microfluidic devices for studying heterotypic cell-cell interactions and tissue specimen cultures under controlled microenvironments. Biomicrofluidics. 5, 13406-1310 (2011).
    23. Brandt, B. 3D-extravasation model -- selection of highly motile and metastatic cancer cells. Semin. Cancer Biol. 15, 387-395 (2005).
    24. Condeelis, J., Segall, J. E. Intravital imaging of cell movement in tumours. Nat. Rev. Cancer. 3, 921-930 (2003).
    25. Dai, J., Ting-Beall, H. P., Hochmuth, R. M., Sheetz, M. P., Titus, M. A. Myosin I contributes to the generation of resting cortical tension. Biophys. J. 77, 1168-1176 (1999).
    26. Laferriere, J., Houle, F., Taher, M. M., Valerie, K., Huot, J. Transendothelial migration of colon carcinoma cells requires expression of E-selectin by endothelial cells and activation of stress-activated protein kinase-2 (SAPK2/p38) in the tumor cells. J. Biol. Chem. 276, 33762-33772 (2001).
    27. Dong, C., Slattery, M. J., Rank, B. M., You, J. In vitro characterization and micromechanics of tumor cell chemotactic protrusion, locomotion, and extravasation. Ann. Biomed. Eng. 30, 344-355 (2002).

    Comments

    0 Comments

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter