तह प्रोटीन के अध्ययन के लिए microfluidic Mixers

Waldauer, S. A., Wu, L., Yao, S., Bakajin, O., Lapidus, L. J. Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding. J. Vis. Exp. (62), e3976, doi:10.3791/3976 (2012).

1. Microfluidic मिलाकर देखना चिप्स का निर्माण

चित्रा 3 बुनियादी निर्माण कदम से पता चलता है.

1. ताजा पिरान्हा (एच _{2 2} हे 03:01 एच ₂ अतः _4): समाधान के साथ साफ 4 इंच (100 मिमी) वेफर्स जुड़े सिलिका मैं) हीट 130 से सल्फ्यूरिक एसिड ° सी तो पेरोक्साइड में डालना. ध्यान दें कि सतह खुरदरापन और जुड़े सिलिका वेफर्स की उदासी अंतिम चरण के लिए संबंध एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते थे. ii) कम से कम 30 मिनट के लिए वेफर्स को विसर्जित कर दिया. iii) पानी और सूखे के साथ 5 मिनट के लिए कुल्ला. के polysilicon कोटिंग लागू करें (पाली), ~ 1 माइक्रोन प्रति हर इरादा अंतिम microfluidic चैनलों के 10 माइक्रोन गहराई मोटी, एक कम दबाव रासायनिक वाष्प (LPCVD) बयान भट्ठी का उपयोग कर.
2. साफ वेफर्स और मुखौटा 1.1 चरण में पिरान्हा प्रोटोकॉल का उपयोग. मुखौटा एक ही रास्ता साफ, एसीटोन, मेथनॉल, और isopropanol साथ कुल्ला और सूखी तुरंत उड़ा. एक गर्म थाली पर 15 वेफर्स निर्जलीकरण0 ° सी ~ 10 मिनट (एक एल्यूमीनियम पन्नी तम्बू का उपयोग करने के लिए particulates को दूर रखने के लिए) या कम से कम 120 मिनट (अधिमानतः) रातोंरात के लिए एक 120 डिग्री सेल्सियस ओवन में. Photoresist आसंजन बढ़ाने के लिए, 5 मिनट के लिए तुरंत HMDS वाष्प गर्म वेफर्स को बेनकाब. स्पिन कोट एक ~ 90 ° सी सीधे 1 मिनट के लिए एक hotplate पर या 30 मिनट (चित्रा 3, चरण 1) के लिए 110 ° सेल्सियस पर एक ओवन में 900 एनएम AZ5214 photoresist और नरम सेंकना की मोटी परत के साथ वेफर्स.
3. मुखौटा संरेखित करें और एक मुश्किल और वैक्यूम संपर्क बनाने. (चित्रा 3, चरण 2): कई सेकंड (103 ~ ² / MJ सेमी कुल ऊर्जा) के लिए यूवी प्रकाश को बेनकाब. AZ400K डेवलपर, डि पानी के साथ 04:01 पतला ~ 50 सेकंड के लिए (जब तक photoresist पूरी तरह से विकसित की है) के साथ विकसित करते हुए धीरे आंदोलन. 2 मिनट के लिए पानी से कुल्ला. खुर्दबीन के साथ की विशेषताएं (चित्रा 3, चरण 3) का निरीक्षण किया. यदि सुविधाओं खराब हल कर रहे हैं, photoresist पट्टी और 1.2 से फिर से शुरू. हार्ड 115 सेंकना ° सी सीधे 2 के लिए एक hotplate परपहले.
4. Descum वेफर्स आशेर या ओ प्लाज्मा के साथ ₂ 100 डब्ल्यू आरएफ शक्ति में 2.5 मिनट के लिए. एक गहरी प्रतिक्रियाशील आयन (DRIE) नक़्क़ाश, खोदना के polysilicon परत नीचे जुड़े सिलिका के लिए के माध्यम से सभी तरह का उपयोग करना. 75 ° सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए खाल उधेड़नेवाला विरोध PRS2000 साथ शेष photoresist पट्टी. कुल्ला और सूखी. खोदना गहराई मापने के यह सुनिश्चित करने के पाली कोटिंग (चित्रा 3, चरण 4) के माध्यम से सभी तरह है.
5. ULVAC नक़्क़ाश एनएलडी-6000, खोदना ~ प्रति पाली कोटिंग (चित्रा 3, चरण 5) के माइक्रोन मोटाई 10 माइक्रोन की गहराई से जुड़े सिलिका के रूप में एक ऑक्साइड सक्षम DRIE का उपयोग करना. इस पाली कोटिंग नक़्क़ाशी दौरान के दूर पहना है, तो यह कोटिंग की अखंडता पर नक़्क़ाशी प्रक्रिया के दौरान समय - समय पर जाँच करने के लिए आवश्यक हो सकता है. वफ़र सतह के जानबूझकर कुरूप क्षेत्रों में सुरक्षा पाली कोटिंग के नंगे छीन नक़्क़ाशी के दौरान हो गए हैं, सतह के सबसे अधिक संभावना खड़ा हो गया है और अब कोई संबंध के लिए उपयुक्त हो जाएगाउत्पादन के अंतिम चरणों में है. इस मामले में वफ़र सबसे लंबे समय तक होने की संभावना व्यवहार्य है. 4 मिनट, 100 डब्ल्यू आरएफ शक्ति के लिए मैट्रिक्स आशेर के साथ साफ. XEF ₂ नक़्क़ाश (चित्रा 3, चरण 6) के साथ पट्टी के polysilicon. यह दोहराने के लिए photoresist और पाली कोटिंग्स के सभी को दूर करने के लिए 1.4 कदम है और इस कदम को कुछ समय के लिए आवश्यक हो सकता है.
6. एक नया ~ 1 photoresist की माइक्रोन परत के बाद से निपटने के दौरान चैनलों की रक्षा के साथ कोट वेफर्स स्पिन. प्रत्येक चिप में प्रवेश और निकास छेद ड्रिल एक sandblaster (चित्रा 3, चरण 7) के साथ हीरे की इत्तला दे दी ड्रिल मैन्युअल या नियंत्रित कंप्यूटर का उपयोग कर. एक ड्रिल का उपयोग अगर, एक्वा 55 बॉण्ड का उपयोग कर एक बलि गिलास प्लेट पर वफ़र (सुविधा साइड नीचे) माउंट, bonder बुलबुले से मुक्त रखने के ख्याल रख रही है. माइक्रो 90 सफाई समाधान के साथ ड्रिल बढ़िया. इस चैनल जो फिर प्रयोग के दौरान चिप रोकना करने के लिए चिपके से कांच के छोटे टुकड़े रहता है.
7. डि एक सिरिंज का उपयोग करने के लिए डब्ल्यू इंजेक्षन पानी के साथ वफ़र कुल्लाप्रत्येक छेद में अटर. एक घंटे के लिए साबुन पानी में भिगोएँ. 2000 पीआरएस photoresist और एक्वा बॉण्ड के साथ 60 डिग्री सेल्सियस पर कई घंटे के लिए निकालें जब तक सतह साफ है. डि पानी और गर्म साबुन पानी के साथ वफ़र कुल्ला. प्रत्येक छेद फिर से एक सिरिंज के साथ, कुल्ला etched सुविधाओं से बचने. नाइट्रोजन के साथ और एक वैक्यूम ओवन में सूखी वफ़र 120 सी. ° करने के लिए सेट छेद का निरीक्षण करने के लिए सुनिश्चित करें कि वे धैर्य के लिए स्वतंत्र हैं और दोहराने के रूप में आवश्यक कदम की सफाई. या तो एक ऑप्टिकल या यांत्रिक सतह profiler (चित्रा 3, चरण 8) के साथ चैनल की गहराई मापने के.
8. साफ और वेफर्स के एक बराबर संख्या 1 से 170 माइक्रोन मोटी जुड़े सिलिका कवर चश्मा) पिरान्हा समाधान के (1-2 घंटे 1.1 में प्रक्रिया के अनुसार), 2) 2 आरसीए (05:01:01 डि: एचसीएल: एच _{2 2} 0 75 सी पर) 10 मिनट के लिए समाधान, 3) आरसीए 1 (05:01:01 डि समाधान: 75C पर 22 मिनट के लिए एच _{2 2} 0)): राष्ट्रीय राजमार्ग ₄ ओह. प्रत्येक समाधान के बीच 5 मिनट के लिए डि पानी से कुल्ला.
9. एक जगह वफ़र सुविधाओं के शीर्ष पर ऊपर की ओर3-4 cleanroom एक कठिन फ्लैट सतह के शीर्ष पर रखा कांच के एक छोटे फलक जैसे पोंछे का एक ढेर. सूखी नाइट्रोजन गैस के साथ अच्छी तरह से कम से कम 5 मिनट के लिए वफ़र. कवर गिलास के साथ दोहराएँ. बढ़त के द्वारा कवर गिलास उठाओ और ऐसी है कि पॉलिश की ओर चेहरा नीचे वफ़र पर आयोजित किया जाता है और फ्लैट किनारों संरेखित पलटना. ध्यान से वफ़र पर कवर गिलास ड्रॉप और इसे व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं. क्षैतिज संरेखण समायोजित करने के लिए केवल कुहनी से हलका धक्का. वफ़र के केंद्र पर एक उंगली से नीचे धक्का. एक देखना चाहिए एक संबंध सामने विकीर्ण करने के लिए जावक शुरू. यदि आवश्यक हो, वफ़र भर के अन्य पदों के लिए अतिरिक्त दबाव लागू करने के संबंध सामने (चित्रा 3, चरण 9) अग्रिम.
10. कमरे Temp से 800 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के रैंप के लिए निर्धारित एक उच्च तापमान ओवन में सील वेफर्स जगह है, तो 800 से 1100 डिग्री सेल्सियस पर एक और 12 घंटे. 2 घंटे के लिए 1100 डिग्री सेल्सियस पर पकड़, और फिर एक और 1.5 घंटे से अधिक कमरे के तापमान को नीचे रैंप.
11. एक वफ़र dicing के साथ पाँसा मैं में देखा थाndividual चिप्स (चित्रा 3, चरण 10).
12. प्रोटोकॉल काफी असामान्य जुड़े सिलिका सब्सट्रेट जो यूवी का पता लगाने के लिए आवश्यक है में चैनलों के निर्माण का वर्णन. लेकिन इस प्रोटोकॉल को भी जो केवल एक नक़्क़ाशी चरण ^{2 की} आवश्यकता है एक सिलिकॉन सब्सट्रेट के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. (लेकिन नहीं सिलिका जुड़े हुए) कांच कवर गिलास anodic वफ़र संबंध का उपयोग करने के लिए बंधुआ किया जा सकता है.

2. बढ़ते और चिप्स लोड हो रहा है

1. मिश्रण चिप और समाधान पकड़ करने के लिए कई गुना प्लास्टिक से बने Lexan या Plexiglas, एल्यूमीनियम या तापमान नियंत्रण के लिए (चित्रा 4 देखें) के रूप में किया जा सकता है. एल्यूमीनियम का उपयोग अगर, समाधान जलाशयों parylene साथ लेपित किया जाना चाहिए जलाशयों में नमक समाधान द्वारा एल्यूमीनियम का विघटन को रोकने के लिए. तापमान पूरे कई गुना, समाधान और चिप के साथ उपकरणों thermoelectric पक्षों और एक इलेक्ट्रॉनिक नियंत्रक पर घुड़सवार नियंत्रित किया जा सकता है.
2. चिप मणि के लिए mated हैO-छल्ले छोटे और एक बनाए रखने की अंगूठी है कि चिप के केंद्र के एक स्पष्ट देखने की अनुमति देता है ऑप्टिकल के साथ जगह में आयोजित द्वारा गुना. O-अंगूठी grooves के मानक से shallower हो चिप के लिए बहुत अधिक दबाव लागू करने के बिना अच्छा संभोग यह सुनिश्चित करना चाहिए, यानी, एक 002 ओ अंगूठी होना चाहिए .025 "गहरी. एक बार चिप मुहिम शुरू की है, केंद्र और पक्ष जलाशयों के समाधान को जोड़ने , किसी भी कुओं के नीचे फंस बुलबुले जारी की देखभाल ले.
3. क्योंकि इस मिक्सर में इस्तेमाल किया संस्करणों इतने छोटे हैं, प्रवाह हवा समाधान कुओं से ऊपर लागू दबाव के साथ नियंत्रित किया जा सकता है चित्रा 4. दबाव O-छल्ले द्वारा चिप कई गुना के शीर्ष करने के लिए mated कई गुना से पता चलता है. दबाव कई गुना कंप्यूटर नियंत्रित दबाव transducers है कि ~ 2-80 साई से दबाव बनाए रख सकते हैं जुड़ा हुआ है. ऐसी है कि केंद्र और पक्ष चैनलों पर बराबर दबाव रैखिक प्रवाह दरों में एक ~ अनुपात 100 गुना उत्पादन चिप से डिजाइन किया गया है. 20 साई पर, बाहर निकलें चैनल में रैखिक प्रवाह दर ~ 1 मीटर है/ है.
4. एक औंधा माइक्रोस्कोप पर कई गुना प्लेस और ऐपिस या कैमरा उत्पादन के साथ क्षेत्र मिश्रण जांच. एक गरमागरम कई गुना के शीर्ष पर रखा टॉर्च पर्याप्त रोशनी प्रदान करेगा. केन्द्र चैनल में अपवर्तन समाधान की एक डाई या उच्च सूचकांक (यानी 6 एम guanidine हाइड्रोक्लोराइड) का प्रयोग करने के लिए जेट की देखने के लिए.
5. केंद्र और पक्ष चैनलों पर बराबर दबाव में, जेट मुश्किल हो सकता है आंख से देखते हैं तो 0 साई पर पक्ष चैनल दबाव के साथ शुरू और धीरे धीरे बराबर दबाव को बढ़ाने के. अगर एक तरफ चैनल भरा हुआ है, जेट बाहर निकलें चैनल की दीवारों के खिलाफ धक्का दिया जाएगा. यदि एक दृश्य रोकना प्रकट होता है, यह एक सिरिंज के साथ बाहर निकलने के चैनल में लागू करने के दबाव या वैक्यूम से उखाड़ फेंकना जा सकता है.
6. यदि प्रोटीन या अन्य कार्बनिक पदार्थ चिप मोज़री, यह रातोंरात Pirhana समाधान में भिगोने से साफ किया जा सकता है.

3. डेटा संग्रह

चित्रा 5 बुनियादी ऑप्टिकल साधन लेआउट दिखाता है.

1. एक शोध ग्रेड एक dichroic दर्पण खुर्दबीन के बाहर या तो अंदर या बस का उपयोग कर खुर्दबीन में collimated लेजर बीम लाओ. लेजर संरेखित इतना है कि ध्यान ऐपिस या मिश्रण क्षेत्र के पास कुछ कैमरे में देखा जा सकता है.
2. मिक्सर में प्रोटीन से प्रतिदीप्ति उद्देश्य से एकत्र की है और dichroic दर्पण के माध्यम से भेजा, एक pinhole लेंस द्वारा ध्यान केंद्रित और एक फोटान काउंटर पर imaged किया. एक्स और वाई में एक piezoelectric स्कैनर का उपयोग कर छवि मिश्रण क्षेत्र (ठेठ कदम आकार 2 माइक्रोन है) चिप स्कैन. जेट और एक्स और z में स्कैन पर एक स्थिति खड़ी चैनल के केंद्र पर ध्यान केंद्रित मिल चुनें. माइक्रोस्कोप के क्षेत्र की गहराई चैनल गहराई से बहुत कम है और दीवारों के 1 माइक्रोन के भीतर छोड़कर चैनल में प्रवाह की दर एक समान है. इसलिए मनाया प्रतिदीप्ति संकल्प अस्थायी के confocal स्थान के आकार के द्वारा मुख्य रूप से निर्धारित किया जाता है.
3. बाहर निकलें चैनल (ठेठ के कदम के भीतर क्षैतिज स्कैनize जेट भर में 0.2 माइक्रोन है, जेट के साथ 2 में जेट के साथ 100 माइक्रोन की वेतन वृद्धि, ~ 1 एमएस प्रति स्थिति के लिए देख) माइक्रोन (चित्रा 6 को देखें). 80-90 माइक्रोन से जेट के साथ खुर्दबीन चरण के लिए बाद में समय पर कब्जा करने के लिए ले जाने के लिए.
4. वैकल्पिक रूप से, प्रकाश dichroic दर्पण के बाद एक लेंस का उपयोग करने के लिए प्रवेश द्वार भट्ठा पर प्रकाश ध्यान केंद्रित एक spectrograph और सीसीडी द्वारा पता लगाया जा सकता है. चूंकि डेटा संग्रह के फोटॉन काउंटर (स्थिति प्रति 1 सेकंड) के लिए की तुलना में धीमी है, आमतौर पर जेट पहले फोटान काउंटर के साथ imaged है और तो जेट साथ अंक में spectrograph के साथ मापा जाता है (देखें चित्र 7).
5. प्रत्येक तीव्रता बनाम दूरी की एक साजिश बनाने की स्थिति में जेट के आसपास 3-5 पिक्सल संक्षेप द्वारा फोटोन काउंटर से डेटा का विश्लेषण किया है. समय एक गणना लागू दबाव (चित्रा 8 देखें) पर आधारित वेग का उपयोग दूरी से गणना की है.
6. Spectrograph से डेटा के तरीके के एक जोड़े का विश्लेषण किया जा सकता है. के लिए झल्लाहट, channe"दाता" और "स्वीकर्ता" के रूप में नामित रास प्रत्येक और अभिव्यक्त किया जा सकता है में निकटता अनुपात ई मैं = _ए / (मैं _डी मैं _डी) की गणना (चित्रा 9 को देखें). वैकल्पिक रूप से, एकल मान अपघटन समय बनाम स्वतंत्र वर्णक्रमीय घटकों को एक प्रोटीन परतों के रूप में tryptophan उत्सर्जन स्पेक्ट्रम में बदलाव के रूप में, देखने के लिए किया जा सकता है.
7. बाहर निकलने के चैनल के भीतर दूरी समय निरंतर प्रवाह लागू दबाव से पक्ष चैनलों के लिए निर्धारित दर का उपयोग करने के लिए परिवर्तित किया जा सकता है. निकास चैनल के पहले 2 माइक्रोन के भीतर, प्रोटीन जेट के प्रवाह की दर ~ 100x accelerates और उस क्षेत्र में कई बार सुव्यवस्थित उत्पादन बार 8 चित्रा में साजिश रची परिमित तत्व विश्लेषण के साथ गणना होगी. यह त्वरण एक ~ 1-2 μs की भरपाई उत्पादन के बाद वेग स्थिर हो जाता है और आमतौर पर बहुत धीमी मिश्रण से कैनेटीक्स को मापने में नजरअंदाज किया जा सकता है.

4. प्रतिनिधि परिणाम

चित्रा 6 मिश्रण फोटॉन काउंटर द्वारा मापा क्षेत्र में तीव्रता के एक समोच्च साजिश से पता चलता है. जेट के बाहर बाहर निकलें चैनल में पृष्ठभूमि डिटेक्टर के शोर मंजिल के करीब हो सकता है और आम तौर पर नहीं घटाया जाना चाहिए. एक उच्च पृष्ठभूमि गरीब संरेखण का संकेत हो सकता है या कि प्रोटीन चैनल की दीवारों पर चिपके हुए है. एक जेट है कि kinked या कुटिल लग रहा है मिश्रण क्षेत्र के निकट, विशेष रूप से, nozzles की एक गरीब खोदना इंगित करता है.

7 चित्रा से पता चलता है समय प्रोटीन एसाइल coenzyme एक बाध्यकारी प्रोटीन (ACBP) एलेक्सा 488 और 647 एलेक्सा के साथ लेबल से स्पेक्ट्रा हल. इस डेटा में पृष्ठभूमि अंधेरे प्रभारी और लेजर संकेत हटाने के लिए किया गया है घटाया. पृष्ठभूमि संकेत केंद्र चैनल 0 पीएसआई के लिए सेट दबाव के साथ लिया गया था.

मिश्रण समय एक तेजी से प्रतिक्रिया है कि ज्यादा टीआरपी प्रतिदीप्ति शमन ख के रूप में मिश्रण की तुलना में तेजी है मापने के द्वारा मापा जा सकता हैy की या एकल असहाय डीएनए के पतन के साथ लेबल रंजक NaCl के अलावा द्वारा, झल्लाहट. क्योंकि जेट माइक्रोस्कोप की ऑप्टिकल संकल्प से छोटी है, वहाँ जेट रूपों के रूप में मिश्रण क्षेत्र में एक बड़ी तीव्रता ड्रॉप है. यह साधन प्रतिक्रिया में जो कोई समाधान नहीं की स्थिति बदल जाते हैं. 8 चित्रा मिश्रण का अनुपात (400 मिमी में की) और एन एसिटाइल tryptophan एमाइड प्रतिदीप्ति की गैर मिश्रण प्रयोगों से पता चलता है एक नियंत्रण माप बनाने से हटाया जा सकता है. लाइन COMSOL सिमुलेशन से की भविष्यवाणी की एकाग्रता को दर्शाता है. मिश्रण समय, के रूप में 80% कम करने के लिए एकाग्रता के लिए समय के रूप में मापा, 8 μs है.

डेटा के बाद से 500 माइक्रोन लंबे समय से बाहर निकलें चैनल के साथ 100 माइक्रोन वेतन वृद्धि में एकत्र किया जाता है, डेटा एकाधिक दृश्य से एक साथ चिपकाया चाहिए. इन विचारों को ध्यान में छोटे परिवर्तन के रूप में चिप खुर्दबीन मंच द्वारा ले जाया जाता है कारण की संभावना के बीच कभी - कभी छोटे संकेत में ऑफसेट हैं. चरण आगे बढ़ कर 80 या 90देखने के प्रति माइक्रोन, इन ऑफसेट अतिव्यापी डेटा का परीक्षण करके समाप्त किया जा सकता है. आम तौर पर डेटा कम से कम दो प्रवाह की दर के साथ एकत्र की है और डेटा के लिए कोई संकेत परिवर्तन की पुष्टि करने के लिए संयुक्त है प्रोटीन में वास्तविक स्पेक्ट्रोस्कोपी ऑप्टिकल या प्रवाह के प्रभाव के बजाय, परिवर्तन की वजह से 9 चित्रा से पता चलता है की कमजोर पड़ने बाद प्रोटीन ACBP में परिवर्तन झल्लाहट. 6 एम से 0.06 एम. यह डेटा विकृतिकरण करने वाला साधन एक नियंत्रण का प्रयोग की जरूरत नहीं है के बाद से झल्लाहट पहले से ही एक अनुपात है और साधन प्रतिक्रिया पहले ही हटा दिया जाता है. टी = 0 के पास तेजी से कूद मिश्रण समय के भीतर संकेत झल्लाहट में तेजी से परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करता है.

चित्रा 1 मिश्रण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा मापा क्षेत्र के लेआउट.

चित्रा 2 hydrodynamic प्रोटीन तह का अध्ययन करने के लिए मिश्रण के योजनाबद्ध. प्रोटीन,उच्च करने के लिए प्रकट करना विकृतिकरण करने वाला साधन में भंग, नीचे मिश्रण क्षेत्र की दिशा में केंद्र चैनल है जहां यह बफर ~ 100 बार तेजी से बह मिलता है बहती है. लामिना का प्रवाह से विकृतिकरण करने वाला साधन अणुओं तेजी से विसरित कर सकते हैं एक संकीर्ण जेट में प्रोटीन धारा बलों. के रूप में जेट बाहर निकलें चैनल नीचे बहती है, प्रोटीन उच्च स्थानिक और समय एक confocal सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करने के संकल्प के साथ मनाया जा सकता है.

चित्रा 3 इनकार सिलिका निर्माण. 1) प्रक्रिया एक उच्च पॉलिश 500 माइक्रोन मोटी के polysilicon (पाली) की एक परत के ऊपर और नीचे सतहों पर जमा के साथ जुड़े सिलिका सब्सट्रेट () के साथ शुरू होता है (ख) स्पिन और photoresist (ग) की एक परत के साथ लेपित. 2) एक photomask (ई) int लाया जाता है ओ वफ़र और photoresist के साथ कड़ी से संपर्क करें यूवी प्रकाश (घ) के संपर्क में है. 3) वफ़र एक डेवलपर स्नान में रखा जाता है और पैटर्न photoresist में पता चला है. 4) वफ़र DRIE में रखा गया है और सुविधाओं के शीर्ष पाली कोटिंग में etched हैं. photoresist तो निकाल दिया जाता है. जुड़े सिलिका सब्सट्रेट में 40 माइक्रोन) 5 पाली तो एक मुखौटा है जब वफ़र एक ऑक्साइड नक़्क़ाश में रखा गया है और सुविधाओं 10 etched हैं के रूप में कार्य करता है. 6) पाली कोटिंग तो एक XEF ₂ नक़्क़ाश में निकाल दिया जाता है. 7) वफ़र गर्मी सक्रिय (छ) सीलेंट, सुविधाओं को नीचे की ओर, और एक हीरे की ड्रिल बिट पीठ से छेद के माध्यम से (च) abrasively अभ्यास के साथ एक बलि गिलास प्लेट को बंधुआ है. 8) एक सतह profiler (ज) तो सीधे etched सुविधा गहराई के उपाय. 9) एक 170 माइक्रोन मोटी जुड़े हुए सिलिका coverslip वफ़र सीधे वफ़र शीर्ष सतह पर बंधुआ है. 10) वफ़र व्यक्तिगत चिप्स microfluidic में diced है.

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चित्रा 4 मिक्सर कई गुना. microfluidic के चिप समाधान एक machined एल्यूमीनियम faceplate और ~ 200 μL जलाशयों के तहत चार O-छल्ले के साथ कई गुना करने के लिए सुरक्षित है. एक बड़ा छेद के चिपका microfluidic चिप का मिश्रण क्षेत्र सीधे ऊपर कई गुना के केंद्र के माध्यम से machined है, अतिरिक्त यूवी प्रकाश backscattering, बाधा किसी भी कई गुना खुद से ऑटो प्रतिदीप्ति के बिना से बचने के लिए अनुमति देता है और आंख से चिप का प्रत्यक्ष रोशनी की अनुमति या संरेखण के लिए कैमरा. हवा में कई गुना ऐसे जलाशयों में से प्रत्येक के जवानों है कि प्रत्येक में हवा का दबाव एक बाहरी दबाव नियंत्रण बॉक्स के माध्यम से नियंत्रित किया जा सकता है.

चित्रा 5 ऑप्टिकल confocal सूक्ष्मदर्शी की योजनाबद्ध.

चित्रा 6 tryptophan की समोच्च साजिश.microfluidic मिक्सर में प्रतिदीप्ति. मिश्रण क्षेत्र ~ y-अक्ष पर 90 माइक्रोन पर स्थित है.

7 चित्रा समय निर्भर फ्लोरोसेंट मिक्सर भीतर एकत्र स्पेक्ट्रा. हरे और लाल आयत दाता और स्वीकर्ता चैनल के रूप में नामित तरंगदैर्य क्रमशः से पता चलता है.

संख्या 8 मिश्रण पोटेशियम योडिद (अंक और सही अक्ष) tryptophan के प्रतिदीप्ति शमन द्वारा मापा और परिमित तत्व विश्लेषण के द्वारा की गणना (लाइन और धुरी बाएं).

9 चित्रा परिवर्तन प्रोटीन ACBP की तह के दौरान मापा झल्लाहट. टी = 0 के पास तेजी से वृद्धि मिश्रण समय के भीतर एक फट चरण का प्रतिनिधित्व करता है और धीमी वृद्धि का प्रतिनिधित्व करता है एक क्रमिक accumulaसंरचना के प्रोटीन परतों के रूप में tion. डेटा दो विभिन्न प्रवाह दर पर लिया गया था और मढ़ा, अलग अलग समय पर अलग घनत्व माप के लिए अग्रणी.

तेज मिश्रण कई वर्षों के लिए प्रोटीन तह के क्षेत्र के लिए विकास लक्ष्य दिया गया है क्योंकि यह लंबे समय से मान्यता प्राप्त किया गया है कि biomolecules के आणविक प्रक्रियाओं picoseconds से सेकंड के समय लेकर तराजू पर होते हैं. परम्परागत रोका प्रवाह मिक्सर 1-5 एमएस के मृत बार जो मुख्य रूप से अशांति द्वारा सीमित है. अशांत 30-300 μs का मिश्रण समय के साथ सतत प्रवाह mixers समूहों की एक छोटी संख्या के द्वारा पिछले 15 वर्षों में विकसित किया गया है लेकिन आम तौर पर उच्च प्रवाह की दर की आवश्यकता को प्राप्त करने के लिए इन मिश्रण बार और इसलिए ^6-8 नमूने के एक बहुत का उपयोग करें.

यह प्रोटोकॉल चिप्स microfluidic के मिश्रण का उपयोग करने के लिए लामिना का प्रवाह शासन में तेजी से कमजोर पड़ने को प्राप्त करने का वर्णन करता है. इस शासन के भीतर काम करने के कई फायदे हैं, लेकिन एक प्राथमिक एक उच्च परिशुद्धता के साथ पूरी प्रक्रिया मिश्रण है जो एक मिश्रण प्रतिक्रिया को संशोधित करने की अनुमति देता है अनुकरण करने की क्षमता है. टी सरल Geom के साथ अन्य समूहों द्वारा विकसित मिक्सरetries 100-200 μs है कि मुख्य रूप से ^9-10 चैनलों के आकार के द्वारा सीमित थे का मिश्रण बार दिखा दिया है. 10 माइक्रोन नाइट चैनलों के आकार स्केलिंग द्वारा ~ 10 ¹¹ μs मिश्रण समय कम. याओ और Bakajin पता चला है कि ज्यामिति में छोटे परिवर्तन के मिश्रण ⁴ समय में महत्वपूर्ण सुधार करने के लिए ले जा सकता है. हालांकि, कि काम से पता चला है कि त्वरण का मिश्रण भी धीमी चरणों के लिए के रूप में अच्छी तरह से नेतृत्व कर सकते हैं. इस ^12-13 काम में इस्तेमाल किया डिजाइन करने के लिए धीमी विकृतिकरण करने वाला साधन एकाग्रता में घातीय क्षय को कम करने और भी सुविधा DRIE नक़्क़ाशी में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य बनाने के लिए ⁴ संदर्भ में दो सर्वश्रेष्ठ डिजाइन के बीच एक समझौता है.

मिश्रण समय की परिभाषा पर ultrarapid मिश्रण के क्षेत्र में कुछ विवाद हो गया है. यह मिश्रण समय "और" मृत समय "के बीच अंतर को पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है. मृत समय एक अशांत मिक्सर में जो समय के दौरान एक measuremen के रूप में परिभाषित किया गया हैटी और नहीं किया जा वास्तव में काफी वास्तविक समय मिश्रण की तुलना में अब हो सकता है. यह आमतौर पर विभिन्न सांद्रता में एक छद्म पहले क्रम bimolecular प्रतिक्रिया (जैसे कि tryptophan प्रतिदीप्ति के एन bromosuccinate द्वारा शमन के रूप में) के कई मापन बनाने के द्वारा निर्धारित किया जाता है. मनाया घातीय decays के लिए एक एकल t = 0 होना ग्रहण मूल्य पर एकाग्र लगे हैं और उस बिंदु और पहली बार मापा बिंदु के बीच के समय मृत समय है. लामिना का प्रवाह mixers के लिए, माप मिश्रण प्रक्रिया के दौरान बनाया जा सकता है तो वहाँ कोई मर समय, केवल एक मिश्रण का समय है. मिश्रण समय केवल दो समाधान गठबंधन पर्याप्त एकरूपता तक पहुँच जाता है के लिए समय है. हम पहले मिश्रण करने के लिए एक समय 90/10, विकृतिकरण करने वाला साधन की एकाग्रता से 90% के से अमिश्रित मूल्य के 10% कमी के लिए समय समय को परिभाषित किया है. हालांकि, मिश्रण वक्र की आकृति पूरी तरह से एक छोटे घटक घातीय क्षय की पूंछ के साथ सममित नहीं है. इसके अलावा, प्रोटीन तहविकृतिकरण करने वाला साधन एकाग्रता पर अत्यधिक निर्भरता गैर रेखीय ताकि तह अक्सर शुरू भी अगर विकृतिकरण करने वाला साधन केवल दो गुना से कम कर सकते हैं. इसलिए हम और अधिक हाल ही में 80% से विकृतिकरण करने वाला साधन एकाग्रता कम समय के रूप में मिश्रण समय परिभाषित. निश्चित रूप से अन्य परिभाषा प्रयोग की आवश्यकताओं के आधार पर इस्तेमाल किया जा सकता है.

इस मिश्रक का उपयोग करने के लिए प्रोटीन तह का अध्ययन लगातार आश्चर्यजनक परिणाम से पता चला है. साइटोक्रोम ग और apomyoglobin की तह है लंबे समय के लिए सतत प्रवाह mixers के साथ कई तह कदम और जल्दी परिणाम है अध्ययन किया गया ढहने से पता चला है ~ 100 μs ^10,14-15 timescale पर होते हैं. इस मिश्रक के साथ हमारे माप वहाँ से पता चला है इस timescale पर कम से कम 2 कदम हो सकता है, एक धीमी चरण के बाद मिश्रक का मिश्रण समय के भीतर एक बहुत तेजी से, संभावना पतन गैर विशिष्ट, (के रूप में टीआरपी प्रतिदीप्ति वर्णक्रमीय बदलाव मापा) (के रूप में कुल टीआरपी उत्सर्जन का शमन से मापा) की संभावना है कि च हैदेशी ⁵ संरचना के irst गठन. हम भी प्रोटीन एल बी 1 डोमेन में एक 50 μs प्रक्रिया के देखा, पारंपरिक व्याख्या है कि इस प्रोटीन 2 राज्य के ¹³ फ़ोल्डर उथलनेवाला.

इस तेजी से मिश्रक का एक लाभ यह है कि यह तेजी से तह कि आमतौर पर केवल है nanosecond टी कूद उपकरणों द्वारा measureable किया गया प्रोटीन की तह जांच कर सकते हैं. टी कूद आम तौर पर तह / प्रोटीन के पिघलने के तापमान के पास विश्राम खुलासा और इसलिए पूरी आबादी की तह इस प्रकार कभी नहीं की निगरानी की आवश्यकता है. इस मिश्रक के साथ हम दोनों टीआरपी कुल उत्सर्जन और वर्णक्रमीय बदलाव के साथ γ - repressor की तह ^(6-86 λ) पर ध्यान दिया है और सबूत है कि प्रोटीन मजबूत तह शर्तों के तहत तह करने के लिए कोई बाधा नहीं है कि पिछले टी के लिए सुलभ नहीं थे पाया माप ¹² - कूद. अंत में हम villin टोप अश्वशक्ति-35 के तह मापा जाता है, एक टी केवह तेजी से फ़ोल्डर्स अभी तक मापा और पाया कि तह मिश्रण के बाद मापा दर ~ 5 बार धीमी गति से ही ¹⁶ की शर्तों के तहत टी - कूद के द्वारा मापा जाता है. यह पता चलता है कि तह कैनेटीक्स शुरू की स्थिति पर निर्भर करता है, क्षेत्र में एक प्रमुख धारणा उथलनेवाला.

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

यह काम राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (NSF के एफई - 0,623,664) FIBR और IDBR (NSF DBI 0,754,570) के द्वारा समर्थित है. इस काम आंशिक रूप से राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन FIBR अनुदान 0623664 Biophotonics, एक NSF विज्ञान और प्रौद्योगिकी केंद्र के लिए केंद्र द्वारा प्रशासित, सहकारी समझौते 0120999 बनावट के अंतर्गत कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, डेविस, द्वारा प्रबंधित से धन के द्वारा समर्थित किया गया था. लिसा Lapidus, पीएच.डी. शोध Burroughs आपका स्वागत फंड से वैज्ञानिक इंटरफेस में एक कैरियर पुरस्कार के हिस्से में समर्थित है.

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