JoVE   
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Biology

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Neuroscience

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Immunology and Infection

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Clinical and Translational Medicine

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Bioengineering

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Applied Physics

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Chemistry

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Behavior

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Environment

|   

JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms I

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms II

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Essentials of
Neuroscience

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Essentials of Developmental Biology

You have subscription access to videos in this collection through your user account.

Automatic Translation

This translation into Danish was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Clinical and Translational Medicine

Near Infrared Optical Projection Tomography for Vurderinger af β-celle Mass Distribution i Diabetes Research

*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 3, 4, 1, 1

1Umeå Centre for Molecular Medicine, Umeå University, 2Cell Transplant Center, Diabetes Research Institute, University of Miami,, 3EMBL-CRG Systems Biology Program, Centre for Genomic Regulation, Catalan Institute of Research and Advanced Studies, 4Dept. of Computing Science, Umeå University

* These authors contributed equally
Article
    Downloads Comments Metrics
     

    Summary

    Cite this Article

    Eriksson, A. U., Svensson, C., Hörnblad, A., Cheddad, A., Kostromina, E., Eriksson, M., et al. Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of β-cell Mass Distribution in Diabetes Research. J. Vis. Exp. (71), e50238, doi:10.3791/50238 (2013).

    Abstract

    Ved at tilpasse OPT at omfatte evnen til billeddannelse i det nære infrarøde (NIR) spektrum vi her illustrerer muligheden for at afbilde større organer i pancreasvæv, såsom rotte-pancreas, samt at øge antallet af kanaler (celletyper), der kan undersøges i en enkelt prøve. Vi beskriver yderligere gennemførelsen af en række beregningsværktøjer, der giver: 1 / præcis positionering af en prøve er (i vores tilfælde bugspytkirtlen) massemidtpunktet (COM) på rotationsaksen (AR) 2, 2 / forbedrede algoritmer til posten -tilpasning tuning, som forhindrer geometriske forvrængninger under tomografisk rekonstruktion 2 og 3 / en protokol for intensitet udligning for at øge signal-støj-forhold i OPT-baserede BCM bestemmelser 3. Derudover beskriver vi en prøveholder, der minimerer risikoen for utilsigtede bevægelser af prøven under billedet erhvervelse. Tilsammen disse protokoller muligt vurderinger af BCM distribution og othis funktioner, der skal udføres på hele mængden af intakt pancreas eller andre organer (fx i studier af ø-transplantation), med en opløsning ned til de enkelte Langerhanske øer.

    Introduction

    De insulinproducerende β-celler er vigtig for kroppens evne til at kontrollere blodsukker homøostase. Derfor vurderinger af pancreas BCM fordeling er bydende nødvendigt at mange områder i præklinisk diabetes forskning. I evalueringer af terapeutiske regimer for eksempel ofte virkningen af ​​målrettede gen ablation på endokrine celledifferentiering eller undersøgelser af diabetes ætiologi i gnavermodeller for sygdommen afhænger af sådanne analyser. Traditionelt har disse typer af vurderinger påberåbes tidskrævende stereologiske løsninger, der er vanskelig at udføre på grund af størrelsen og komplicerede anatomiske opbygning af bugspytkirtlen. Mest høj opløsning billeddannelse tilgange på nuværende tidspunkt (typisk optisk), giver ikke tilstrækkeligt indtrængningsdybde til at tillade hele pancreas billeddannelse hos gnavere. Omvendt billeddiagnostiske metoder, der ikke er begrænset af deres indtrængningsdybde (typisk nuklear) give dårlig opløsning til at løse den fulde BCM distribution og hæmmesaf manglen på tilstrækkelige kontrastmidler 4,5.

    Optisk projektion tomografi er en 3D afbildningsmodalitet, hvilket giver høj opløsning vurderinger af biomedicinske prøver på mm til cm skala 6. Herved kan information om den rumlige position og omfanget af den enkelte insulin udtrykker Langerhanske øer blive udtrukket hele volumen i bugspytkirtlen i normale og diabetiske mus 3,7-10. Formålet med den foreliggende undersøgelse er yderligere at øge kapaciteten af ​​denne teknik til vurdering af pankreatiske β-celler; deres endogene fordeling, når de er podet ind i andre væv, deres forhold til andre pancreatiske bestanddele (såsom infiltrerende celletyper) og i større pancreas præparater end tidligere muligt.

    Den nærinfrarøde optisk projektion tomografi (NIR-OPT) setup

    I nedenstående protokoller, opt scanner baseret på den oprindelige nedsat beskrevet af Sharpe 1, indrettet til billeddannelse i det nærinfrarøde område er beskrevet og anvendt. For enkeltkanal-vurderinger af muse pancreas (f.eks af BCM), kan SkyScan 3001 (Bioptonics) scanner anvendes.

    En metalhalogen, der giver højere excitationsenergi end en kviksølv bue lampe ved bølgelængder over 650 nm, leverer excitationslyset. Lyset overføres gennem en flydende lysleder. En nyttig kombination af fluorokromer og båndpasfiltre for NIR fluorescensimagografi og kanaladskillelse er vist i figur 3.. Det emitterede lys detekteres med en tilbage belyst CCD-kamera med høj kvantumeffektivitet i NIR spektret. OPT scanning automatiseres ved hjælp af en LabView platform, der styrer kameraet og stepmotor. At støtte prøver i størrelsen af ​​intakte rotte pancreas, en beskyttet sølvbelagt spejl og et stort kuvette anvendes. Endelig en prøveholder der fjerner uønskede lodrette movements af prøven under scanningen er designet.

    Protocol

    1. Sample Forberedelse og scanning

    1,1 Prøveforberedelse

    Følgende fremgangsmåde udføres i det væsentlige som beskrevet tidligere 7.

    1. Høste bugspytkirtlen. Brug iskold PBS for at undgå proteolytisk nedbrydning.
    2. Fix vævet i 4% PFA i PBS på is i 2-3 timer. Sørg for, at fligene er "spredt ud" under fiksering. Dette vil lette identifikationen af ​​anatomiske landemærker efter genopbygningen.
    3. Vask over PBS i 30 min.
    4. Dehydratisere bugspytkirtlen trinvis i methanol (33, 66%, 100%), 15 min / trin. Dette minimerer dannelsen af ​​bobler under blegning (se trin 5) og forhindrer celledestruktion ved frysning-optøning (se trin 7).
    5. Inkubér vævet i frisk fremstillet MeOH: H2O 2: DMSO blegning puffer i et 02:01:03-forhold ved stuetemperatur i 24 timer for at standse endogent væv fluorescens. For større prøver, udveksling til nye bleaching puffer og inkuberes i yderligere 24 timer.
    6. Vask med overskydende MeOH, ON.
    7. Fryse-tø i mindst 5 cyklusser i -80 ° C - RT at lette antistof penetration.
    8. Rehydrere trinvis tilbage til TBST (33, 66%, 100%), 15 min / trin.
    9. Blok i TBST med 10% serum (fortrinsvis fra den samme art, hvor det sekundære antistof blev genereret), 5% DMSO og 0,01% Naaz i 12-24 timer ved stuetemperatur
    10. Inkuber med primære antistoffer i blokeringsbuffer i 48 timer, ved stuetemperatur, udvides til 72 timer for større prøver (antistoffer, der anvendes her, er anført i tabellen af ​​reagenser).
    11. Vask over TBST, ON.
    12. Inkuberes med fluorescerende konjugerede sekundære antistoffer i 48 timer, ved stuetemperatur, udvides til 72 timer for større prøver.
    13. Vask over TBST, ON.

    1,2

    Følgende procedure beskriver, hvordan man monterer prøven i agarose og fastgør det til specialfremstillede prøveholderen (se figur 7) Forud for OPT scanning.

    1. Adskil milt, duodenal og gastrisk lapper ifølge figur 3A i Hornblad et al 3. Forholdet mellem fligene er yderligere præciseret i Hornblad et al 11.
    2. Forbered 1,5% (vægt / volumen) lavtsmeltende agarose i dH2O, filtreres, afkøles til 37 ° C og skyl vævet i dH2O at vaske væk detergent og fjerne bobler før agarose-indlejring på is.
    3. Skåret ud af en agarose-blok omslutter din prøve og efterlade en ~ 1 cm spacer mellem prøven og bunden af ​​agarose. Trim skarpe kanter (≤ 90 °) i agarose-blok til at reducere lysspredning.
    4. Dehydratisere prøven trinvis i MeOH (33, 66%, 100%), hvilket giver tid til at ækvilibrere mellem hvert trin. Når prøven synker det anses for at være ækvilibreret.
    5. Fjerne prøven i en 1:2 opløsning af benzylalkohol: Benzyl Benzoat (Babb), indtil det bliver gennemsigtigt. Udveksling Babb opløsning og inkuberes i yderligere 12 timer.
    6. Placer ryddet prøve i prøveholderen og fastgør det ved at indsætte 2 nåle gennem agarose spacer via de borede huller i flangerne af holderen.
    7. Anbring prøven i scanneren og dykke det i en kuvette fyldes med Babb clearing løsning. Ved sammenligning af en række pancreas samme forstørrelse bør anvendes til alle scanninger. Forstørrelsen bør optimeres for den største prøven i serien.

    1,3 Anbringelse af prøven i AR

    Følgende protokol beskrives fremgangsmåden til præcist at placere en prøve under anvendelse af COM-AR algoritme. Denne procedure kan kun anvendes, når ROI omfatter hele prøven. For detaljerede beskrivelser af de algoritmer, se venligst Cheddad et al 2.

    1. Erhverve billeder af modellen i to positioner for both anatomi og signalkanaler. Position 1 ved 0 ° (associeret med X-aksen), der udviser den største projektion området, og position 2 på 90 ° (i forbindelse med Z-aksen). Vi bruger GFP-kanal at visualisere anatomi.
    2. Påfør forventning-maksimering (EM) algoritme på anatomi billeder til tærskel ROI.
    3. Beregne COM punkter (x-koordinater) af de binære billeder opnået i trin 2 for både 0 ° og 90 ° fremspring.
    4. Overlejre en lodret linje gennem den identificerede COM point beregnet i trin 3 på 0 ° og 90 ° billeder af signalkanal.
    5. Bruge billeder optaget i trin 4 som henvisninger til at bevæge prøven, således at midterlinien af ​​synsfelt passerer gennem de fundne COM punkter i prøven.

    1,4 Scanning

    1. Juster eksponeringstider for at opnå den højeste signalstøjforhold muligt uden SaturaTing nogen områder af projektionen billeder. Gentag for alle kanaler, der skal scannes.
    2. Vælg den filtersæt for den første fluorescenskanal, der skal scannes. Emission fra kortere λ fluorophorer kan ophidse fluoroforer med længere λ og derved forårsage foto blegning. For at minimere denne mulighed, skal du scanne fluoroforen med længste excitation λ først.
    3. Åbne lukkeren at belyse prøven og opsamling af fluorescenssignalet over 360 °, roterer prøven langs den lodrette akse for hver kanal. Trinnet vinkel anvendt til NIR-OPT setup er 0,9 ° og for Bioptonics 3001 scanner 0,45 °.
    4. Vælg den rette filter til den næste kanal og fortsætte som ovenfor.

    2. Computational Processing og genopbygning

    2,1 Post-køb forskydning afsløring og korrektion (A-værdi tuning)

    I projektion tomografi er det i almindelighed nødvendigtat tildele en post-tilpasning værdi for fremskrivning til finjustere billederne position langs rotationsaksen forud for genopbygning. Imidlertid kan en lille afvigelse i vinklen af ​​kameraet mod den optiske akse medføre uensartede A-værdier langs længden af ​​prøven og således inducere geometriske forvrængninger. For at undgå sådanne forvridninger, kan en beregningsmetode for at finde den nøjagtige og unified post-tilpasning værdi (A-værdi) i hele prøven anvendes 2.

    1. Anvende en diskret Fourier-transformation til at opdele en projektion af specifikt signal ved 0 ° og 180 ° i 8 pixels højde blokke og beregne forskydning langs x-aksen (A-værdi) mellem hver blok.
    2. Anvende en lineær mindste kvadraters regression for at hjælpe beregne vinklen θ ", der beskriver hældningen af ​​x-aksen-shift langs længden af ​​prøven, og at finde en roterende centrum.
    3. Korrigere for forskydninger under scanning ved at dreje alle ProjeKTIONER θ '/ 2 omkring den roterende centrum.

    2,2 Kontrast begrænset adaptiv histogramudligning (CLAHE)

    For at lette påvisning og segmentering af objekter (øer), som udviser meget svage signaler, der er i fare for at blive "tærskelværdisammenlignet ud" under genopbygning og / eller segmentering for kvantitative vurderinger kan en CLAHE algoritme anvendes på projektion billeder. The CLAHE operation udføres med to større intensitet transformationer:

    1. Den lokale kontrast er anslået og udlignede senest ikke-overlappende blokke i fremskrivningen billedet.
    2. Styrkerne bliver derefter normaliseret ved grænseområderne mellem blokkene gennem bilineær interpolation.

    Navnet kontrast-begrænset refererer til clipsen grænse, der er indstillet til at undgå mættende pixels i billedet. I denne protokol, indbygget i MATLAB funktionen "adapthisteq" blev brugt og anvendt med standard c læbe grænse på 0,01 og en flise størrelse på 256. Bemærk, den optimale flisestørrelse skal testes empirisk og kan variere afhængigt af den analyserede prøve. Nærmere detaljer vedrørende algoritme og eksempler kan findes i Hornblad et al 3.

    Bemærk! De ovenfor anførte beregningsmæssige bearbejdningstrin (herunder COM-AR, A-værdi tuning og CLAHE, se 1,3-2,2) er bygget på standard-algoritmer og udføres i MATLAB (MathWorks).

    2,3 tomografisk rekonstruktion og iso-overfladegengivelse

    1. Ved hjælp af en filtreret back-projektion algoritme, kan de korrigerede og normaliserede billeder nu rekonstrueres med samlet forskydning kompensation og minimale krav til optimering af dynamisk område. I denne protokol er alle rekonstruktioner udføres ved hjælp af filtrerede bagprojektion metode til rådighed i NRecon software (Skyscan), version 1.6.8 (= "_blank"> Http://www.skyscan.be/products/downloads.htm). Bemærk, forstørrelsen af ​​et afbildet objekt afhænger af dens afstand fra omdrejningspunktet af linsen medmindre parallel stråle geometri er implementeret i den billeddannende setup. Derfor, når du importerer en fremskrivning datasæt til NRecon software er det vigtigt at medtage den rigtige objekt til kilde afstand (mm) og omdrejningsretning af scanneren (for mod uret input "cc" og uret input "cw") i den medfølgende log-filen, for at undgå Cone Beam fremkaldt artefakter under genopbygning.
    2. For at visualisere og kvantificere stakken af ​​virtuelle opnåede sektioner, generere 3D iso-overflader ved hjælp af passende billedbehandling software såsom Imaris eller Volocity.

    Murin ø isolation og transplantation procedurer blev udført ved Diabetes Research Institute prækliniske Cell Processing og revideret Translationel Model Core under protokoller og godkendt af University of MiamJeg Institutionel Animal Care og Use Udvalg. Den etiske komité for dyrs forskning, Nordsverige, godkendt alle andre forsøg med dyr.

    Representative Results

    I den aktuelle rapport beskriver vi en protokol til udvinding og beregningsmæssige behandling af BCM data i gnaver pancreas (og andre væv) ved hjælp af NIR-OPT (figur 1). Som illustreret i figur 2, er vævet autofluorescense fra pancreas prøve som forventet markant nedsat i NIR spektret. Dette fører til en betydelig forøgelse af den gennemsnitlige signal-støj-(S: N)-forhold for vurderingen af ​​insulin mærkede Langerhanske øer. Ved tilpasningerne af OPT til billeddannelse i NIR del af spektret, som beskrevet heri, kan i det mindste tre specifikke kanaler visualiseres med tilstrækkelig S: N-forhold for at muliggøre vurdering af antistofmærkede celletyper i hele volumenet af det murine pancreas med særskilte kanal separation (se figur 3 og 4). Anvendt til billedbehandling af diabetogene processer og / eller BCM vurderinger i almindelighed, teknikken således muligt for de visualisering og kvantificering afinsulin positive områder i forhold til omgivende og / eller interaktion celletyper (se figur 4). Sådanne vurderinger er takket være den øgede væv indtrængningsdybde opnået i NIR området muligt at udføre i meget større enheder end tidligere, herunder rotte-pancreas, som er 3-5 gange større end dens mus modstykke (se figur 5). Uanset om synlige eller NIR bølgelængder anvendes, kan anvendelsen af CLAHE væsentlig grad lette OPT baserede vurderinger af BCM i forskellige genetiske og fysiologiske betingelser ved at øge detektionsfølsomheden for teknikken (se figur 6). En plan for den udviklede prøveholderen er vist i figur 7.

    Figur 1
    Figur 1. Flowchart, der viser de kritiske trin for passiv baserede analyser af BCM i murine bugspytkirtel. Den tid, der kræves til at vurdere en typisk mus bugspytkirtlen er 13-14 dage. Størstedelen af ​​tiden forbruges under vævsbehandling og immunohistokemisk farvning (10 dage), tissue clearing kræver cirka 2 dage, mens længden af ​​scanning er afhængig af eksponeringstiden krævede tid (normalt omkring 1 time). Den efterfølgende beregningsmæssige behandling typisk udføres inden for en dag. Bemærk, er den relativt lange farvningsprotokol ideelt egnet til batchbehandling af større mængder af enheder.

    Figur 2
    Figur 2. Signal-støj-forhold for BCM vurderinger ved forskellige bølgelængder. En mus duodenal pancreas lap, farvet for insulin og med en cocktail af fluorochrom-konjugerede sekundære antistoffer (Alexa 488, 594, 680 og750), blev anvendt til bestemmelse S: ​​N-forhold ved forskellige bølgelængder. A, Billederne viser den første projektion ramme for hvert signal kanal. B, graf, der illustrerer middelværdien S: N for hver signalkanal. Forholdene blev bestemt som den gennemsnitlige ø-intensiteten (baseret på 215 øer) divideret med baggrunden intensitet (det endogene væv fluorescens fra det exokrine væv). C, Graf, der viser S: N-forhold for de enkelte øer i hver kanal normaliseret til S: N opnået for Alexa 594 kanalen. Envejs-ANOVA blev anvendt til statistiske analyser. Signifikansniveauer angivet svarer til ** p <0,01. Scale bar i (A) svarer til 1 mm. Klik her for at se større figur .

    Figur 3
    Figur3. Kanaladskillelse. A, var sekundære antistoffer konjugeret med Alexafluor farvestoffer anført i tabellen immobiliseret separat på proteinG-sepharoseperler. B blev de fluorescerende perler indlejres derefter på forskellige niveauer i en agarose fantom og filmede med angivne filtre.

    Figur 4
    Figur 4. OPT flerkanalshandel imaging i diabetesforskning. A, OPT baseret iso-overflade rekonstruktion af en bugspytkirtel (12 uger, duodenal lap) fra Non fede diabetiske (NOD) model for type 1 diabetes. Prøven farvet for insulin (ø-β-celler, pseudo farvet blå) glatmuskel α-actin (blodkar, røde) og CD3 (infiltrerende T-lymfocytter, grøn). De tilsvarende sekundære anvendte antistoffer var, Cy3, IRDye-680 og DyeLight-750 hhv. Denmellemværker (A'-A'' ') viser de enkelte signalkanaler. B, OPT billede (blow up view) af en muselever lobe (lobus skumle lateralis) podet med syngeniske holme og filmede med NIR-OPT to uger efter transplantationen. De insulin udtrykker holme er pseuodocolored i blå og den glatte muskel α-actin positive skibe er i rødt. Den tilgang gør det muligt vurderinger af ø-transplantat fordeling inden for vaskulære netværk. Scale bars svarer til 1 mm.

    Figur 5
    Figur 5. NIR-OPT letter billeddannelse af større enheder. A, Iso-overfladegengivelse af BCM distribution i en rotte pancreas fra Zucker Fatty model for type 2 diabetes (milt lap på 9 måneder), eksemplificerer muligheden for at billedet forneden på rotte bugspytkirtlen skala ved NIR-OPT. Som bestemtved denne teknik den viste lap er ~ 6 gange større (volumen / volumen) end mus modpart og huser 10139 insulin udtrykker Langerhanske øer, hvis β-cellevolumen udgør 1,32% af den samlede lobular volumen. B, tomografisk tværsnit svarende til den punkterede linie i (A) viser, at øer fra alle dybder i vævet detekteres. C, Iso-overfladegengivelse af BCM fordeling i en mus bugspytkirtlen (milt lap på 8 uger), der vises som en størrelse reference. Den viste lap huser 2490 insulin udtrykkende øer, hvis β-cellevolumen udgør 0,89% af den samlede lobular volumen. The pancreas farves med GP anti-insulin efterfulgt af Alexa594 konjugeret gede-anti-GP (mus) og IRDye 680 konjugeret æsel anti-GP (rotte) antistoffer hhv. Enhederne i (AC) er afbildet i korrekt målestok, og omfanget baren (C) svarer til 2 mm.

    Figur 6 Figur 6. CLAHE letter påvisning af øer i det murine pancreas ved OPT billeddannelse. AC, Repræsentative iso-overflade afsmeltet passiv billeder af en C57BL / 6 mus bugspytkirtlen (milt lap på 8 uger) mærket for insulin. Iso-overflade rekonstruktioner af passiv billeder blev udført før (A, pseudo farvet grøn) og efter CLAHE protokollen blev anvendt (B, pseudo farvet rød). C, Overlay af de ikke-normaliserede data i (A) og de CLAHE behandlede data i (B). C'-C ", repræsentant stor forstørrelse overlejring af de ikke-normaliserede (A) og CLAHE behandlede (B) billeder. Som vist ved tilstedeværelsen af" røde kun "øer, det CLAHE script letter påvisning af små og lavt signal intensitet øer. I det aktuelle eksempel den afbildede eksemplar (efter CLAHE processing) husede 2419 øer med et volumen på 1,74 mm 3 (tal baseret på de tilsvarende ubehandlede fremskrivningsdata var 1057 øer with et volumen på 1,77 mm 3). D og E, eksempel data fra kontrol (D) og ob / ob mus model for type 2 diabetes 12 (E) efter 6 måneder til gennemførelse af CLAHE protokollen. Bemærk den massive almindelige stigning i ø-størrelse i ob / ob pancreas (E). I (D) og (E) bugspytkirtlen omrids (grå) er baseret på signalet fra væv autofluorescens. Scale bar i C er 500 um i AC. Målestokken i C "svarer 200 um i C 'og C''. Scale bar i E svarer til 1 mm (D) og (E). Billeder i (AC) er indrettet fra Hornblad et al 3 og blev dannet ved anvendelse af Bioptonics 3001 scanner.

    Figur 7
    Figur 7. Prøveholder til fastgørelse af passiv prøver. Prøven fastgøres ved at indsætte kanyler gennem agarose spacer via de forborede huller i flangerne. Holderen er hængslet til trinmotoren via enstærk magnet placeret i sin base. Denne opsætning udelader brugen af ​​ustabile lim og forhindrer uønskede bevægelser af prøven under scanning.

    Discussion

    De beskrevne teknikker til OPT billeddannelse muliggør ekstraktion af rumlige og kvantitative parametre i hele volumenet af det murine pancreas. På grund af begrænsninger i opnåelige opløsning for denne type mesoskopiske billeddannelse skal det bemærkes, at som for de fleste billeddannende modaliteter, jo større prøven den lavere opløsning (Selv om anvendelsen af ​​en højere opløsning CCD bør øge opløsningen af ​​OPT scanning) . Derfor, til vurdering af intakte pankreatiske mus lapper, er teknikken i øjeblikket ikke enkeltcelle-opløsning selvom tæt (ca. 15-20 um) 7. Stadig, for udvinding af BCM fordeling i mus bugspytkirtlen protokollerne har fremlagt data, som mere end godt matche dem, der opnås ved f.eks punkttælling morfometri 3,13 Det skal bemærkes, at selv om gennemførelsen af CLAHE-protokollen giver mulighed for påvisning af signifikant flere øer Disse øer er generelt mindre og ikke bidragte betragteligt til de overordnede β-celle-volumener.

    De immunhistokemiske involverede protokoller er forholdsvis lang (op til to uger), men de faktiske hænder på tid til klargøring af prøver er kort og derfor teknikken er velegnet til undersøgelse af store årgange af dyr 9. Hvis potentialet af heterogene spredningsmønstre er et fokus for undersøgelsen, skal det understreges, at der skal sørges for i trinene vedrørende fiksering og montering for at undgå at pancreasvæv bliver fikseret i en ugunstig måde og en flad ("spredt ud" ) mount af vævet skal stræbes efter at fremme sådanne vurderinger.

    Et vigtigt spørgsmål, når du udfører OPT er, at prøvens COM er fastsat til rotationsaksen, og at den ikke bevæger sig, enten lodret eller vandret, under scanningen procedure. Derfor er det vigtigt at have en stabil mekanisk setup og et velfungerende system for attaching prøven. Vi løste problemet ved at bygge en ny mount (fig. 7).

    Parallel geometri var ikke tilfældet for vores NIR-OPT eller Bioptonics 3001 scanner, der blev opdaget som en lodret forskydning mellem ryg-og forstykke positioner perifere objekter i fremskrivningen optagne billeder. Ved at justere objektet til kilden afstand i logfilen af ​​den respektive scanneren (se 2.3.1) kunne vi forbedre kvaliteten af ​​vores data og korrigere for geometriske forvrængninger Længst kanter af fremspringet billeder, som er af særlig betydning, når vurdere større eksemplarer.

    I den nuværende protokol, giver vi en antydning af filtersæt, der tillader visualisering af tre forskellige specifikke kanaler og en "anatomi" kanal i vurderinger af intakte pancreas præparater. Naturligvis disse indstillinger, kan moduleres bedre passer til fluorochromer anvendes til en given undersøgelse selvom, som med alle former for fluorescerendecent mikroskopi, skal den potentielle fare for signal gennemblødning vurderes nøje. Studiet af insulin mærkede øer med fluorokromer, der er begejstrede over 750 nm har endnu ikke været muligt ved os ved hjælp af metalhalogen, at vores opsætning udnytter. Det er muligt, at et kamera med endnu højere kvanteeffektivitet i de relevante bølgelængder i kombination med alternative lyskilder (f.eks diodelasere) kan øge potentialet for NIR-OPT yderligere og giver mulighed for billeddannelse ved endnu højere bølgelængder.

    OPT billeddannelse er en meget alsidig teknik til rumlige og kvantitative vurderinger af biomedicinsk prøve på mm-cm skala. Selv om de protokoller, der præsenteres her, er blevet udviklet med det primære formål i bugspytkirtlen / diabetes forskning, de burde være muligt at oversætte til forskning i andre arter, prøvetyper og markører. Ved potentiale til at visualisere flere forskellige kanaler i intakte pankreatiske præparater, NIR-OPT imaging fDERLIGERE rummer muligheden som et redskab til vurdering af udbredelsen specificiteten af ​​kontrastmidler bestemt til ikke-invasive vurderinger af andre afbildningsmodaliteter, så længe disse kontrastmidler kan udformes til at bære også en fluorofor påviseligt ved OPT.

    Disclosures

    Ingen interessekonflikter erklæret.

    Acknowledgements

    Dr. P. Lindström er anerkendt til at tilvejebringe ob / ob-mus. J. Lehtonen er anerkendt for assistance med videoproduktion og J. Gilbert for at få hjælp med redigering. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Diabetes Research Institute Foundation (AP), Juvenile Diabetes Research Foundation (AP og UA), Europa-Kommissionen (FP-7, Tilskudsaftale nr.:. CP-IP 228.933-2) (JS og UA), de Kempe Fonde, Umeå Universitet og den svenske forskningsråd til UA

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Methanol Scharlau ME03162500
    30% H2O2 Scharlau HI01362500
    Benzyl Alcohol Scharlau AL01611000
    Benzyl Benzoate Scharlau BE01851000
    Low-meltingpoint agarose LONZA 50100
    Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 158127
    DMSO Sigma-Aldrich D5879
    Triton-X100 Sigma-Aldrich T8787
    Mouse anti-aSMA-Cy3 Sigma-Aldrich C6198 Primary antibody
    Rabbit anti-CD3 Sigma-Aldrich C7930 Primary antibody
    Guinea Pig anti-Ins DAKO A0564 Primary antibody
    Donkey anti GP-IRDye680 LI-COR Biosciences 926-32421 Secondary antibody
    Goat anti Rb-DyeLight750 Thermo Scientific 35570 Secondary antibody
    Goat anti GP-Alexa594 Molecular Probes A-11076 Secondary antibody
    Goat anti GP-Alexa488 Molecular Probes A-11008 Secondary antibody
    Goat anti GP-Alexa594 Molecular Probes A-11012 Secondary antibody
    Goat anti GP-Alexa680 Molecular Probes A-21076 Secondary antibody
    Goat anti GP-Alexa750 Molecular Probes A-21039 Secondary antibody
    OPT Skyscan 3001 Bioptonics OPT-Scanner
    Leica MZ FLIII Leica Microsystems Stereomicroscope
    Leica Objective 0.5x Leica Microsystems 10446157
    Leica Camera adapter 1.0x Leica Microsystems 10445930
    EL6000 Metal Halide 11504115 Lightsource
    Liquid Light Guide 11504116
    Cuvette Hellma Analytics 6030-OG 55 x 55 x 52.5 mm
    Mirror Edmund Optics F68-334 50 x 50 mm
    Andor Ikon-M Andor Technology DU934N-BV Back-illuminated CCD
    Filterset Chroma Technology 41021-MZFLIII TXR, Alexa-594, Cy3
    Filterset Chroma Technology 41022-MZFLIII IRDye680, Alexa-680
    Filterset Chroma Technology 49037-MZFLIII Dylight750, Alexa-750
    ProteinG-Sepharose beads GE Healthcare 17-0618-01 Protein G Sepharose 4 Fast Flow
    Sodium Azide Sigma-Aldrich 08591 Sodium azide 0.1 M solution

    References

    1. Sharpe, J., et al. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296, 541-545 (2002).
    2. Cheddad, A., Svensson, C., Sharpe, J., Georgsson, F., Ahlgren, U. Image Processing Assisted Algorithms for Optical Projection Tomography. IEEE Trans. Med. Imaging. (2012).
    3. Hornblad, A., Cheddad, A., Ahlgren, U. An improved protocol for optical projection tomography imaging reveals lobular heterogeneities in pancreatic islet and beta-cell mass distribution. Islets. 3, 204-208 (2011).
    4. Holmberg, D., Ahlgren, U. Imaging the pancreas: from ex vivo to non-invasive technology. Diabetologia. 51, 2148-2154 (2008).
    5. Ahlgren, U., Gotthardt, M. Approaches for imaging islets: recent advances and future prospects. Adv. Exp. Med. Biol. 654, 39-57 (2010).
    6. Sharpe, J. Optical projection tomography. Annu. Rev. Biomed. Eng. 6, 209-228 (2004).
    7. Alanentalo, T., et al. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nat. Methods. 4, 31-33 (2007).
    8. Alanentalo, T., et al. High-resolution three-dimensional imaging of islet-infiltrate interactions based on optical projection tomography assessments of the intact adult mouse pancreas. J. Biomed. Opt. 13, 054070(2008).
    9. Alanentalo, T., et al. Quantification and Three-Dimensional Imaging of the Insulitis-Induced Destruction of beta-Cells in Murine Type 1 Diabetes. Diabetes. 59, 1756-1764 (2010).
    10. Sun, G., et al. Ablation of AMP-activated protein kinase alpha1 and alpha2 from mouse pancreatic beta cells and RIP2.Cre neurons suppresses insulin release in vivo. Diabetologia. 53, 924-936 (2010).
    11. Hornblad, A., Eriksson, A. U., Sock, E., Hill, R. E., Ahlgren, U. Impaired spleen formation perturbs morphogenesis of the gastric lobe of the pancreas. PLoS One. 6, e21753(2011).
    12. Lindström, P. The physiology of the Obese-Hyperglycemic Mice (ob/ob Mice). The Scientific World JOURNAL. 7, 665-685 (2007).
    13. Bock, T., Pakkenberg, B., Buschard, K. Genetic background determines the size and structure of the endocrine pancreas. Diabetes. 54, 133-137 (2005).

    Comments

    1 Comment

    Very interesting. this is not my field of study but I believe that your work is very important and it blows my mind. Christoffer Svensson, We know who has the BIG brains in the family. Congratulations on all your success and hard work I am proud of you. One day you have to take a couple of hours and sit down and explain it to me.
    Reply

    Posted by: Alexander S.January 15, 2013, 1:07 AM

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter