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 JoVE Biology

Un método de cuantificación sensible y específica para la determinación de suero miosina cardíaca proteína de unión-C por inmunoensayo electroquimioluminiscencia

1, 1, 1, 1

1Department of Cell and Molecular Physiology, Loyola University Chicago

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    Summary

    Biomarcadores de medición en muestras biológicas complejas es cada vez guían la toma de decisiones clínicas. Se describe un método altamente sensible para medir simultáneamente la miosina cardíaca proteína de unión-C, creatina quinasa MB, troponina I cardiaca y en muestras de suero de pacientes con infarto de miocardio y los sujetos de control sanos.

    Date Published: 8/08/2013, Issue 78; doi: 10.3791/50786

    Cite this Article

    Kuster, D. W. D., Barefield, D., Govindan, S., Sadayappan, S. A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay. J. Vis. Exp. (78), e50786, doi:10.3791/50786 (2013).

    Abstract

    Los biomarcadores son cada vez más importante en la toma de decisiones clínicas, así como la ciencia básica. Diagnóstico de infarto de miocardio (MI) es impulsado en gran medida mediante la detección de proteínas cardiacos específicos en el suero o plasma de los pacientes como un indicador de daño miocárdico. Después de haber demostrado recientemente que la miosina cardiaca proteína de unión-C (cMyBP-C) es detectable en el suero después de MI, se ha propuesto como un biomarcador potencial de MI. Los biomarcadores se detectan generalmente mediante ensayos inmunoenzimáticos sándwich tradicionales. Sin embargo, esta técnica requiere un gran volumen de muestra, tiene un pequeño rango dinámico, y puede medir sólo una proteína a la vez.

    A continuación os mostramos un inmunoensayo múltiplex en el que tres proteínas cardíacas se pueden medir simultáneamente con una alta sensibilidad. Medición cMyBP-C en uniplex o junto con creatina quinasa MB y troponina I cardiaca mostró una sensibilidad comparable. Esta técnica utiliza la Meso Escala Descubrimiento(MSD) método de multiplexación en una placa de 96 pocillos junto con electroquimioluminiscencia para la detección. Aunque sólo se necesitan pequeños volúmenes de muestra, se logran una alta sensibilidad y un amplio rango dinámico. Usando esta técnica, que mide cMyBP-C, MB de creatina quinasa y troponina I cardiaca en muestras de suero de 16 pacientes con MI y se compararon los resultados con 16 sujetos control. Hemos sido capaces de detectar los tres marcadores en estas muestras y encontramos los tres biomarcadores que aumentaron después de un IM. Esta técnica es, por lo tanto, adecuado para la detección sensible de los biomarcadores cardíacos en muestras de suero.

    Introduction

    La medición de bajas cantidades de proteína en muestras biológicas complejas, tales como el suero, es de creciente importancia clínica para el tratamiento del paciente, así como la ciencia básica. Por ejemplo, un aumento en los niveles séricos de biomarcadores cardíacos, tales como la troponina I, en un entorno clínico es compatible con infarto agudo de miocardio (MI) 1. Para detectar las proteínas en muestras de suero, ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima estándar (ELISA) es la técnica utilizada con mayor frecuencia, ya que tiene una alta sensibilidad y permite la cuantificación absoluta del analito. Sin embargo, las pruebas ELISA tradicionales requieren una cantidad relativamente grande de muestra (típicamente 100 l), tienen una alta señal de fondo en algunos fluidos biológicos, y están restringidos a la medición de un solo analito por ELISA 2.

    Recientemente, una nueva técnica de inmunoensayo se introdujo que evita muchos de estos inconvenientes. Este ensayo modificado, desarrollado por MSD, utiliza electrochemiluminesccia (ECL) para la detección de la señal, lo que permite un fondo muy bajo y un aumento de la sensibilidad, que permite el uso de volúmenes de muestra pequeños. Electroquimioluminiscencia se basa en el reportero molécula de rutenio (II) trisbipyridal, que se une a los anticuerpos de detección. Esta molécula indicadora emite luz a 620 nm de la estimulación eléctrica de la parte inferior de la placa de 96 pocillos que tiene electrodos de carbono integrados en ellos 3. Además, mediante el uso de recubrimiento lugar, múltiples anticuerpos de captura pueden ser recubiertas en un pocillo (hasta 10 en una placa de 96 pocillos), lo que permite la cuantificación simultánea de diferentes proteínas en una sola muestra 4. Esta técnica se ha utilizado recientemente para medir los perfiles de citoquinas proinflamatorias en suero de 5,6. Las placas multiplex de MSD se comparan favorablemente con otras plataformas de ensayo multiplex 7.

    Usando MSD como la plataforma de ensayo principal, desarrollamos además un encargo placa 3-plex que cuna vez cuantificar el nivel de miosina cardiaca proteína de unión-C (cMyBP-C), MB de creatina-cinasa (CK-MB) y troponina I (cTnI), y los resultados se compararon con la detección monoplex de cMyBP-C. CK-MB y cTnI son marcadores biológicos bien establecidos para MI. Sin embargo, los aumentos de estos biomarcadores pueden ser causadas por patologías distintas de MI, por ejemplo, miocarditis o insuficiencia renal 8. Esto aboga por la adición de biomarcadores adicionales para aumentar la especificidad del diagnóstico de MI. Recientemente hemos demostrado que cMyBP-C es también un biomarcador potencial para MI 9. cMyBP-C es una proteína asociada a filamento grueso que se expresa en el corazón, 10-12, pero no en los músculos esqueléticos o lisos. Por lo tanto, el aumento del nivel de cMyBP-C en el sistema circulatorio es un indicador específico de daño cardíaco 13.

    En este estudio, se comparó la detección de uniplex cMyBP-C con el uso de un ensayo de 3-complejo de encargo para medir los niveles séricos decMyBP-C, CK-MB y cTnI en el suero de los pacientes con infarto de miocardio. En el futuro, esta técnica de firma puede ser utilizada para diagnosticar infarto de miocardio en pacientes con dolor torácico en urgencias.

    La junta de revisión institucional (IRB) de la Universidad de Loyola de Chicago aprobó el estudio para el uso de muestras humanas deidentified y el uso del inmunoensayo (LU # 20392).

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    Protocol

    1. Uniplex cMyBP-C Ensayo

    1. El día antes del experimento, cubra la placa estándar de 96 pocillos desnuda MSD con el anticuerpo de captura. Para cMyBP-C, utilizar un volumen de 30 l de anticuerpo anti-ratón cMyBP-C monoclonal (gelatina libre) a una concentración de 5 g / ml diluido en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
    2. Dado que el pozo es hidrófobo, pipetear la solución en la esquina inferior del pozo; luego toque los lados de la placa para extender la solución sobre todo el bien.
    3. La placa se cubre con un sellador de placas y se incubaron O / N a 4 ° C sin agitación.
    4. Eliminar la solución de anticuerpo de captura pulsando la solución a lo largo de un sumidero y luego en una pila de toallas de papel. La unión no específica a la placa se bloqueó mediante la adición de 150 l de un 5% (w / v) de una solución bloqueador (BSA de alto grado) en PBS a cada pocillo.
    5. Tapar la placa e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación a 700 rpm.
    6. Durante la etapa de bloqueo, se preparan las normas y sejemplos. Hacer la serie estándar mediante la dilución de fragmento de proteína recombinante cMyBP-C (aminoácidos 1-271) a una concentración de partida de 2000 ng / ml en 1% (w / v) Un bloqueador / PBS. A continuación, se diluye en serie en un factor de 5 en 1% (w / v) Un bloqueador / PBS. Total de los estándares se utilizaron 7 + 1 blanco (1% (w / v) Un bloqueador de PBS solo /).
    7. Eliminar la solución de bloqueo y se lava la placa 3x con 150 0,05% Tween-20/PBS l (v / v). Cada vez, eliminar la solución de lavado invirtiendo la placa sobre un fregadero. Después de la tercera etapa de lavado, película vigorosamente la placa sobre un lavabo y golpea suavemente la placa vigorosamente sobre una capa de papel de cocina hasta que esté completamente seco. Este es un paso crucial, ya que los volúmenes de incubación son pequeñas, y cualquier solución de lavado restante se diluye significativamente la siguiente incubación.
    8. Pipetear 25 l de estándares y muestras en los pocillos. Tapar la placa e incubar a temperatura ambiente, con agitación a 700 rpm durante 1 hora.
    9. Preparar la solución de anticuerpo de detección a 1 g / ml en 1% bloqueador de A / PBS. A custom hizo anticuerpo cMyBP-C (aminoácidos epítopo 2-14) con MSD SULFO-TAG etiquetado sirve como anticuerpo de detección. Los kits están disponibles para sulfo-TAG etiquetado, por lo que es un procedimiento relativamente simple para etiquetar cualquier anticuerpo.
    10. Repetir la etapa de lavado como se ha descrito en el paso 1.4.
    11. Añadir 25 l de solución de anticuerpo de detección a cada pocillo, sellar la placa, y se incuba a TA durante 1 h en un agitador de placas ajustado a 700 rpm.
    12. Durante el período de incubación, ejecute MSD de demostración-plate (placa con luces LED) para garantizar el correcto funcionamiento del Imager Sector y software (consulte la sección de reactivo). También, se diluye la lectura-tampón, que se proporciona por MSD, mediante la adición de 5 ml de tampón de lectura-4x a 15 ml de agua destilada.
    13. Repetir la etapa de lavado como se ha descrito en el paso 1.4.
    14. Añadir 150 l de buffer de lectura a cada pocillo utilizando una pipeta multicanal. Asegúrese de evitar burbujas de aire (pipeteo reverso es un método adecuado). Después de la adición de la lectura-buffer, escanear inmediatamente la placa en el SectorImager.

    2. 3-plex cMyBP-C, CK-MB y cTnI Ensayo

    1. Una placa de 96 pocillos 3-plex y diluyente soluciones se dejaron equilibrar a la temperatura ambiente antes de su uso. Esta placa es pre-recubiertas con anticuerpos de captura para cMyBP-C, CK-MB y cTnI por MSD.
    2. Añadir 25 l de 1% (w / v) Un bloqueador / PBS a cada pocillo. Pulse en los lados de la placa para asegurarse de que todo el pozo está cubierto por la solución.
    3. Sellar la placa con un sellador de placas, coloque la placa en un agitador de placas, y agitar a 700 rpm durante 30 min.
    4. Mientras tanto, se preparó una serie de dilución de los calibradores individuales. Debido a que cada pocillo tiene tres anticuerpos de captura tres calibradores deben ser mezclados y diluidos en serie antes de su uso. Diluir cMyBP-C recombinante, CK-MB (MSD), y cTnI (MSD) juntos en 1% (w / v) Un bloqueador / PBS para crear una muestra con 2000 ng / ml cMyBP-C, 100 ng / ml CK- MB, y 25 ng / ml de cTnI (muestra A).
    5. Un volumen final de al menos 100 l se prepara para cada estándar. Acompletar la serie estándar, diluir en serie las muestras están en un factor de 5. Usa 25 l de muestra A en 100 l 1% (w / v) Un bloqueador / PBS para crear muestra B. A continuación, utilice 25 l de la muestra B en 100 l 1% (w / v) Un bloqueador / PBS para crear muestra C , y así sucesivamente. Muestras de suero humano de 16 pacientes con IM y 16 sujetos de control se utilizan para medir los niveles de cTnI cMyBP-C, CK-MB, y. Estas muestras se diluyeron 2 veces en 1% (w / v) Un bloqueador / PBS.
    6. Añadir 25 l de los estándares y las muestras diluidas a la 25 l ya presente en los pocillos de la placa 3-plejo. Es importante también incluir un espacio en blanco (sólo diluyente). Para establecer la técnica, las muestras se cargan en triplicado técnicas. De lo contrario, los duplicados son suficientes.
    7. Sellar la placa de nuevo (sellador de placas puede ser reutilizado) y se incuba en un agitador de placas (700 rpm) a temperatura ambiente durante 2 h.
    8. Justo antes de que se terminó la incubación, se preparó la solución de anticuerpo de detección. El diluyente utilizado es 1% (w / v) en PBS Un bloqueador. Todos THRanticuerpos de detección ee sulfo-etiquetados se diluyen juntos en una concentración final de 1 mg / ml cada uno. Detección de anticuerpos se proporcionan normalmente a una concentración madre 50 veces.
    9. Para una placa de 96 pocillos completa, se necesita 2.700 l de solución total diluido (con pipeteado de error incluido). Añadir 54 l de cada anticuerpo de detección a 2.538 l 1% (w / v) Un bloqueador / PBS.
    10. Después de 2 horas, eliminar soluciones agitando vigorosamente por la placa por encima de un fregadero. Lavar los pocillos 3 veces con 150 l de 0,05% de Tween-20 en PBS. Añadir 25 l de solución de anticuerpo de detección a cada pocillo usando una pipeta multicanal, y los lados de la placa son parches para garantizar que todo el pozo está cubierto por la solución.
    11. Tapar la placa e incubar durante 1 hora con agitación a 700 rpm.
    12. Durante el período de incubación, ejecute MSD de demostración-plate (placa con luces LED) para garantizar el correcto funcionamiento del Imager Sector y software. También diluir la lectura-tampón, que se proporciona por MSD, mediante la adición de 5 ml de 4x lecturaamortiguar a 15 ml de agua destilada.
    13. Repetir el paso de lavado descrito en el paso 2.8.
    14. Añadir 150 l de tampón de lectura a cada pocillo usando una pipeta multicanal. Evitar las burbujas de aire es crítico (pipeteo inverso es un método adecuado). Después de la adición de la lectura-buffer, escanear inmediatamente la placa en el Imager Sector.

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    Representative Results

    Los principios básicos y de flujo de trabajo de ensayo de la 3-plex se muestran en la Figura 1, el flujo de trabajo y en general se describe en la Tabla 1. Ensayos de Uniplex trabajan a lo largo del mismo principio, excepto que toda la parte inferior así se recubre con un anticuerpo de captura. Detección de la señal se realiza mediante ECL en que se aplica una señal eléctrica a la parte inferior del pozo. Esto, a su vez, inicia una producción local de la luz a través de una reacción química de la lectura-tampón con la etiqueta de sulfo-TAG en el anticuerpo de detección. Esto conduce a la baja y alta de fondo sensibilidad del ensayo. En la Figura 2, la curva estándar de cMyBP-C en el ensayo de uniplex se compara a la de cMyBP-C en el ensayo de 3-plejo. Ambos ensayos muestran una alta sensibilidad y un alto rango dinámico. Los niveles de detección y los niveles de cuantificación se muestran en la Tabla 2 y son comparables en ambos uniplex y ensayos de 3-plex. Niveles de detección de cTnI y CK-MB son als,O se muestra en la Figura 3 y en la Tabla 2. La variabilidad inter-operador se determinó mediante la medición de muestras idénticas (n = 2, 3 repeticiones técnica) por dos operadores diferentes y se encontró una variabilidad a ser baja (CV 8,5%). La reactividad cruzada de anticuerpos de detección con los otros dos calibradores se estudió mediante la incubación de las curvas de calibración individuales de todos los tres calibradores con anticuerpos de detección individuales (Figura 4). Sólo baja cantidad de reactividad cruzada se observó entre la CK-MB calibrador y tanto cTnI y anticuerpos de detección cMyBP-C, mientras que no se observó reactividad cruzada entre los otros calibradores y los anticuerpos de detección.

    Como prueba de la aplicabilidad del ensayo para la detección de la lesión cardiaca, los niveles en suero de 16 pacientes con IM se compararon con un grupo control (n = 16). Utilizando la placa 3-plex, se determinaron los niveles séricos de cMyBP-C, CK-MB y cTnI. Los tres biomarcadores se incrementaron en los temas MI (véaseFigura 5) de 3,7 veces (cMyBP-C) a 12,2 veces (CK-MB), aunque la variación en los niveles séricos fue la más baja en el grupo cMyBP-C.

    Proceso Uniplex ensayo Ensayo de 3-plex
    Experimento días 0 Placa de la capa con anticuerpo de captura Durante la noche N / A
    Experimento 1 día Bloquear la placa 1 hr 30 min
    Preparar muestras y series estándar
    Se incuba con muestras y los estándares 1 hr 2 hr
    Incubar con anticuerpo de detección 1 hr 1 hr
    Añadir reactivo de detección y leerplaca

    Tabla 1. Visión general de flujo de trabajo de uniplex y ensayos multiplex.

    LLOD (ng / ml) LLOQ (ng / ml) ULOQ (ng / ml)
    cMyBP-C (uniplex) 0,126 ± 0,007 0,567 ± 0,073 400 ng / ml
    cMyBP-C (3plex) 0,057 ± 0,022 0.469 ± 0.171 400 ng / ml
    CK-MB (3-plex) 0,038 ± 0,014 0,587 ± 0,213 100 ng / ml
    cTnI (3plex) 0,033 ± 0,011 0,147 ± 0,053 25 ng / ml

    Tabla 2. Los límites de detección de uniplex y calibradores 3 complejos. LLOD, límite inferior de detección, se define como la concentración calculada de la señal del blanco + 3 veces la desviación estándar de las muestras en blanco. LLOQ, límite inferior de cuantificación, se define como un valor más alto que LLOD, con un coeficiente de varianza (recíproco de la relación señal a ruido) menor que 20%, y una recuperación entre 80-120%. ULOQ, límite superior de cuantificación, se define como la concentración más alta analizada que se puede medir con un coeficiente de variación inferior al 20% y una recuperación entre 80-120%.

    Figura 1
    Figura 1. Se muestra resumen esquemático de la placa y el flujo de trabajo. A) placa de 96 pocillos. Cada pocillo está recubierta con tres diferentes anticuerpos de captura, es decir, contra cMyBP-C, CK-MB y cTnI. La cuarta disponiblespunto de poder no se utiliza y está recubierto con BSA. B) de flujo de trabajo de la 3-plex ELISA. La placa de pre-revestido (paso 1) se bloquea y luego se añaden las muestras de suero o calibradores a cada pocillo y se dejó que se uniera (paso 2). cMyBP-C (rombos rojos), CK-MB (verde rectángulo) y cTnI (oval) se unen a sus respectivos anticuerpos de captura. Después de lavar las proteínas no unidas, se añaden los-tag-etiquetados sulfo anticuerpos de detección (paso 3). Ellos se unirán a la cMyBP-C, CK-MB, o proteínas de cTnI que se une a su anticuerpo de captura. Después de lavar anticuerpo de detección no unido, se añade búfer de lectura y la placa se analiza. Una señal eléctrica a la parte inferior de la placa inicia una reacción química local de la sulfo-TAG con el búfer de lectura, que conduce a la producción de luz (paso 4). La cantidad de luz es directamente proporcional a la cantidad de SULFO-TAG anticuerpo de detección marcado unido. El sensor CCD de recables de la luz y permite distinguir los diferentes puntos dentro de cada pocillo y por lo tanto, la señal procedente de cada analito (paso 5).

    La figura 2
    Figura 2. Curva estándar de cMyBP-C calibrador mide en uniplex o en 3-plejo. La misma serie estándar se midió en un ensayo de uniplex, y en la placa 3-plejo. El estándar de la serie comenzó en 2000 ng / ml y se diluyó en serie 5x con la concentración más baja de ser 0,128 ng / ml. Además, diluyente se usó como una muestra en blanco. El área de detección del ensayo se muestra en gris. La línea inferior indica el límite inferior de detección (LLOD), que se define como la concentración calculada de la señal en blanco + 3 veces la desviación estándar de los valores en blanco. El límite superior de detección se define como tél concentración más alta de la serie estándar que se puede medir con fiabilidad. Ambas curvas estándar UNIPLEX y 3-plex cMyBP-C son comparables. Los límites de detección se muestran en la Tabla 2. au: unidades arbitrarias.

    Figura 3
    Figura 3. Las curvas de calibración de CK-MB y cTnI. Las curvas de calibración de CK-MB y cTnI, que se midieron simultáneamente con cMyBP-C en la placa 3-plex. Ambos calibradores muestran una alta sensibilidad y un gran rango dinámico. En gris se muestra el área de detección del ensayo. La línea inferior indica el límite inferior de detección (LLOD), que se define como la concentración calculada de la señal en blanco + 3 veces la desviación estándar de los valores en blanco. El límite superior de detección se define como la concentración más alta de la SE estándar Ries fiable que se puede medir. Los límites de detección se muestran en la Tabla 2. au: unidades arbitrarias.

    Figura 4
    La Figura 4. La reactividad cruzada de los anticuerpos de detección de 3 complejos. Curvas estándar independientes de cMyBP-C, CK-MB y cTnI se prepararon y se incubaron en la placa 3-plex. Cada curva estándar fue que se sondeó con anticuerpos de detección individuales, para evaluar la cantidad de reactividad cruzada entre los anticuerpos de detección individuales (por ejemplo cMyBP-C) y los otros calibradores (por ejemplo, CK-MB y cTnI). La reactividad cruzada fue baja en el ensayo 3-plex. Haz clic aquí para ver más grande la figura .

    Figura 5 "fo: content-width =" 3 pulgadas "fo: src =" / files/ftp_upload/50786/50786fig5highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50786/50786fig5.jpg "/>
    Figura 5. Niveles de biomarcadores en el suero de MI y los sujetos de control medidos con el ensayo 3-plex. Niveles de cMyBP-C, CK-MB y cTnI se midieron simultáneamente mediante un ensayo de 3 complejos en muestras de suero de 16 sujetos control y 16 pacientes con IM. Los datos se muestran en diagramas de caja y bigotes (bigotes representan el 10 º y 90 º percentil). , Se observaron mayores niveles de los tres biomarcadores en el suero de pacientes con IM en comparación con el grupo de control. Debido a que los datos no mostraron una distribución normal (probado por D'Agostino Pearson ómnibus), la prueba estadística de Mann-Whitney no paramétrico se utilizó para probar las diferencias entre los grupos control y MI. # P <0,001

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    Discussion

    En este estudio, mostramos la aplicabilidad de un inmunoensayo múltiplex para la detección de múltiples biomarcadores cardíacos en el suero de los pacientes. Esta técnica tiene numerosas ventajas sobre ELISA tradicional. En primer lugar, ECL en el kit de ensayo se utiliza en lugar de la detección colorimétrica. En ECL, una señal eléctrica estimula la producción local de la propiedad medida (la luz), desacoplando así el caso de la estimulación de la señal, lo que reduce el fondo 14. Esto permite una alta sensibilidad, como se puede ver en la Tabla 2.

    Multiplexación el ensayo no resulta en una pérdida de la sensibilidad para la detección de cMyBP-C, como se puede ver en la Figura 2 y la Tabla 2. cMyBP-C medido en uniplex mostró un rango de sensibilidad y detección comparable a cMyBP-C medido simultáneamente con CK-MB y cTnI 13. Mediciones simultáneas reducir sustancialmente el volumen de muestra necesaria para MEDIDASts, que puede ser un factor crítico cuando se trabaja con muestras biológicas raras, así como reducir el tiempo dedicado a correr múltiples ensayos UNIPLEX.

    Como con cualquier inmunoensayo, el ensayo es altamente dependiente de la calidad de los anticuerpos usados. La afinidad, especificidad y avidez de los anticuerpos de captura y detección es el principal determinante de la sensibilidad del ensayo 15. Diferentes pares de anticuerpos deben ser juzgados para ver qué combinación de anticuerpos de captura y detección proporciona la mayor sensibilidad y rango dinámico. Cuando se utilizan técnicas de multiplexación, los anticuerpos de captura deben ser lugar recubierto en el pozo. Esto significa que un volumen bajo, solución altamente concentrada se vio en parte del pozo (véase la figura 1) en contraste con la solución de recubrimiento utilizado en el ensayo uniplex o en ELISA convencional. Debe evaluarse si el anticuerpo de captura funciona tan bien con la capa de terreno como lo hace con la solución de recubrimiento. La reactividad cruzada de losanticuerpos o calibradores con otro par de anticuerpos también pueden dar lugar a falsos resultados positivos 2,15.

    Para este estudio, una placa de múltiplex por encargo fue diseñado en cooperación con MSD. A pesar de una serie de placas multiplex pre-recubiertos están disponibles comercialmente, esta innovación en particular requiere la optimización del ensayo debido a una nueva diana (cMyBP-C) se multiplexa con los ensayos de catálogo previamente optimizados (CK-MB y cTnI). Como tal, una desventaja obvia de este método es el requisito añadido para un lector de placas especializado y placas que contienen electrodos para detectar la señal de ECL. A pesar de correr un ensayo múltiple contra múltiples ensayos UNIPLEX reducirá los costos generales, un lector de placas debe ser comprado inicialmente 2.

    Utilizando el inmunoensayo 3-plex los niveles de liberación de biomarcador de cMyBP-C, CK-MB y cTnI se midió en pacientes con IM y se compararon con un grupo de control. El doble cambio de aumento en thgrupo de control e difería entre los tres biomarcadores (véase la Figura 4), ​​al igual que la variación en el grupo de MI. La variación en los niveles de biomarcadores se espera en una colección de los pacientes con IM, tal como el tiempo de muestreo de sangre, el tamaño del infarto, así como una serie de otros factores que puedan contribuir a la liberación de proteínas cardíacas y su posterior degradación en la circulación. Si el nivel de los biomarcadores individuales se correlaciona con los parámetros clínicos, tales como el tamaño del infarto, merece un estudio ulterior.

    Traduciendo estos resultados directamente a su uso en la sala de emergencia para detectar MI requiere una serie de retos que superar. El principal de ellos es el tiempo el protocolo necesario para producir resultados, incluso con placas pre-recubiertas lleva 3 ½ hr. Al igual que con los ensayos de troponina utilizados en la actualidad, el ensayo debe ser optimizado para la detección rápida, lo que permite un diagnóstico rápido.

    En conclusión, hemos desarrollado un ensayo de la firma en la que dos se conocenn biomarcadores cardíacos y un potencial biomarcador cardiaco, cMyBP-C, se demostraron para detectar simultáneamente la presencia de la lesión miocárdica en pacientes con infarto de miocardio por la cuantificación de los títulos séricos de proteínas cardíacas.

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    Disclosures

    Una solicitud de patente completa está pendiente (solicitud n º de serie 13/464, 466, Pub. No. EE.UU. 2012/0282618 A1 y Fecha:. 05/04/12) para determinar los factores de riesgo asociados a la degradación cMyBP-C y la liberación en el fluido corporal humano y cuantificar el nivel de cMyBP-C en el fluido corporal humano.

    Acknowledgements

    Este estudio fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones R01HL105826 y K02HL114749 (Dr. Sadayappan), y la Asociación Americana del Corazón Midwest Becas; 11PRE7240022 (Mr. Barefield) y 13POST14720024 (Dr. Govindan). Los autores agradecen la asistencia del Dr. Jimmy Page, Jill Clampit y el Dr. John Hudson, MSD, por su excelente apoyo técnico y la literatura en el desarrollo del ensayo.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Reagents
    MSD Read-Buffer T (4X) with surfactant Meso Scale Discovery R92TC-2  
    Tween-20 Acros 9005-64-5  
    MSD Blocker A Meso Scale Discovery R93BA-1  
    Phosphate buffered saline, 10X Fisher BioReagents BP399-4 Filter before use
    Myosin binding protein C antibody, mouse monoclonal (E7), gelatin free Santa Cruz SC-137180L For coating, antibody has to be gelatin free
    Plates and Equipment
    Multi-Array 96-well standard plate Meso Scale Discovery L15XA-3  
    A prototype 3-plex, four-spot, 96-well plate with cMyBP-C, cTnI and CK-MB Meso Scale Discovery N452A-1  
    ThermaSeal Sealing Film Life Science Products Inc. ST-3098  
    MSD SECTOR Imager 2400A Meso Scale Discovery  
    MTS 2/4 digital microtiter shaker IKA 3208001  

    References

    1. Thygesen, K., et al. Third universal definition of myocardial infarction. Eur. Heart J. 33, 2551-2567, doi:10.1093/eurheartj/ehs184 (2012).
    2. Leng, S.X., et al. ELISA and multiplex technologies for cytokine measurement in inflammation and aging research. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 63, 879-884 (2008).
    3. Thompson, I., et al. Competitive electrochemiluminescence wash and no-wash immunoassays for detection of serum antibodies to smooth Brucella strains. Clin. Vaccine Immunol. 16, 765-771, doi:10.1128/CVI.00006-09 (2009).
    4. Kingsmore, S.F. Multiplexed protein measurement: technologies and applications of protein and antibody arrays. Nat. Rev. Drug. Discov. 5, 310-320, doi:10.1038/nrd2006 (2006).
    5. Altan, Z.M., et al. A long-acting tumor necrosis factor alpha-binding protein demonstrates activity in both in vitro and in vivo models of endometriosis. J. Pharmacol. Exp. Ther. 334, 460-466, doi:10.1124/jpet.110.166488 (2010).
    6. Patel, K.D., et al. High sensitivity cytokine detection in acute coronary syndrome reveals up-regulation of interferon gamma and interleukin-10 post myocardial infarction. Clin. Immunol. 133, 251-256, doi:10.1016/j.clim.2009.07.007 (2009).
    7. Fu, Q., Zhu, J., & Van Eyk, J.E. Comparison of multiplex immunoassay platforms. Clin. Chem. 56, 314-318, doi:10.1373/clinchem.2009.135087 (2010).
    8. Mahajan, V.S. & Jarolim, P. How to interpret elevated cardiac troponin levels. Circulation. 124, 2350-2354, doi:10.1161/CIRCULATIONAHA.111.023697 (2011).
    9. Govindan, S., et al. Cardiac myosin binding protein-C is a potential diagnostic biomarker for myocardial infarction. J. Mol. Cell Cardiol. 52, 154-164, doi:10.1016/j.yjmcc.2011.09.011 (2012).
    10. Barefield, D. & Sadayappan, S. Phosphorylation and function of cardiac myosin binding protein-C in health and disease. J. Mol. Cell Cardiol. 48, 866-875, doi:10.1016/j.yjmcc.2009.11.014 (2010).
    11. Kuster, D.W., et al. Cardiac myosin binding protein C phosphorylation in cardiac disease. J. Muscle Res. Cell Motil. 33, 43-52, doi:10.1007/s10974-011-9280-7 (2012).
    12. Sadayappan, S. & de Tombe, P.P. Cardiac myosin binding protein-C: redefining its structure and function. Biophys. Rev. 4, 93-106, doi:10.1007/s12551-012-0067-x (2012).
    13. Sadayappan, S. Cardiac myosin binding protein-C: a potential early-stage, cardiac-specific biomarker of ischemia-reperfusion injury. Biomark Med. 6, 69-72, doi:10.2217/bmm.11.100 (2012).
    14. Fichorova, R.N., et al. Biological and technical variables affecting immunoassay recovery of cytokines from human serum and simulated vaginal fluid: a multicenter study. Anal. Chem. 80, 4741-4751, doi:10.1021/ac702628q (2008).
    15. Malekzadeh, A., et al. Challenges in multi-plex and mono-plex platforms for the discovery of inflammatory profiles in neurodegenerative diseases. Methods. 56, 508-513, doi:10.1016/j.ymeth.2012.03.017 (2012).

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