Automatic Translation

This translation into Hebrew was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Medicine

כימות של Tacrolimus לדיכוי מערכת החיסון בכתמי דם יבש באמצעות LC-MS / MS

1, 1, 1, 1, 2, 3, 4, 1

1iC42 Clinical Research and Development, University of Colorado, Anschutz Medical Campus, 2Division of Clinical Pharmacology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 3Food and Drug Administration (FDA), Center of Drug Evaluation Research - Office of Generic Drugs, 4Transplant Clinical Research, University of Cincinnati

Article
    Downloads Comments Metrics Publish with JoVE

    You must be subscribed to JoVE to access this content.

    Enter your email to receive a free trial:

    Welcome!

    Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!


    Admit it, you like to watch.

     

    Summary

    Cite this Article

    Shokati, T., Bodenberger, N., Gadpaille, H., Schniedewind, B., Vinks, A. A., Jiang, W., et al. Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS. J. Vis. Exp. (105), e52424, doi:10.3791/52424 (2015).

    Abstract

    Tacrolimus מעכב calcineurin הוא אבן הפינה של רוב פרוטוקולי טיפול מדכא חיסון לאחר השתלת איברים מוצקה בארצות הברית. Tacrolimus הוא תרופת מדד טיפולית צרה וכגון דורש ניטור תרופה טיפולי והתאמת מינון המבוסס על ריכוזי שוקת דם כולה. כדי להקל על תרופה טיפולית בית וניטור דבקות, האוסף של כתמי דם יבשים הוא מושג אטרקטיבי. אחרי אצבע מקל, המטופל אוסף טיפת דם על נייר סינון בבית. אחרי הדם מיובש, הוא ישלח למעבדה אנליטית שבי tacrolimus הוא לכמת באמצעות ספקטרומטר מסת כרומטוגרפיה הנוזלי-טנדם ביצועים גבוהים (HPLC-MS / MS) בשילוב עם צעד פשוט מדריך למשקעי חלבון ומיצוי טור מקוון.

    לניתוח tacrolimus, דיסק 6 מ"מ אגרוף מהמרכז הרווי של נקודת הדם. נקודת הדם הומוגני באמצעות בלנדר כדורND אז חלבונים הם זירז עם מתנול / 0.2 M 4 ZnSO מכיל הסטנדרטי D הפנימי 2, 13 C-tacrolimus. לאחר vortexing וצנטריפוגה, של supernatant 100 μl מוזרק לתוך עמודת חילוץ מקוונת ונשטפה עם 5 מיליליטר / דקה של 0.1 חומצה / אצטוניטריל פורמית (7: 3, v: v) עבור 1 דקות. מכאן והלאה, שסתום המיתוג מופעל וanalytes-סמוק בחזרה על טור אנליטי (ומופרד באמצעות 0.1% שיפוע חומצה / אצטוניטריל פורמית). Tacrolimus הוא לכמת במצב החיובי רב התגובה (MRM) באמצעות ספקטרומטר מסת טנדם.

    Assay הוא ליניארי 1-50 ng / ml. שונות הבין-assay (3.6% -6.1%) ודיוק (91.7% -101.6%) כפי שהוערכו על 20 ימים עומדים בקריטריוני קבלה. התאוששות החילוץ הממוצעת היא 95.5%. אין לשאת על, הפרעות מטריצה ​​ואפקטי מטריצה ​​רלוונטיות. Tacrolimus הוא יציב בכתמי דם יבשים ב RT ובמעלות צלזיוס +4 לשבוע 1. דגימות שחולצו בautosampler יציבה במעלות צלזיוס +4 לפחות 72 שעות.

    Introduction

    Tacrolimus הוא immonosuppressant חזק 1-7 שיש לו מבנה macrolide 8 (איור 1). בשל חבר העמים - איזומרים טרנס של אגרות חוב CN הוא יוצר שתי rotamers בפתרון 9 שיכולים להיות מופרד על ידי כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים שלב הפוך (HPLC) Tacrolimus הוא lipophilic ומסיס באלכוהול (מתנול: 653 גר '/ ל', אתנול: 355 g / L), פחמימנים הלוגנים (כלורופורם: 573 גר '/ ל') ואתר. זה במשורה מסיס בפחמימנים אליפטי (הקסאן: 0.1 גר '/ L ומים (pH 3:. .0047 G / L) 9 המולקולה אינה מכילה chromophore ומקסימום UV-הקליטה שלו הוא 192 ננומטר מעשי Tacrolimus באמצעות עיכוב של calcineurin. . מנגנון פעולתה נבדק באזכור 10,11. הוא משמש כיום בלמעלה מ -80% ממושתלי איברים מוצקים בארצות הברית 12.

    המדד הטיפולי של tacrolimus הוא considereד להיות צר 13. בנוסף, הקשר בין מינוני tacrolimus וריכוזי דם הוא עני והפרמקוקינטיקה משתנה 14,15. ניטור תרופה טיפולי להנחות מינון tacrolimus במושתלים הוא פרקטיקה קלינית ולכן כללית 16-20. המטרה היא לשמור על ריכוזי דם tacrolimus בטווח טיפולי מוגדר מראש. ריכוזי דם tacrolimus מתחת לטווח הטיפולי עלולים לגרום לפעילות מוגברת של תגובות allo-חיסוני כרוניות או אקוטיות, בעוד ריכוזים מעל החלון הטיפולי להגביר את הסיכון לסרטן ורעילות, כגון Nephrotoxicity, רעילויות, יתר לחץ דם, סוכרת ועל-דיכוי חיסוני. שונות התוך-אישיות pharmacokinetic גבוהות של tacrolimus עלולות לפגוע בשני איברים להשתלה והישרדות חולה 21,22. בעוד שונות הבין-אישיות של הפרמקוקינטיקה tacrolimus נגרמות בעיקר על ידי פולימורפיזם CYP3A5, סיבות לתוך אישיהשתנות כוללות, אך אינם מוגבלות ליחסי גומלין, תרופתיות, מחלות-סמים ומזון תרופתיים 14,15. גם חוסר הדבקות במשטר התרופה לדיכוי מערכת החיסון הטיפולי הוא גורם תורם וסיבה עיקרית לאובדן 23,24 שתל.

    שיקולים אלה מצביעים על כך שתרופה טיפולית הבית תכוף וניטור דבקות של ריכוזי דם כל tacrolimus עשויה להיות מועילות כדי להבטיח שיש לי חולים חשיפת tacrolimus בתוך החלון הטיפולי הרצוי בכל העת. עם זאת, הלוגיסטיקה ועלות ניטור תרופה טיפולית תכוף יותר כפי שהוא פרקטיקה קלינית נוכחית 15 היא מונע. אחת הסיבות הוא שהחולה צריך לראות phlebotomist יש דגימת דם ורידים הנדרשת נמשכת. כתמי דם יבשים צמחו לאחרונה כקונספט אטרקטיבי 25-28. אחרי אצבע פשוטה מקל החולה אוסף טיפת דם על כרטיס נייר סינון מיוחד ולאחר נקודת דם דRied, זה יכול להיות בדואר למעבדה מרכזית לניתוח של tacrolimus וכל החיסון אחר שהמטופל יכול כרגע לקחת. זה הפך להיות אפשרי בשל הפיתוח של מבחני LC-MS / MS רגישים והספציפיים ביותר עבור כימות של tacrolimus ומערכת חיסון אחר בכמויות דם קטנות מאוד כגון כתמי דם יבשים (בדרך כלל 20 μl דם) 25,29-43. יתרון נוסף הוא שנפח דגימת אסטרטגיות פולשנית, נמוכות אוסף כגון כתמי דם יבשים להקל ניטור טיפולי סמים ומחקרי פרמקוקינטיקה בילדים קטנים מאוד 28.

    Tacrolimus נמדד בדרך כלל בכל דם ורידי EDTA 15. סיבות לכך הן שtacrolimus מפיץ בהרחבה לתאי דם וכי מחקרים קליניים דיווחו מתאם טוב יותר בין ריכוזי שוקת tacrolimus בדם מאשר בפלזמה עם אירועים קליניים 15,18. לשם השוואה, הניתוח של ת"אcrolimus בכתמי דם יבש מבוסס על דם נימים כי הוא מעורבב עם מטריצת נייר סינון. זה מציב אתגרים במונחים של solubilization של tacrolimus והפרעות פוטנציאליות עם ניתוח LC-MS / MS. כאן אנו מציגים assay הוקם ומאומתים על בסיס הומוגניזציה של נקודת הדם היבש באמצעות בלנדר כדור בשילוב עם מדגם גבוהה זרימת טור מקוון הליך לנקות וניתוח LC-MS / MS. נכון להיום, assay זה בהצלחה משמש לכימות של יותר מחמישה אלף דגימות דם נקודת tacrolimus מיובשות לניטור דבקות בניסויים קליניים.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Protocol

    דגימות דם שזוהו-דה מאנשים בריאים היו מאוניברסיטת קולורדו בבית החולים (אורורה, קולורדו). השימוש בדגימות בנק דם-מזוהה דה ללימודי אימות, כמו גם להכנת כיול דגימות בקרת האיכות נחשבה "פטור" על ידי המועצה לביקורת קולורדו רב-המוסדית (COMIRB, אורורה, קולורדו).

    1. הכנת הערות ופתרונות

    1. tacrolimus רכישה והתקן הפנימי D 2, 13 C-tacrolimus מהספקים המופיעים ברשימת חומרים.
      1. הכן פתרונות מניות במתנול הטהור בריכוז של 1 מ"ג / מיליליטר לtacrolimus וריכוז של 10 מיקרוגרם / מיליליטר לD 2, 13 C-tacrolimus. הפוך פתרונות מניות של חומרי עזר המבוסס על שלוש משקולות עצמאיות. פתרונות Aliquot מניות ולאחסן ב -70 ° C או מתחת.
    2. הכן את הפתרון כדי לזרז חלבוניםולחלץ tacrolimus באמצעות מתנול / 0.2 M 4 ZnSO במים (7: 3, v: v). פתרון זה מכיל גם את תקן D הפנימי 2, 13 C-tacrolimus בריכוז של 2.5 ng / ml, והוא משמש להפקת כל דגימות פרט למיצוי של דגימות ריקות (ראה 1.3.3).
      1. הכן פתרון משקעים חלבון זה טרי בכל יום חילוץ ולהגדיר את התפוגה של הפתרון בשעה 12.
    3. הכנת עקומה כיול ובקרת איכות דגימות (QC)
      1. הכן פתרונות מניות של tacrolimus ידי ביצוע דילולים מתאימים של פתרון המניות באמצעות מתנול הטהור.
      2. כדי להכין כיול דגימות בקרת איכות, ספייק 20 μl של פתרון מניות בדילול כראוי לכל דם EDTA, דגירה על 37 מעלות צלזיוס מתחת הרעד עדין באמבט מים, כדי לאפשר הפצה הומוגנית של tacrolimus למרכיבי דם הסלולריים במשך 20 דקות וaliquot לפוליפ 1.5 מיליליטרצינורות ropylene עם תחתית חרוטי וsnap-על עפעפיים. ודא שעוצמתו היחסית של ממס אורגני אינה עולה על 5%.
      3. ספוט 50 μl של כל הדם ממוסמר למרכז של כל עיגול על כרטיסי המסנן בעזרת פיפטה.
      4. ייבש את כתמי הדם על כרטיסי מסנן ב RT עבור 3 שעות.
      5. הכן סטנדרטים כיול tacrolimus בדם כל EDTA אדם בריכוזים tacrolimus של 1, 2.5, 5, 10, 25, ו -50 ng / ml. הכן מדגם ריק להפקה כמו הסטנדרטים כיול עם פתרון המשקעים חלבון המכיל הסטנדרטי D הפנימי 2, 13 C-tacrolimus ("אפס מדגם").
      6. הכן דגימות QC בדם כל EDTA אדם בריכוזים של 0, 2, 4, 20, 40 ng / ml. הכן מדגם ריק. בניגוד לדוגמאות QC שמופקות עם משקעים המכילים הסטנדרטי D הפנימי 2, 13 C-tacrolimus, לחלץ מדגם ריק זה עם פתרון משקעים חלבון שעושהלא מכיל הסטנדרטי D הפנימי 2, 13 C-tacrolimus ("מדגם ריק").
    4. איסוף דגימות קליניות
      1. לאסוף נקודות מיובשות דם כפי שמתואר ב43,44.

    2. דוגמאות ספוט דם הפקה של Tacrolimus מיובשים

    1. ראייה לבדוק את מקום הדם היבש על מנת להבטיח איכות מדגם מקובלת ונפח 45.
    2. מרכז אגרוף של כתם הדם על כרטיס המסנן עם אגרוף חור 6 מ"מ.
      הערה: איכות האגרופים עשויה להיות במעקב על ידי שקילה. אגרוף דיסק מסנן רווי שוקל מ"ג 5.02 הממוצע ± 0.09 מ"ג (טווח: 4.83- 5.14 מ"ג, n = 12).
    3. דיסקי מקום לתוך צינורות 1.5 מיליליטר פוליפרופילן עם תחתית חרוטי ומכסי snap-על.
    4. להוסיף 20-30 כדורים לכל צינור.
    5. הוסף 500 μl של פתרון המשקעים חלבון (מתנול: 0.2 M 4 ZnSO, 7: 3, v: v 2.5 ng / תקן פנימי מיליליטר) לתוך צינור אחד. לextrפעולה של דגימות ריקות, להשתמש בפתרון משקעים חלבון ללא התקן הפנימי.
    6. Homogenize הדיסקים בבלנדר כדור דקות 1 (מהירות המרבית, הגדרה "10").
    7. Shake דגימות ב RT על מערבולת רב-צינור (מהירות המרבית, הגדרה "10") במשך 10 דקות.
    8. צנטריפוגה דגימות 16,000 XG ו- C ° 4 במשך 10 דקות.
    9. העבר את supernatants לתוך צלוחיות זכוכית HPLC מצוידות בהוספת 300 μl. השתמש באטמי טפלון מראש חריץ.
      הערה: דגימות שחולצו ניתן לאחסן ב -20 ° C או מתחת עד ניתוח LC-MS / MS.

    3. LC-MS / MS ניתוח

    1. עומס של supernatant של המדגם שחולץ 100 μl על טור חילוץ מחסנית C8 ולשטוף עם 7: 3 יחס של 0.1% חומצה פורמית במים: אצטוניטריל בזרימה של 5 מיליליטר / דקה 1 דקות. הקשרים של שסתום המיתוג מוצגים באיור 2 והשיפוע המנוהל על ידי משאבת החילוץ בטבלה 1
    2. מכאן והלאה, להפעיל את שסתום המיתוג וכתוצאה מכך גב הסומק של analytes ממראש הטור על טור אנליטי.
    3. הגדר את התרמוסטט הטור עד 65 מעלות צלזיוס.
    4. Elute analytes מהעמודה אנליטיים תוך שימוש בשיעורי הזרימה והשיפוע שמוצגים בטבלה 1.
    5. חבר את הטור אנליטיים לספקטרומטר מסת טנדם באמצעות מקור יינון electrospray הטורבו. להתאים את הפרמטרים העיקריים של ספקטרומטר המסה לפי טבלה 2.
    6. זיהוי יונים חיוביים (+ [M + Na]) במצב מרובה התגובה (MRM). השתמש במעברי היון הבאים לכימות: tacrolimus: מ '/ z (מסה ​​/ מטען) = 826.6 616.2 → ו- D 2, 13 C-tacrolimus: מ' / z = 829.6 → 619.2.
      הערה: סך הכל זמן הריצה הוא 4.6 דקות.

    4. כימות

    1. לכל ריצה, ליצור עקומת כיול המבוסס על כיילי מוכן ב1.3.5 וכולל בכל ריצת אנליטיות.
      1. ליצור עקומת כיול על ידי התוויית ריכוזים נומינליים לעומת גורם תגובה של אנליטי (אזור השיא [אנליטי] / אזור השיא [תקן פנימי]) באמצעות תוכנת ספקטרומטר המסה.
      2. התאם את כיילי באמצעות ריבועית בכושר בשילוב עם שקלול 1 / X.
    2. לtacrolimus כמות בכתמי הדם היבש לשלב tacrolimus ופסגות סטנדרטיים פנימיות בchromatograms MRM חילוץ. חשב את הגורם לתגובת tacrolimus (אזור שיא [אנליטי] / שיא פינת [תקן פנימי]) ולהשוות עם עקומת הכיול באמצעות תוכנת ספקטרומטר המסה.

    5. נהלי אימות

    1. גבול תחתון של זיהוי (LLOD) וגבול תחתון של כימות (LLOQ).
      1. קחו למשל את ריכוז tacrolimus הנמוך ביותר עם יחס שיא לרעש של 4: 1 לגבול התחתון של זיהוי (LLOD). הגדר את הגבול התחתון של כימות (LLOQ) כהריכוז הנמוך ביותר של עקומת הכיול עם דיוק שווה או טוב יותר מ± סטיית 20% מהריכוז והדיוק שווה או טוב יותר מ- 20% (מקדם של שונות) הנומינליים.
    2. התוך ודיוקים בין-יום ודקדקנות.
      1. לבדוק את הדיוק ודיוק בארבע רמות ריכוז של 2 מיליליטר ng / (QC1), 4 ng / ml (QC2), 20 ng / ml (QC3) ו -40 מיליליטר ng / (QC4).
      2. הכן את דגימות QC בכל יום בכל אימות דם EDTA האנושי, יבש על כרטיסי מסנן, לחלץ, ולנתח כפי שתואר לעיל.
      3. לקבוע דיוק תוך היום ודיוק עם 6 דגימות לרמת ריכוז QC.
      4. להעריך את דיוק בין-יום ודיוק מעל 20 ימים. למדוד כל רמת QC עם 4 דגימות כל יום.
      5. לנתח שתי עקומות כיול יחד עם דגימות QC בכל יום.
      6. חישוב דיוק תוך היום כ% מהריכוז הנומינלי (שש דגימות לרמת ריכוז, אנא ראו 5.2.2). Calcדיוק ulate כמקדם של שונות (% קורות חיים).
      7. שקול דיוק תוך היום מקובל אם הוא נופל לקבלה מגבילה 85% ל -115% מהריכוז הנומינלי. שקול דיוק תוך היום מקובל אם הוא שווה או טוב יותר מאשר קורות חיים (מקדם של שונות) של 15%.
      8. חישוב דיוק בין-יום ודיוק כממוצע עבור כל רמת ריכוז QC ניתחה יותר מ -20 ימי אימות.
      9. שקול דיוק בין יום ממוצע מקובל אם הוא נופל לקבלה מגבילה 85% ל -115% מהריכוז הנומינלי. שקול דיוק בין-יום מקובל אם הוא שווה או טוב יותר מאשר קורות חיים (מקדם של שונות) של 15%.
    3. הרחקה של הפרעות מטריצה.
      1. להדרה של הפרעות שעלולות להיגרם על ידי אותות מטריצה, לנתח כתמים ריקים מיובשים דם (8 אנשים שונים, רצוי 4 זכרים ונקבות 4).
      2. ראייה לבדוק chromatograms יונים. אם פסגות בזמן השמירהחלון של tacrolimus מזוהים, לשלב ולהשוות האזורים שלהם מתחת לעקומה עם אלו של פסגות tacrolimus בדגימות ריקות ממוסמר עם tacrolimus בLLOQ. האזור של פסגות בדגימות ריקות לא אמור יעלה על 15% מאלה של tacrolimus בLLOQ.
    4. דיכוי יון / שיפור יון.
      1. השתמש בפרוטוקול עירוי הודעה טור-כמתואר 45 להעריך הפרעה אפשרית של שיפור דיכוי / יון יון שנגרם על ידי רכיבי מטריצת משחררי שיתוף.
      2. להשרות tacrolimus בריכוז של 10 מיקרוגרם / מיליליטר מומס בחומצה פורמית 0.1%: מתנול (30:70, V / V) הודעה טור-בשיעור של 10 μl / דקה.
        1. חבר משאבת מזרק באמצעות T-חתיכה בין העמודה אנליטיים ומקור electrospray של ספקטרומטר המסה.
        2. צג עוצמת אות MS / MS של מעברי MRM לtacrolimus והתקן הפנימי שלה (m / z = 826.6 → 616.2 וm / z = 829.6 → 619.2) לאחר ההזרקה של extracדגימות טד ריקות (n = 8 דגימות מאנשים שונים).
          הערה: בהיעדר שיפור דיכוי / יון יון האות רציפה הנגרמת על ידי עירוי של analytes לא אמור להיות מושפעת על ידי הזרקה של המטריצה ​​ריקה, תוך דיכוי יון גורם טבילה של שיפור האות ויון שיא.
    5. לשאת על.
      1. להעריך לשאת על פוטנציאל על ידי ניתוח דגימות שחולצו ריקות לאחר כיילי הגבוה ביותר (50 ng / ml, n = 6).
      2. ראייה לבדוק chromatograms יונים. אם פסגות בתוך החלון של tacrolimus זמן שמירה מזוהות, לשלב ולהשוות האזורים שלהם מתחת לעקומה עם אלו של פסגות tacrolimus בדגימות ריקות ממוסמר עם tacrolimus בLLOQ. האזור של פסגות בדגימות ריקות לא אמור יעלה על 15% מאלה של tacrolimus בLLOQ.
    6. החלמה חילוץ.
      1. לקבוע החלמה על ידי השוואת האותות של analytes לאחר החילוץ של QC סםPles בכל ארבע רמות הריכוז (n = 6 לריכוז) עם אלה של כתמי דם יבשים ריקים ממוסמר עם הסכומים המקביל של tacrolimus לאחר החילוץ.
      2. הכן ארבעה סטים של QCs (רמות ריכוז: 2, 4, 20, 40 ng / ml).
      3. הכן עוד 4 סטים של מקביל "דגימות בדיקת התאוששות" על ידי איתור 50 μl של כל דם EDTA הריק על כרטיסי נייר הסינון וייבוש עבור שעה 2.
      4. מכאן והלאה, לשניהם QC ו" דגימות בדיקת התאוששות "ריקות, לחתוך את כל כתם הדם על כרטיס המסנן עם מספריים ולמקם את הדיסקים וכתוצאה מכך לתוך צינור פוליפרופילן עם תחתית חרוטי ומכסה snap-על.
      5. לחלץ את כל הדגימות.
      6. העבר את supernatants (400 μl) לתוך צלוחיות הזכוכית HPLC.
      7. להוסיף פתרון מניות tacrolimus ל" דגימות התאוששות חילוץ מבחן "ריקות כדי להגיע ריכוזים של 2, 4, 20 ו -40 ng / ml (4 μl של 200, 400, 2,000, 4,000 סול ng / ml מניית tacrolimusutions 400 μl של supernatant).
      8. לאחר ניתוח LC-MS / MS, להשוות את האותות בשתי דגימות QC ו" דגימות בדיקת התאוששות "של הריכוז המקביל (% = דגימות אות התאוששות זינקו לפני דגימות חילוץ / אות זינקו לאחר חילוץ x 100).
    7. שלמות דילול.
      1. דגימות להקים שלמות דילול באמצעות ממוסמרות עם analytes ב 500, 250 ו- 100 ng / ml.
      2. לאחר חילוץ, לדלל דגימות באמצעות פתרון משקעים חלבון (01:10, n = 3 לרמת ריכוז).
      3. לחשב סטיות מהריכוזים הנומינליים. שקול תוצאות שנופלות בתוך 85% -115% ממקובל נומינלי.
    8. Stabilities.
      1. לחקור stabilities באמצעות דגימות QC בכל ארבע רמות הריכוז (n = 4 לריכוז) נותחו בנקודתי זמן שונות ובתנאי האחסון השונים.
      2. להשוות את התוצאות לאחר אחסון עם הערכים הנומינליים. שקול results שנופלים בתוך 85% -115% ממקובל נומינלי.
      3. להקים יציבות לדוגמה עבור השבוע 1 בטמפרטורת הסביבה, שבוע 1 ב 4 ° C, 1 חודש ב -20 ° C וחודש 1 ב -80 מעלות צלזיוס.
      4. יציבות להקפיא להפשיר מבחן בשלושה מחזורים (-20 ° C). מדגם בדיקת חילוץ ויציבות autosampler על ידי הצבת דגימות לתוך autosampler thermostatted המותאמת ל4 מעלות צלזיוס. הזרק דגימות לאחר 72 שעות.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    chromatograms יון נציג של מדגם ריק, מדגם זינק בגבול התחתון של כימות ומדגם חולה מוצג באיור 3.

    עקומות כיול

    הגבול התחתון של זיהוי היה 0.5 ng / ml והגבול התחתון של כימות היה 1.0 ng / ml. חמישים ng / ml נבחר ככיל הגבוה ביותר כריכוזים גבוהים יותר צפויים להגיע במרפאת בנסיבות רגילות.

    עקומות כיול היו מוכנות טריות בכל יום בכל אימות דם EDTA האנושי, מיובשות על כרטיסי מסנן והוציאו עם מתנול / 0.2 M ZnSO 4 (70:30 V / V) + תקן פנימי (ריכוז סופי של תקן פנימי: 2.5 ng / ml ). לאימות יום 1 (n = 6 לכייל וn = 6 לרמת QC) ובמשך ימים 2 - 20 (n = 2 לכיילו וn = 4 עבור כל רמת QC) נותחו עם ריכוזים 1, 2.5, 5, 10, 25, 50 / מיליליטר ng לcalibrators. עקומת כיול טיפוסית מוצגת באיור 4. ממוצעת דיוקים של 85% ל -115% מנומינליים, בטווח העבודה ל2/3 מכייל (עם מינימום של 6 כיילי שאינו אפס) נחשבו מקובל. המקדם הממוצע של מתאם היה (r) = 0.999 (n = 40 עקומות כיול).

    דיוקים ודקדקנות

    התוצאות מוצגות בפירוט בטבלה 3.

    שחזור חילוץ

    החלמה החילוץ הממוצעת היו 98.2% (2 ng / ml), 92.2 (מיליליטר / 4 ng), 95.5 (20 ng / ml), 96.2 (40 ng / ml).

    מטריקס הפרעות, דיכוי יון / עירוי יון שיפור בדיקת שימוש בפוסט-טור רציף ושאו-על

    ניתוח של הדגימות ריקות משמונה אנשים שונים (n = 4 נשים וn = 4 גברים) אותות הראו פחות מ -15% מLLOQ (1 ננוגרם / מיליליטר) בזמן השמירה המתאים לשיא tacrolimus מצביע על כך ששיא tacrolimus המזוהה יכול להיחשב ספציפי. דוגמא מייצגת מוצגת באיור 3. הפרעות פוטנציאליות על ידי דיכוי / שיפור יון יון נבדקו באמצעות דגימות דם יבשות ריקות משמונה אנשים בריאים שונים. ניסוי נציג מוצג באיור 5. אין סימנים של שיפור דיכוי / יון יון משמעותי נצפו. לא לשאת על רלוונטי וכתוצאה מכך פסגות עולה על 15% של האות בLLOQ אותרו.

    Integrity דילול

    שלמות דילול נחקרה על ידי ניתוח הדגימות מוכנות בריכוזים מעל כיל הגבוה ביותר (100, 250 ו- 500 ng / ml) ודילול 1:10 ב פתרון משקעים חלבון לאחר החילוץ להגיע ריכוזי היעד של: 10, 25, ו -50 ng / מיליליטר. דיוקים ממוצעים היו ליפול בקריטריונים לקבלה של 85% ל -115% מהריכוזים הנומינליים. כל TES דילוליםטד פגש קריטריונים לקבלה (לוח 4).

    Stabilities

    יציבות של tacrolimus בכתמי דם יבש נחקרה על ידי ניתוח דגימות QC בכל ארבע הרמות (n = 4 רמת ריכוז /), אשר אוחסנו בתנאים משתנים.

    דיוקים ממוצעים היו ליפול בקריטריונים לקבלה של 85% ל -115% מהריכוזים הנומינליים. תוצאות מוצגות בפירוט בטבלה 5. אין הפסדים לאחר השבוע של אחסון ב RT 1, לאחר השבוע של אחסון 1 על 4 מעלות צלזיוס, לאחר 1 חודש של אחסון ב -20 ° C., לאחר 1 חודש של אחסון ב -80 ° C., לאחר מחזורי 3 הקפאה והפשרה, ו לאחר 72 שעות של דגימות שחולצו בסמפלר האוטומטי על 4 מעלות צלזיוס היו נראות לעין.

    משאבת הפקה אנליטית משאבה (Elution)
    מים + חומצה פורמית 0.1% אצטוניטריל קצב זרימה [μl / דקה] זמן [דקות] מים + חומצה פורמית 0.1% אצטוניטריל קצב זרימה [μl / דקה]
    0 70 30 5000 0 13 87 1,000
    1 70 30 5000 2 2 98 1,200
    1.1 2 98 100 3.5 2 98 1,200
    3 2 98 100 3.6 13 87 1,000
    3.1 20 80 2,000 4.6 13 87 1,000
    4 70 30 5000
    4.6 70 30 5000

    טבלת 1. תכנית צבע להפקת ואנליטי HPLC משאבות.

    פרמטר הגדרה
    גז התנגשות (CAD) 10
    גז וילון (נוכ) (PSI) 30
    יון מקור גז 1 (GS1) (PSI) 50
    גז יון מקור 2 (GS2) (PSI) 30
    הנוכחי nebulizer (NC) (V) 1
    טמפרטורה (TEM) (° C) 600
    IonSpray מתח (IS) (V) 5500
    דוד ממשק (ז'נבייב) ב
    פוטנציאל Declustering (DP) (V) 136
    פוטנציאל כניסה (EP) (V) 10
    אנרגיית התנגשות (CE) (V) 47
    פוטנציאל התנגשות יציאת תא (CXP) (V) 16

    טבלת 2. טורבו electrospray ממשק והפרמטרים ספקטרומטר מסה. המינוח מתאים לזה המשמש בתוכנת ספקטרומטריית המסה (לפרטים יצרן, אנא ראה חומרי רשימה).

    <td> 106
    יום האימות QC רמה [% מריכוז נומינלי]
    2 4 20 40
    יום 1 93.0 86.3 88.9 93.4
    101 90.4 95.3 100
    85.6 95.9 99.0 97.5
    88.6 93.6 105 103
    85.0 97.4 97.2 109
    89.1 96.7 100 101
    דיוק תוך יום [%] 90.4 93.4 97.6 100.7
    תוך ימים התגלו חוסר דיוק [% קורות חיים] 6.6 4.6 5.5 5.2
    יום 2 92.8 86.0 103
    91.1 88.8 94.7 87.0
    88.6 90.9 92.8 94.2
    97.2 93.7 94.2 115
    דיוק תוך יום [%] 92.4 89.9 96.2 97.9
    תוך ימים התגלו חוסר דיוק [% קורות חיים] 3.9 3.6 4.8 12.2
    יום 3 97.6 101 98.4 112
    104 85.6 102 110
    99.2 88.4 99.4 105
    96.3 87.2 108 117
    דיוק תוך יום [%] 99.3 90.6 102.0 111.0
    תוך ימים התגלו חוסר דיוק [% קורות חיים] 3.4 7.8 4.2 4.5
    יום 4 95.2 88.6 112 94.5
    105 87.3 93.2 116
    99.8 96.2 103 103
    100 104 97.2 99.4
    דיוק תוך יום [%] 100.0 94.0 101.4 103.2
    תוך ימים התגלו חוסר דיוק [% קורות חיים] 4.0 8.2 8.1 8.9
    יום 5 106 90.4 101 106
    108 89.0 100
    102 101 96.6 128
    105 88.8 105 107
    דיוק תוך יום [%] 105.3 92.3 102.2 110.3
    תוך ימים התגלו חוסר דיוק [% קורות חיים] 2.4 6.3 4.2 11.1
    יום 6 90.9 93.7 119 106
    98.8 88.1 96.4 110
    94.6 96.3 99.1 108
    108 100 102 102
    דיוק תוך יום [%] 98.1 94.5 104.1 106.5
    7.5 5.3 9.8 3.2
    יום 7 85.1 87.5 99.5 95.4
    86.4 85.4 94.7 101
    94.5 87.3 98.9 94.6
    85.5 97.0 101 99.6
    דיוק תוך יום [%] 87.9 89.3 98.5 97.7
    תוך ימים התגלו חוסר דיוק [% קורות חיים] 5.1 5.8 2.7 3.2
    יום 8 86.1 92.5 91.9 102
    87.5 91.5 95.2 88.5
    115 85.6 92.1 102
    85.8 85.9 95.4 108
    דיוק תוך יום [%] 93.6 88.9 93.7 100.1
    תוך ימים התגלו חוסר דיוק [% קורות חיים] 15.3 4.1 2.0 8.2
    יום 9 88.9 91.4 96.9 100
    90.0 89.8 95.0 100
    69.7 85.9 95.8 109
    91.9 87.0 105 101
    דיוק תוך יום [%] 85.1 88.5 98.2 102.5
    תוך ימים התגלו חוסר דיוק [% קורות חיים] 12.2 2.9 4.7 4.3
    יום 10 90.9 91.3 96.2 100
    97.7 89.5 94.4 100
    99.9 109 98.7 96.8
    99.1 90.0 95.7 96.1
    דיוק תוך יום [%] 96.9 95.0 96.3 98.2
    תוך ימים התגלו חוסר דיוק [% קורות חיים] 4.2 9.9 1.9 2.1
    יום 11 92.7 91.9 88.2 104
    96.6 91.2 97.0 110
    109.0 92.8 97.6 102
    98.3 107 93.7 111
    דיוק תוך יום [%] 99.2 95.7 94.1 106.8
    תוך ימים התגלו חוסר דיוק [% קורות חיים] 7.0 7.9 4.6 4.1
    יום 12 87.7 85.5 105 95.3
    112 88.1 101 96.1
    102 89.1 89.7 97.5
    106 92.5 102 104
    דיוק תוך יום [%] 101.9 88.8 99.4 98.2
    תוך ימים התגלו חוסר דיוק [% קורות חיים] 10.1 3.3 6.7 4.0
    יום 13 נכשל 85.7 93.3 102
    101 105 88.0 93.9
    112 98.0 91.4 102
    104 113 104 101
    דיוק תוך יום [%] 105.7 100.4 94.2 99.7
    תוך ימים התגלו חוסר דיוק [% קורות חיים] 5.4 11.5 7.3 3.9
    יום 14 91.5 89.1 97.4 93.1
    90.4 87.1 93.9 99.8
    89.7 97.0 94.8 106
    97.4 86.8 89.9 נכשל
    דיוק תוך יום [%] 92.3 90.0 94.0 99.6
    תוך ימים התגלו חוסר דיוק [% קורות חיים] 3.8 5.3 3.3 6.5
    יום 15 92.8 92.8 92.5 95.4
    97.5 96.3 96.2 95.5
    95.5 108 97.3 99.3
    110 109 115 113
    דיוק תוך יום [%] 99.0 101.5 100.3 100.8
    תוך ימים התגלו חוסר דיוק [% קורות חיים] 7.7 8.1 10.0 8.3
    יום 16 93.7 97.8 90.7 112
    90.3 87.1 נכשל 101
    97.9 88.3 95.5 107
    91.4 85.7 89.3 96.7
    דיוק תוך יום [%] 93.3 89.7 91.8 104.2
    תוך ימים התגלו חוסר דיוק [% קורות חיים] 3.6 6.1 3.5 6.4
    יום 17 88.0 86.0 93.7 103
    89.8 90.8 94.8 93.2
    85.9 91.1 99.7 94.8
    86.7 88.1 95.6 91.7
    דיוק תוך יום [%] 87.6 89.0 96.0 95.7
    תוך ימים התגלו חוסר דיוק [% קורות חיים] 1.9 2.7 2.7 5.3
    יום 18 89.6 85.8 91.0 98.3
    89.6 86.2 88.3 93.6
    נכשל 86.7 96.8 104
    88.1 85.8 95.2 111
    דיוק תוך יום [%] 89.1 86.1 92.8 101.7
    תוך ימים התגלו חוסר דיוק [% קורות חיים] 1.0 0.5 4.2 7.4
    יום 19 98.0 </ Td> 89.7 94.2 102
    88.3 86.0 97.6 102
    91.6 88.1 95.8 97.5
    90.7 90.1 92.8 88.3
    דיוק תוך יום [%] 92.2 88.5 95.1 97.5
    תוך ימים התגלו חוסר דיוק [% קורות חיים] 4.5 2.1 2.2 6.6
    יום 20 93.0 87.0 99.4 101
    97.3 87.6 95.5 91.9
    89.0 88.4 91.2 93.5
    104 90.7 97.7 115
    דיוק תוך היום[%] 95.8 88.4 96.0 100.4
    תוך ימים התגלו חוסר דיוק [% קורות חיים] 6.7 1.8 3.7 10.5

    דיוק Inter-יום וחוסר דיוק
    דיוק Inter-יום 95.2 91.7 97.2 101.6
    אינטר-יום חוסר דיוק 6.1 4.5 3.6 4.2

    טבלה 3. תוצאות של דגימות בקרת איכות על פני 20 ימים. הנתונים מוצגים כ% מנומינליים. דוגמאות מופיעות בתור "נכשל" הן דוגמאות שאבדו לטעויות מעבדה / מכשיר. ברוב CASes, אין פסגות התגלו בכל או השיא הסטנדרטי הפנימי היה חסרה.

    דילול 01:10
    ריכוז יעד נומינלי לאחר דילול 50 ng / ml
    98.6
    94.5
    91.4
    דיוק [%] 94.8
    חוסר דיוק [% קורות חיים] 3.6
    דילול 01:10
    ריכוז יעד נומינלי לאחר דילול 10 ng / ml
    103
    99.5
    101
    דיוק [%] 101.2
    חוסר דיוק [% קורות חיים] 1.8
    דילול 01:10
    ריכוז יעד נומינלי לאחר דילול 25 ng / ml
    91.7
    98.2
    103
    דיוק [%] 97.6
    חוסר דיוק [% קורות חיים] 5.7

    4. תוצאות השולחן של דילול Integrity בדיקה. הנתונים מוצגות כ% מנומינליים.

    יציבות ב RT, יום 1
    רמת QC [ng / ml] 2 4 20 40
    91.9 85.8 86.0 102
    86.7 85.7 88.5 102
    86.0 85.9 90.1 103
    89.2 98.0 90.8 112
    % מריכוז נומינלי 88.5 88.9 88.9 104.8
    חוסר דיוק [קורות חיים%] 2.7 6.1 2.1 4.9
    יציבות ב RT, יום 3
    רמת QC [ng / ml] 2 4 20 40
    88.6 105 101 113
    94.1 100 98.5 103
    100 101 106 109
    99.5 102 102 108
    % מריכוז נומינלי 95.6 102.0 101.9 108.3
    חוסר דיוק [קורות חיים%] 5.3 2.2 3.1 4.1
    יציבות ב RT, יום 7
    רמת QC [ng / ml] 2 4 20 40
    105 103 91.7 109
    101 107 100 110
    102 108 107 105
    93.8 105 109 111
    % מריכוז נומינלי 100.5 105.8 101.9 108.8
    חוסר דיוק [קורות חיים%] 4.7 2.2 7.8 2.6
    B
    יציבות ב+4 מעלות צלזיוס, יום 1
    רמת QC [ng / ml] 2 4 20 40
    101 89.9 95.8 100
    88.9 91.0 94.1 99.0
    96.2 100 102 96.7
    89.5 87.8 95.4 88.6
    % מריכוז נומינלי 93.9 92.2 96.8 96.1
    חוסר דיוק [קורות חיים%] 5.8 5.4 3.5 5.2
    יציבות ב+4 מעלות צלזיוס, יום 3
    רמת QC [ng / ml] 2 4 20 40
    87.3 85.2 105 95.3
    נכשל 87.8 101 96
    101 88.8 89.6 97.5
    106 92.2 102 104
    % מריכוז נומינלי 98.1 88.5 99.4 98.2
    חוסר דיוק [קורות חיים%] 9.7 2.9 6.8 4.0
    יציבות ב+4 מעלות צלזיוס, יום 7
    רמת QC [ng / ml] 2 4 20 40
    94.0 98.5 96.1 110
    92.9 96.4 109 109
    91.7 96.3 97.9 115
    94.7 96.9 99.8 113
    % מריכוז נומינלי 93.3 97.0 100.7 111.8
    חוסר דיוק[%קו"ח] 1.3 1.0 5.7 2.8
    ג
    יציבות ב -20 ° C, יום 3
    רמת QC [ng / ml] 2 4 20 40
    87.3 98.7 111 111
    93.5 89.6 108 105
    89.5 91.5 107 112
    88.2 99.1 108 92.4
    % מריכוז נומינלי 89.6 94.7 108.5 105.1
    חוסר דיוק [קורות חיים%] 2.7 4.9 1.7 9.0
    יציבות ב -20 ° C, יום 7
    רמת QC [ng / ml] 2 4 20 40
    96.5 98.7 102 109
    94.8 94.6 114 106
    95.5 102 98.1 108
    107 99.5 115 105
    % מריכוז נומינלי 98.5 98.7 107.3 107
    חוסר דיוק [קורות חיים%] 5.7 3.1 8.5 1.8
    </ Td>
    יציבות ב -20 ° C, יום 30
    רמת QC [ng / ml] 2 4 20 40
    82.3 83.1 90.4 93.2
    87.9 85.8 85.3 97.9
    85.7 88.6 98.3 98.0
    92.0 95.6 110 103
    % מריכוז נומינלי 87.0 88.3 96.0 98.0
    חוסר דיוק [קורות חיים%] 4.1 5.4 10.8 4.0
    D </ Td>
    יציבות ב -80 ° C, יום 3
    רמת QC [ng / ml] 2 4 20 40
    87.5 96.5 96.7 נכשל
    נכשל 97.6 98.7 110
    88.8 96.4 106 109
    87.3 101 96.5 109
    % מריכוז נומינלי 87.9 97.9 99.5 109.3
    חוסר דיוק [קורות חיים%] 0.8 2.2 4.5 0.6
    יציבות ב -80 ° C, יום 7 רמת QC [ng / ml] 2 4 20 40
    נכשל 98.0 105 99.8
    97.1 106 104 105
    99.7 102 99.3 102
    101 99.9 109 106
    % מריכוז נומינלי 99.3 101.5 104.3 103.2
    חוסר דיוק [קורות חיים%] 2.0 3.4 4.0 2.8
    יציבות ב -80 ° C, יום 30
    רמת QC [ng / ml] 2 20 40
    88.2 85.3 89.6 96.7
    96.2 92.6 85.8 94.1
    83.9 93.7 91.0 105
    95.6 94.0 98.9 102
    % מריכוז נומינלי 91.0 91.4 91.3 99.5
    חוסר דיוק [קורות חיים%] 6.0 4.1 5.5 4.9

    E
    יציבות הפשרת הקפאה, ° C, מחזור 1 -20
    רמת QC [ng / ml] </ Td> 2 4 20 40
    92.5 86.2 90.2 94.3
    89.8 90.5 85.4 104
    94.7 88.6 93.4 104
    101 89.2 93.7 96.3
    % מריכוז נומינלי 94.5 88.6 90.7 99.7
    חוסר דיוק [קורות חיים%] 4.8 1.8 3.9 5.1
    להקפיא להפשיר יציבות, 20 ° C, 2 מחזורים
    רמת QC [ng / ml] 2 4 20 40
    99.1 97.6 נכשל 85.3
    93.1 88.1 93.4 92.0
    94.9 91.5 85.8 93.9
    נכשל 90.5 86.8 85.4
    % מריכוז נומינלי 95.7 91.9 88.7 89.2
    חוסר דיוק [קורות חיים%] 3.1 4.0 4.1 4.5
    להקפיא להפשיר יציבות, -20 ° C, 3 מחזורים
    רמת QC [ng / ml] 2 4 20 40
    95.7 נכשל 86.0 93.3
    95.5 87.4 85.0 91.3
    90.5 89.1 86.0 86.0
    96.9 85.7 90.2 נכשל
    % מריכוז נומינלי 94.7 87.4 86.8 90.2
    חוסר דיוק [קורות חיים%] 2.8 1.7 2.3 3.8
    F
    יציבות מדגם שחולץ ב+4 מעלות צלזיוס, 24 שעות
    רמת QC [ng / ml] 2 4 20 40
    122 112 91.0 104
    93.5 106 91.8 96.1
    111 94.8 98.2 93.5
    98.4 97.6 91.3 89.8
    % מריכוז נומינלי 106.2 102.6 93.1 95.9
    חוסר דיוק [קורות חיים%] 12.8 7.9 3.4 6.0
    יציבות מדגם שחולץ ב+4 מעלות צלזיוס, 48 שעות
    רמת QC [ng / ml] 2 4 20 40
    106 108 93.7 110
    105 98.1 94.6 98.9
    103 98.4 95.0 92.6
    108 93.1 89.7 85.5
    % מריכוז נומינלי 105.5 99.4 93.3 96.8
    חוסר דיוק [קורות חיים%] 2.1 6.2 2.4 10.4
    יציבות מדגם שחולץ ב+4 מעלות צלזיוס, 72 שעות
    רמת QC [ng / ml] 2 4 20 40
    96.5 112 96.4 104
    101 95.3 103 95.2
    94.2 105 93.5 99.5
    100 96.9 92.6 89.3
    % מריכוז נומינלי 97.9 102.3 96.4 97.0
    חוסר דיוק [קורות חיים%] 3.1 7.7 4.7 6.3

    5. תוצאות שולחן של יציבות בדיקה. : יציבות של tacrolimus בכתמי דם יבשים ב RT על 7 ימים, B: יציבות של tacrolimus בכתמי דם יבש במקרר (C ° +4) מעל 7 ימים, C: יציבות של tacrolimus בכתמי דם יבש ב -20 ° C מעל 1 חודש, D: יציבות של tacrolimus בכתמי דם יבש ב -80 ° C מעל 1 חודש, E: יציבות של tacrolimus בכתמי דם יבש על פני שלושה מחזורים להקפיא להפשיר (-20 ° C), F : חולץ מדגם יציבות / autosampler ב+4 מעלות צלזיוס במשך 72 שעות. הנתונים מוצגים כ% מריכוז נומינלי. דוגמאות מופיעות בתור "נכשל" הן דוגמאות שאבדו לטעויות מעבדה / מכשיר. ברוב המקרים אין פסגות התגלו בכל או השיא הסטנדרטי הפנימי היה חסרה.

    איור 1
    איור 1. מבנה של Tacrolimus. מספור Atom כדלקמן האיגוד הבינלאומי של מינוח טהור וכימיה יישומית (IUPAC). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    איור 2
    איור 2. חיבור של Valve ההחלפה."Target =" _ 424fig2large.jpg blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    איור 3
    איור 3. Chromatograms נציג יון. () Chromatogram יון נציג של דגימות דם ריקות הבחינו על נייר סינון (לפרטים יצרן, אנא ראה חומרי רשימה) ומיובש. החץ מסמן את זמן השמירה של שיא tacrolimus, chromatogram יון נציג של דם ריק דגימות ממוסמרות בגבול התחתון של כימות (1 ננוגרם / מיליליטר) (ב) הבחין על נייר הסינון ומיובש, וchromatogram יון (ג) נציג של מדגם שנאסף על ידי מטופל השתלה על נייר סינון. זוהי דוגמא שוקת והריכוז tacrolimus נמדד היה 2.1 ng / ml. מדגם זה נאסף על ידי המטופל בבית והוא מניסוי קליני שהיה אושר על ידי האוניברסיטה של ​​סינסינטי Institutional Review Board (סינסינטי, אוהיו). כל החולים נתנו ההסכמה בכתב שלהם המתאימה. chromatograms יון הם תדפיסים מקוריים כמו שנוצר על ידי תוכנת ספקטרומטריית מסה (לפרטים יצרן, אנא ראה חומרי רשימה). קווים כחולים ואדומים בchromatograms היון מייצגים הסטנדרטי D הפנימי 2, 13 C-tacrolimus וtacrolimus, בהתאמה. שיא משחררי מול tacrolimus העיקרי והפסגות סטנדרטיים פנימיים rotamers. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    איור 4
    איור 4. נציגי כיול עקום. תדפיס מקורי כמו שנוצר על ידי תוכנת ספקטרומטר המסה מוצג.424 52424fig4large.jpg "target =" / _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    איור 5
    איור 5. נציגי יון chromatogram נמדד במהלך עירוי פוסט-טור של Tacrolimus והזרקה של דגימת דם בלנק חילוץ להערכת מטריקס אפקט פוטנציאלי (דיכוי יון / יון שיפור). החץ מסמן את זמן השמירה של שיא tacrolimus. בדיקת השפעת מטריקס הייתה מבוססת על ההליך המתואר ב -46. אין מטריצה ​​רלוונטית השפעה זוהתה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    אמנם, כאמור, את הרעיון של תרופה טיפולית ומעקב דבקות של tacrolimus מבוסס על כתמי דם יבשים הוא אטרקטיבי, יש אתגרים אנליטיים שהולכים מעבר לאלו שבדרך כלל קשורים לניתוח LC-MS / MS של tacrolimus בדגימות דם כל EDTA ורידים. אלה כוללים, אך לא רק, את העובדה שהמטריצה ​​היא כל נימי הדם נספג חומר linters הכותנה של חומר כרטיס המסנן משמש כאן והנמוך נפח הדם (20 μl). עם זאת, ניתוח תפוקה גבוהה במעבדה מרכזית דורש שיטת חילוץ מהירה ואמינה כי תוצאות דגימות שאין הפרעות מטריצה ​​ואפקטי מטריקס בשילוב עם assay LC-MS / MS חזק, ספציפי ורגיש מאוד. אמינות של assay היא קריטית כמו שיש בדרך כלל לא מספיק חומר על כרטיס המסנן כבר חבט עזב מחדש ניתוח במקרה החילוץ / ניתוח LC-MS / MS נכשל.

    אינטרנט אלחוטיכרטיסים לניטור ארוכים טווח המשמשים במחקר הנוכחי (לפרטים יצרן, אנא ראו חומרי רשימה) נבחרו כמו אלה הם מכשיר ה- FDA המעמד השני, עומד בהדרכת NCCLS LA4-A5 44 ונמצאים באירופה-מסומן לספירה. אם מלא לחלוטין, מעגל אחד על כרטיס מסנן Whatman 903 מחזיק ≈50 μl דם 46. עם זאת, בגודל של טיפות הדם שנאספו על ידי חולי פרט להשתנות ואימונים בטכניקת הדגימה הנכונה הוא 46 חיוניים.

    הצעד החשוב הראשון של חילוץ אגרוף החוצה יבש מדגם נקודת דם הוא הומוגניזציה. בהתבסס על הניסיון שלנו, השימוש בבלנדר כדור הוא יותר יעיל וטוב יותר לשחזור מאשר שיטות אחרות המשמשות כדי לשפר את יעילות מיצוי כגון sonication השימוש בבלנדר הכדור היה חיוני כדי להשיג באופן עקבי החלמה חילוץ מעל 90%. על אמינות של הליך החילוץ, זה גם היה חשוב כדי להבטיח שכל הצנטריפוגות היו טמפרטורותיור מבוקר (4 מעלות צלזיוס) וכי צעד vortexing לא הייתה קצר יותר מ -10 דקות, שהביאו להחלמת חילוץ משתנה יותר ונמוכה יותר. בנוסף, חשוב שיחס מתנול / ZnSO 4 לא משתנה כהתאוששות tacrolimus היא מאוד רגישה להרכב הנכון של פתרון המשקעים חלבון.

    האתגר הבא הוא להשיג תמצית נקייה באופן אידיאלי נטולת חומרים שעלולים לגרום להפרעות מטריצה ​​ואפקטים. לפיכך, צעד משקעים חלבון פשוט צעד אחד לעתים קרובות משמש להפקת tacrolimus מדגימות דם EDTA לא נחשב אפשרות מעשית. לאחר משקעים חלבון באמצעות ZnSO 4 (כולל תוספת של תקן הפנימי שכותרתו איזוטופ), vortexing וצנטריפוגה, supernatants הוזרק למערכת 2D HPLC ועל עמודת חילוץ מקוונת. חילוץ טור מקוון באמצעות תזרים גבוה של 5 מיליליטר / דקה במחסניות מראש טור קונבנציונליים באמצעות 6 יציאות פשוטותשסתום מיתוג לניתוח tacrolimus תוארו לפני 47. השלב הנייד נבחר כך שtacrolimus והתקן הפנימי שלה מרוכז בחלק הקדמי של עמודת המיצוי ולא להעביר על העמודה במהלך שלב הניקוי. החילוץ המקוון משמש בפרוטוקול הנוכחי היה כמה יתרונות כוללים הזרקה של כרכי מדגם גדולים יחסית ללא משפיע לרעה על ניתוח HPLC. גב הסומק לאחר העשרת analytes על גבי עמודת החילוץ ("שיא התמקדות") הביא לפסגות חדות מאפשרות אינטגרציה אמינה יותר על ידי אלגוריתם התוכנה במיוחד עבור דוגמאות עם ריכוזים נמוכים tacrolimus. 48 שלב הניקוי המקוון לא רק להסיר פוטנציאל מפריע תרכובות מטריצה, אלא גם דה-מלוח המדגם. בעיה עדיין דנה רק לעתים נדירות אחת חשובה עבור נפח גבוה, מבחני LC-MS / MS תפוקה גבוהה היא האובדן ההדרגתי של רגישות של מערכת LC-MS / MS בשל הגדלתזיהום של המקור electrospray במהלך הניתוח של קבוצות גדולות. אין השפעה משמעותית מטריצה ​​(שיפור דיכוי / יון יון) נצפתה. ההשפעה השלילית של השפעות מטריצת פוטנציאל הופחתה / להימנע על ידי שילוב של הפעולות הבאות: משקעים חלבון יעילים באמצעות מתנול / ZnSO 4, צנטריפוגה לאחר משקעים חלבון ב16,000 XG, חילוץ מקוון גבוהה זרימה, הפרדת chromatographic ברורה של tacrolimus מהפרעות פוטנציאליות משחררי מוקדמים מהעמודה אנליטיים והשימוש בtacrolimus שכותרתו איזוטופ כסטנדרט במקום סטנדרטים פנימיים הקשורות מבני כגון ascomycin פנימי.

    הגבול התחתון של כימות היה 1 ng / ml, ובכך נמוך מזה של רוב immunoassays כי כרגע משמש לעתים קרובות לניטור סמים טיפולי של tacrolimus בדגימות דם EDTA. גבול תחתון של כימות מספיק אפילו לimmunosuppres לטווח ארוך מעכב calcineurin הנמוך שנקראפרוטוקולי תחזוקה sive.

    בהשוואה למבחני LC-MS / MS שתוארו קודם לכן לכמת tacrolimus בדם מיובש כתמים 29-34,36,39,41,42, משחקי assay הווה או עולה על הביצועים שלהם במונחים של גבול התחתון של כימות, התאוששות חילוץ, דיוק ודיוק, תוך הימנעות מושגים שעלולים להיות מסוכנים כגון נהלי צעד אחד משקעים חלבון ופעמים כרומטוגרפיה אולטרה קצרים, אשר בדרך כלל נותנים תוצאות מתקבלות על הדעת באימות המבוססת על דגימות דם מאנשים בריאים. עם זאת, חולים שעברה השתלה הם קבוצה מורכבת מאוד של חולים שיש להם מחלות שמשפיעות על הרכב הדם ושלוקחים תרופות מרובות. זה עושה את זה כמעט בלתי אפשרי שלא לכלול את כל ההפרעות הפוטנציאליות שעשויה להיות נוכחים בחולים בודדים במהלך האימות והאסטרטגיה המעשית היחידה היא להקים assay באופן שבו ממזער את הסיכון של הפרעות פוטנציאליות כזה. SPO דם יבשיש לי TS אתגרים כגון ההשפעה של המטוקריט בצמיגות דם ובכך את מאפייני דיפוזיה של הדם מיושם על נייר מסנן 49. זה לא נבדק כאן שוב כתופעות כאלה כבר תוארו לא להשפיע ניתוח tacrolimus בכתמי דם יבש בhematocrits וריכוזי tacrolimus בתוך קליני גבולות סבירים 29,32. גם יציבות של tacrolimus בכתמי דם יבשים בטמפרטורות גבוהות כבר נחקרה על ידי אחרים וtacrolimus בכתמי דם יבשים נמצא להיות יציב במשך 5 ימים על 37 מעלות צלזיוס ואף 60 מעלות צלזיוס 32, וזה חשוב עבור משלוח של דם יבש כתמים בתנאים לא-מבוקר טמפרטורה במיוחד בקיץ.

    assay זה מבוסס על שילוב של הומוגניזציה בלנדר כדור, ניקוי טור מקוון בספיקה גבוהה וניתוח LC-MS / MS עשוי לספק אסטרטגית פלטפורמה לפיתוח מבחני Bioanalytical לכימות של IMM האחרunosuppressants, לבד או בו זמנית, כמו גם תרופות אחרות בדגימות נקודת דם יבשות.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Tacrolimus U.S. Pharmacopeial Convention 1642802
    D2,13C-Tacrolimus Toronto Research Chemicals Inc. F370002
    Red blood cells University of Colorado Hospital W20091305500 V
    Plasma University of Colorado Hospital W2017130556300Q
    Acetone CHROMASOLV, HPLC, ≥99,9% Sigma-Aldrich 439126-4 L
    Acetonitrile Optima LC/MS, UHPLC-UV Thermo Fisher Scientific A955-4
    Isopropanol 99.9%, HPLC Fisher Scientific BP2632-4
    Methanol Optima LC/MS Thermo Fisher Scientific A452-4
    Water Optima LC/MS, UHPLC-UV Thermo Fisher Scientific W6-4
    Formic acid Thermo Fisher Scientific A118P-500
    Phosphate-buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich D8537
    Zinc sulfate Thermo Fisher Scientific Z68-500
    0.5 – 10 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS Mettler Toledo 17008649
    1.5 ml Eppendorf tube Thermo Fisher Scientific 02-682-550
    10 – 100 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS Mettler Toledo 17008651
    10 μl pipet tips with filter, sterile Neptune BT 10XLS3
    100 – 1,000 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS Mettler Toledo 17008653
    100 μl pipet tips with filter, sterile Neptune BT 100
    1,000 μl pipet tips with filter, sterile Multimax 2940
    2 – 20 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS Mettler Toledo 17008650
    2 ml Eppendorf tube Thermo Fisher Scientific 02-681-258
    20 – 200 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS Mettler Toledo 17008652
    20 μl pipet tips with filter, sterile GeneMate P-1237-20
    200 μl pipet tips with filter Multimax 2938T
    200 μl pipet tips with filter, sterile Multimax 2936J
    50 ml Falcon tube BD Falcon 352070
    300 μl inserts for HPLC vials Phenomenex ARO-9973-13
    Balance PR2002 Mettler Toledo 1117050723
    Balances AX205 Delta Range Mettler Toledo 1119343379
    Bullet Blender Homogenizer Next Advance BBX24
    Centrifuge Biofuge Fresco Heraeus 290395
    Disposable Wipes PDI Q55172
    Glass v ials, 4 ml Thermo Fisher Scientific 14-955-334
    Glass vials, 20 ml Thermo Fisher Scientific B7800-20
    Gloves, nitrile Titan Brand Gloves 44-100S
    HPLC vials, 9 mm, 2 ml, clear Phenomenex ARO- 9921-13
    Lids for HPLC vials Phenomenex ARO- 8952-13-B
    Needle, 18 G 1.5 Precision Glide 305196
    Rack for Eppendorf tubes Thermo Fisher Scientific 03-448-11
    Rack for HPLC Vials Thermo Fisher Scientific 05-541-29
    Steel beads 0.9 – 2 mm Next Advance SSB14B
    Storage boxes for freezers / refrigerators Thermo Fisher Scientific 03-395-464
    Standard multi-tube vortexer VWR Scientific Products 658816-115
    Whatman Paper, 903 Protein Saver US 100/PK GE Whatman  2016-05
    Autosampler CTC PAL  PAL.HTCABIx1
    Binary pump, Agilent 1260 Infinity Agilent Technologies 1260 G1312B
    Binary pump, Agilent 1290 Infinity Agilent Technologies 1290 G4220A
    Micro vacuum degasser, Agilent 1260 Agilent Technologies 1260 G13798
    Column oven,  Agilent 1290 with 2 position  Agilent Technologies 1290 G1216C
    Thermostated column compartment with integrated 6 port switching valve Agilent Technologies 1290 G1316C
    HPLC pre-column cartridge, Zorbax XDB C8 (5 µm particle size), 4.6 · 12.5 mm Phenomenex 820950-926
    HPLC analytical column, Zorbax Eclipse-XDB-C8 (5 µm particle size), 4.6 · 150 mm Phenomenex 993967-906
    Tandem Mass Spectrometer
    API5000 MS/MS with TurboIonspray source AB Sciex 4364257
    Mass spectrometry software AB Sciex Analyst 1.5.1

    References

    1. Goto, T., et al. Discovery of FK506, a novel immunosuppressant isolated from Streptomyces Tsukubaensis. Transplant Proc. 19, (5 Suppl 6), 4-8 (1987).
    2. Kino, T., Hatanaka, H., Miyata, S. FK506, a novel immunosuppressant isolated from a streptomyces. I: Fermentation, isolation and physico-chemical and biological characteristics. J. Antibiotics. 40, (9), 1249-1255 (1987).
    3. Starzl, T. E., et al. FK506 for liver, kidney and pancreas transplantation. Lancet. 2, (8670), 1000-1004 (1989).
    4. Randomised trial comparing tacrolimus (FK506) and cyclosporin in prevention of liver allograft rejection. European FK506 Multicentre Liver Study Group. Lancet. 344, (8920), 423-428 (1994).
    5. A comparison of tacrolimus (FK 506) and cyclosporine for immunosuppression in liver transplantation. The U.S. Multicenter FK506 Liver Study Group. N. Engl. J. Med. 331, (17), 1110-1115 (1994).
    6. Mayer, A. D., et al. Multicenter randomized trial comparing tacrolimus (FK506) and cyclosporine in the prevention of renal allograft rejection: a report of the European Tacrolimus Multicenter Renal Study Group. Transplantation. 64, (3), 436-443 (1997).
    7. Pirsch, J. D., Miller, J., Deierhoi, M. H., Vincenti, F., Filo, R. S. A comparison of tacrolimus (FK506) and cyclosporine for immunosuppression after cadaveric renal transplantation. FK506 Kidney Transplant Study Group. Transplantation. 15, (7), 977-983 (1997).
    8. Tanaka, H., et al. Physicochemical properties of FK506 a novel immunosuppressant isolated from Streptomyces Tsukubaensis. Transplant Proc. 14, ((5 Suppl 6)), 11-16 (1987).
    9. Spencer, C. M., Goa, K. L., Gills, J. C. Tacrolimus. An update of its pharmacology and clinical efficacy in the management of organ transplantation. Drugs. 54, (6), 925-975 (1997).
    10. Clipstone, N. A., Crabtree, G. R. Identification of calcineurin as a key signalling enzyme in T-lymphocyte activation. Nature. 357, (6380), 695-697 (1992).
    11. Barbarino, J. M., Staatz, C. E., Venkataramanan, R., Klein, T. E., Altman, R. B. PharmGKB summary: cyclosporine and tacrolimus pathways. Pharmacogenet. Genomics. 23, (10), 563-585 (2013).
    12. Annual Data Report. Department of Health and Human Services, Health Resources and Services Administration, Healthcare Systems Bureau, Division of Transplantation. Available from: http://optn.transplant.hrsa.gov/data/annualreport.asp (2014).
    13. Draft Guidance on Tacrolimus. Food and Drug Administration, Office of Generic Drugs. Available from: http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/UCM181006.pdf (2012).
    14. Christians, U., Benet, L. Z., Lampen, A. Mechanisms of clinically significant drug interactions associated with tacrolimus. Clin. Pharmacokinet. 41, (11), 813-851 (2002).
    15. Christians, U., Pokaiyavananichkul, T., Chan, L. Tacrolimus In: Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. Principles of Therapeutic Drug Monitoring. Burton, M. E., Shaw, L. M., Schentag, J. J., Evans, W. ebb 4th Edition, Lipincott, Wiliams, and Wilkins. =Baltimore. 529-562 (2005).
    16. Holt, D. W., et al. International Federation of Clinical Chemistry/ International Association of Therapeutic Drug Monitoring and Clinical Toxicology working group on immunosuppressive drug monitoring. Ther. Drug Monit. 24, (1), 59-67 (2002).
    17. Holt, D. W., Jones, K., Lee, T., Stadler, P., Johnston, A. Quality assessment issues of new immunosuppressive drugs and experimental experience. Ther. Drug Monit. 18, (4), 362-367 (1996).
    18. Jusko, W. J., et al. Consensus document: therapeutic drug monitoring of tacrolimus (FK-506). Ther. Drug Monit. 17, (6), 606-614 (1995).
    19. Oellerich, M., et al. Therapeutic drug monitoring of cyclosporine and tacrolimus. Update on Lake Louise Conference on cyclosporine and tacrolimus. Clin. Biochem. 31, (5), 309-316 (1998).
    20. Wong, S. H. Therapeutic drug monitoring for immunosuppressants. Clin. Chim. Acta. 313, (1-2), 241-253 (2001).
    21. Kahan, B. D., et al. Low intraindividual variability of cyclosporin A exposure reduces chronic rejection incidence and health care costs. J. Am. Soc. Nephrol. 11, (6), 1122-1131 (2000).
    22. Kahan, B. D., et al. Variable oral absorption of cyclosporine. A biopharmaceutical risk factor for chronic renal allograft rejection. Transplantation. 62, (5), 599-606 (1996).
    23. Kelly, D. A. Current issues in pediatric transplantation. Pediatr. Transplant. 10, (6), 712-720 (2006).
    24. Spivey, C. A., Chisholm-Burns, M. A., Damadzadeh, B., Billheimer, D. Determining the effect of immunosuppressant adherence on graft failure risk among renal transplant recipients. Clin. Transplant. 28, (1), 96-104 (2014).
    25. Taylor, P. J., Tai, C. H., Franklin, M. E., Pillans, P. I. The current role of liquid chromatography-tandem mass spectrometry in therapeutic drug monitoring of immunosuppressant and antiretroviral drugs. Clin. Biochem. 44, (1), 14-20 (2011).
    26. Edelbroek, P. M., van der Heijden, J., Stolk, L. M. Dried blood spot methods in therapeutic drug monitoring: methods, assays, and pitfalls. Ther. Drug Monit. 31, (3), 327-336 (2009).
    27. Meesters, R. J., Hooff, G. P. State-of-the-art dried blood spot analysis: an overview of recent advances and future trends. Bioanalysis. 5, (17), 2187-2208 (2013).
    28. Pandya, H. C., Spooner, N., Mulla, H. Dried blood spots, pharmacokinetic studies and better medicines for children. Bioanalysis. 3, (7), 779-786 (2011).
    29. Koster, R. A., Alffenaar, J. W., Greijdanus, B., Uges, D. R. Fast LC-MS/MS analysis of tacrolimus, sirolimus, everolimus and cyclosporin A in dried blood spots and the influence of the hematocrit and immunosuppressant concentration on recovery. Talanta. 115, (Oct 15), 47-54 (2013).
    30. Hinchliffe, E., Adaway, J., Fildes, J., Rowan, A., Keevil, B. G. Therapeutic drug monitoring of ciclosporin A and tacrolimus in heart lung transplant patients using dried blood spots. Ann Clin. Biochem. 51, (Pt 1), 106-109 (2014).
    31. Koop, D. R., Bleyle, L. A., Munar, M., Cherala, G., Al-Uzri, A. Analysis of tacrolimus and creatinine from a single dried blood spot using liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.. 926, ((May 1)), 54-61 (2013).
    32. Sadilkova, K., Busby, B., Dickerson, J. A., Rutledge, J. C., Jack, R. M. Clinical validation and implementation of a multiplexed immunosuppressant assay in dried blood spots by LC-MS/MS. Clin. Chim. Acta.. 421, ((Jun 5)), 152-156 (2013).
    33. Li, Q., Cao, D., Huang, Y., Xu, H., Yu, C., Li, Z. Development and validation of a sensitive LC-MS/MS method for determination of tacrolimus on dried blood spots. Biomed. Chromatogr. 27, (3), 327-334 (2013).
    34. Hinchliffe, E., Adaway, J. E., Keevil, B. G. Simultaneous measurement of cyclosporin A and tacrolimus from dried blood spots by ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.. 883-884, ((Feb 1)), 102-107 (2012).
    35. Webb, N. J., Roberts, D., Preziosi, R., Keevil, B. G. Fingerprick blood samples can be used to accurately measure tacrolimus levels by tandem mass spectrometry). Pediatr. Transplant. 9, (6), 729-733 (2005).
    36. Keevil, B. G., Fildes, J., Baynes, A., Yonan, N. Liquid chromatography-mass spectrometry measurement of tacrolimus in finger-prick samples compared with venous whole blood samples. Ann. Clin. Biochem. 46, (Pt 2), 144-145 (2009).
    37. Yonan, N., Martyszczuk, R., Machaal, A., Baynes, A., Keevil, B. G. Monitoring of cyclosporine levels in transplant recipients using self-administered fingerprick sampling. Clin. Transpl. 20, (2), 221-225 (2006).
    38. Keevil, B. G., et al. Simultaneous and rapid analysis of cyclosporin A and creatinine in finger prick blood samples using liquid chromatography tandem mass spectrometry and its application in C2 monitoring. Ther Drug Monit. 24, (6), 757-767 (2002).
    39. Hoogtanders, K., et al. Dried blood spot measurement of tacrolimus is promising for patient monitoring. Transplantation. 83, (2), 237-238 (2007).
    40. Heijden, J., et al. Therapeutic drug monitoring of everolimus using the dried blood spot method in combination with liquid chromatography-mass spectrometry. J. Pharm. Biomed. Anal. 50, (4), 664-670 (2009).
    41. Cheung, C. Y., et al. Dried blood spot measurement: application in tacrolimus monitoring using limited sampling strategy and abbreviated AUC estimation. Transpl. Int. 21, (2), 140-145 (2008).
    42. Hoogtanders, K., et al. Therapeutic drug monitoring of tacrolimus with the dried blood spot method. J. Pharm. Biomed. Anal. 44, (3), 658-664 (2007).
    43. Wilhelm, A. J., den Burger, C. J., Vos, R. M., Chahbouni, A., Sinjewel, A. Analysis of cyclosporin A in dried blood spots using liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 877, (14-15), 1595-1598 (2009).
    44. Ostler, M. W., Porter, J. H., Buxton, M. O. Dried blood spot collection of health biomarkers to maximize participation in population studies. J. Vis. Exp. (83), e50973 (2014).
    45. Hannon, H. W., et al. Blood collection on filter paper for neonatal screening programs, approved standard LA4-A5. Clinical Laboratory and Standards Institute. Available from: http://www.clsi.org (2007).
    46. Schäfer, P., Störtzel, M., Vogt, S., Weinmann, W. Ion suppression effects in liquid chromatography-electrospray-ionisation transport-region collision induced dissociation mass spectrometry with different serum extraction methods for systematic toxicological analysis with mass spectra libraries. J. Chromatogr. B. 773, (1), 47-52 (2002).
    47. Peck, H. R., Timko, D. M., Landmark, J. D., Stickle, D. F. A survey of apparent blood volumes and sample geometries among filter paper bloodspot samples submitted for lead screening. Clin. Chim. Acta. 400, (1-2), 103-106 (2009).
    48. Christians, U., et al. Automated, fast and sensitive quantification of drugs in blood by liquid chromatography-mass spectrometry with on-line extraction: immunosuppressants. J. Chromatogr. B. 748, (1), 41-53 (2000).
    49. Clavijo, C., et al. Development and validation of a semi-automated assay for the highly sensitive quantification of Biolimus A9 in human whole blood using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 877, (29), 3506-3514 (2009).
    50. Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens. J. Nutr. 131, (5), S1631-S1636 (2001).

    Comments

    0 Comments

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter