Automatic Translation

This translation into Arabic was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Chemistry

والاستشعار القائمة على أبتمر لUnchelated الجادولينيوم (III)

1, 1, 1, 1, 1

1Department of Chemistry and Biochemistry, California State University, East Bay

Article
    Downloads Comments Metrics Publish with JoVE

    You must be subscribed to JoVE to access this content.

    Enter your email to receive a free trial:

    Welcome!

    Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!


    Admit it, you like to watch.

     

    Summary

    Cite this Article

    Edogun, O., Chan, T. Y., Nguyen, N. H., Luu, A., Halim, M. An Aptamer-based Sensor for Unchelated Gadolinium(III). J. Vis. Exp. (119), e55216, doi:10.3791/55216 (2017).

    Introduction

    وقد أدت الأهمية المتزايدة للتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) في التشخيص السريري، والذي يحد من حساسية الكامنة في أسلوب في النمو السريع للبحث في تطوير عوامل رواية القائم على الجادولينيوم المقابل (GBCAs) 1. GBCAs هي الجزيئات التي تدار لتحسين جودة الصورة، وأنها عادة ما يكون التركيب الكيميائي للأيون الثلاثي الجادولينيوم (ش ج 3+) منسقة ليجند polydentate. هذا complexation له أهمية حاسمة كما unchelated ش ج 3+ غير سامة. وقد تورط في تطوير تليف النظامية كلوي في بعض المرضى الذين يعانون من أمراض الكلى أو الفشل 2. ونتيجة لذلك، والكشف عن أيون حر مائي غير فعال في ضمان سلامة GBCAs. وجود unchelated ش ج 3+ في حلول GBCA غالبا ما يكون نتيجة رد فعل غير مكتمل بين يجند وأيون، تفكك المجمع، أو displacemenر من قبل غيرها من الكاتيونات المعدنية البيولوجية 3.

    ومن بين العديد من التقنيات المستخدمة حاليا لتحديد وجود ش ج 3+، أولئك الذين يعتمدون على اللوني و / أو الطيف رتبة أعلى من حيث التنوع وتطبيق 4. بين مواطن القوة لديهم هي حساسية عالية ودقة، والقدرة على تحليل مختلف المصفوفات عينة (بما في ذلك المصل البشري 5 والبول والشعر 7 مياه الصرف الصحي، وتركيبات وكيل النقيض 8)، والكمي في وقت واحد من عدة ش ج 3+ المجمعات (قائمة من الدراسات قبل 2013 الموضح في مراجعة شاملة من قبل Telgmann وآخرون.) (4). لكن العائق الوحيد هو أن العديد من هذه الأساليب تتطلب أدوات القياس (مثل إضافة بالحث مطياف البلازما الشامل) 4 أن بعض المختبرات قد لا يكون الوصول إليها. في سياق اكتشاف GBCA الرواية في البحث ومستويات إثبات صحة مفهوم، عelatively أكثر ملاءمة، والسريع، وفعالة من حيث التكلفة طريقة القائم الطيفية (مثل امتصاص الأشعة فوق البنفسجية فيس أو مضان) قد يكون بمثابة بديل قيمة. مع هذه التطبيقات في الاعتبار، وقد وضعت الفلورسنت القائم على أبتمر الاستشعار عن مائي ش ج 3+ 9.

    وأبتمر (ش ج-أبتمر) هو 44 قاعدة طويلة واحد الذين تقطعت بهم السبل جزيء الحمض النووي مع تسلسل معين من القواعد التي كانت معزولة من خلال عملية التطور المنهجي للبروابط كتبها تخصيب الأسي (سيليكس) 9. لتكييف أبتمر إلى جهاز استشعار الفلورسنت، ويرد على fluorophore إلى محطة 5 'من حبلا، وهو ما يتم تهجين مع حبلا التبريد (QS) عبر 13 قواعد تكميلية (الشكل 1). والموسومة QS مع جزيء فاكهه تقضي الظلام في 'محطة 3. في غياب ش ج 3+، أجهزة الاستشعار (ش ج استشعار)، تتكون من نسبة 1: الخلد 2 ش ج-أبتمر وQS على التوالي، وسيكون الحد الأدنى من الانبعاثات مضان ر المناسبس نقل الطاقة من fluorophore إلى فاكهه تقضي. وإضافة مائي ش ج 3+ تحل محل QS من ش ج-أبتمر، مما أدى إلى زيادة في الانبعاثات مضان.

    شكل 1
    الشكل 1. استشعار (ش ج استشعار) التي تتكون من أبتمر 44 قاعدة طويلة (ش ج-أبتمر) الموسومة مع فلوريسئين (أ fluorophore) و13 قاعدة تبريد طويل حبلا (QS) الموسومة مع dabcyl (فاكهه تقضي الظلام) . في غياب unchelated ش ج 3+، مضان من أجهزة الاستشعار هو الحد الأدنى. مع اضافة كلمة المدير العام 3+، تهجير QS يحدث ولوحظ حدوث زيادة في الانبعاثات مضان. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    هناك في الوقت الحاضر، احد يشيع استخدامها أسلوب قائم على التحليل الطيفي للكشف عنجي مائي ش ج 3+. يستخدم هذا الاختبار البرتقال زايلينول جزيء، والتي تخضع لعملية التحول في أقصى الطول الموجي امتصاص 433-573 نانومتر على عملية إزالة معدن ثقيل إلى أيون 10. نسبة هذين الامتصاصية ماكسيما يمكن أن تستخدم لقياس كمية من unchelated ش ج 3+. أجهزة الاستشعار أبتمر هو بديل (قد تكون أيضا مكملة) لفحص زايلينول البرتقال، وطرق لهما ظروف التفاعل المختلفة (مثل درجة الحموضة وتكوين المحاليل المستخدمة)، الإختياريات الهدف، ويتراوح خطية من تقدير، وطرائق الكشف 9.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Protocol

    ملاحظة: يتم استخدام الجزيئي المياه البيولوجيا الصف في كافة الاستعدادات العازلة والحل. جميع أنابيب القابل للتصرف (microcentrifuge لوPCR) ونصائح الماصة هي DNase- وريبونوكلياز خالية. يرجى الاطلاع على ورقة بيانات سلامة المواد (MSDS) لجميع المواد الكيميائية قبل استخدامها. ينصح بشدة استخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة (PPE).

    1. إعداد الحلول المالية أبتمر

    1. شراء 2 خيوط polydeoxynucleotide تجاريا. طلب كل من خيوط بالتطهير عبر الأداء العالي اللوني السائل (HPLC).
      حبلا 1 (ش ج-أبتمر):
      5 '- / 56-FAM / AGGCTCTCGGGACGACCAGTTGGTCCCGCTTTATGTGTCCCGAG-3 "
      حبلا 2 (QS):
      5'-GTCCCGAGAGCCT / 3Dab / -3 "
    2. حل كل حبلا في الماء لجعل 100 ميكرومتر الحلول الأسهم الفردية للش ج-أبتمر وQS.
    3. تخزين هذه الحلول في -20 درجة مئوية. الحلول هي مستقرة حتى الآن، لمدة 3 سنوات.
    4. لتقليل فريزدورات ذوبان الجليد الإلكترونية، تخزين الحلول الأسهم في 10 مكل.

    2. إعداد 2X ش ج استشعار الحل

    1. إعداد المخزن المؤقت فحص (20 ملي HEPES، 2 مم MgCl 150 مم كلوريد الصوديوم، 5 مم بوكل). ضبط درجة الحموضة إلى ~ 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم وحمض الهيدروكلوريك، وتصفية من خلال معقمة يمكن التخلص منها زجاجة أعلى مرشحات مع 0.2 ميكرومتر غشاء PES. تخزين في زجاجات معقمة. إذا تمت تصفيتها وتخزينها بشكل صحيح (في درجة حرارة الغرفة)، المخزن المؤقت مستقرة حتى الآن، لمدة 2 سنة.
    2. تمييع 1 ميكرولتر من محلول المخزون ش ج-أبتمر (من الخطوة 1.2) و 2 ميكرولتر من محلول المخزون QS (من الخطوة 1.2) في 497 ميكرولتر من العازلة الفحص. تخلط جيدا باستخدام الدوامة. تركيزاتها في 2X حل ش ج استشعار هي 200 نانومتر و 400 نانومتر، على التوالي.
      ملاحظة: حجم 2X حل ش ج استشعار أعد في هذه الخطوة هو 500 ميكرولتر، وهو ما يكفي لاختبار 6-7 تركيزات مختلفة من ش ج 3+ لمنحنى المعايرة والحلول عامل تباين(الخطوة 3). وسيكون لكل عينة تعطي الآبار مكررة في 384 لوحة جيدا.
      1. ضبط حجم 2X حل ش ج استشعار وفقا لعدد من الحلول ش ج 3+ التي تحتاج إلى فحصها.
    3. نقل 2X حل ش ج استشعار في 9 أنابيب PCR، مع 50 ميكرولتر إلى كل أنبوب. وضع الأنابيب في cycler الحرارية.
    4. ضبط البرنامج في cycler الحرارية لتسخين الحل في أنابيب إلى 95 درجة مئوية، وعقد لمدة 5 دقائق، ثم تبرد ببطء الحلول إلى 25 درجة مئوية خلال ~ 15 دقيقة (بمعدل ~ ،05-،1 ° C / ق). دورة التدفئة والتبريد هي ضمان التهجين الأمثل بين ش ج-أبتمر وQS. نتائج التهجين جزئية في تبريد غير مكتمل ومضان الخلفية أعلى من أجهزة الاستشعار. إذا كان cycler الحرارية غير متوفر، تنفيذ هذه العملية باستخدام حمام الماء الساخن بدلا من ذلك.
    5. مرة واحدة يتم تبريده الى 25 درجة مئوية، واستخدامها على الفور الحل، أو الاحتفاظ في cycler الحرارية (تصل إلى حوالي 2 ساعة) حتى يكون على استعداد لمستعمل. عند استخدام حمام ماء للتدفئة، وترك الأنابيب في الحمام كما الماء يبرد ببطء إلى درجة حرارة الغرفة.

    3. بناء منحنى الإسفار المعايرة والكشف عن وجود Unchelated ش ج 3+ في حل من وكيل التباين كلمة المدير العام

    1. حل GdCl 3 الصلبة في المخزن المؤقت فحص (المخزن نفسه كما في الخطوة 2.1).
    2. من خلال التخفيف المتسلسل، وإعداد 100 ميكرولتر كل من 6 حلول ش ج 3+ مختلفة في أنابيب microcentrifuge في ضعف تركيز المطلوب النهائية لمنحنى المعايرة (2X الحلول).
      1. على سبيل المثال، لإنشاء معايرة ل0 (العازلة فقط مع عدم وجود GdCl 3)، 50، 100، 200، 400، و 800 نيوتن متر من ش ج 3+، وإعداد الحلول التي تحتوي على 0، 100، 200، 400، 800، و 1،600 نيوتن متر من أيون. تأكد من تضمين دائما "فارغة" مع 0 نانومتر ش ج 3+ كما سيطرة سلبية.
    3. حل كيل النقيض أن يكون الاختبارإد في المنطقة العازلة الفحص. إعداد 2 أو 3 تركيزات مختلفة من الحلول عامل تباين عبر التخفيف المتسلسل.
      ملاحظة: اختبار 3 تركيزات مختلفة من الحل وكيل النقيض من المستحسن. هذا هو التأكد من أن هذه التركيزات ضمن نطاق خطي. إذا كانت العينات المختبرة لا تعرض وجود علاقة خطية، والحد من تركيز وكيل النقيض المستخدمة.
    4. خذ أنابيب PCR يحتوي الحل 2X ش ج استشعار من الخطوة 2.5 من cycler الحرارية.
    5. إضافة 50 ميكرولتر من كل كلمة المدير العام 3+ حل من الخطوة 3.2 إلى 6 من 9 أنابيب PCR يحتوي الحل 2X ش ج استشعار. مزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا. يحتوي كل أنبوب PCR الآن التركيز المطلوب من ش ج 3+ لفحصها، و 100 نيوتن متر ش ج-أبتمر، و 200 نانومتر QS.
    6. للأنابيب PCR المتبقية التي تحتوي على 2X حل كلمة المدير العام أجهزة الاستشعار، وإضافة 50 ميكرولتر من الحلول وكيل النقيض من الخطوة 3.3. مزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات.
    7. احتضان الصورةolutions في أنابيب PCR لحوالي 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قد يكون من اليسار إلى الوقوف لمدة تصل إلى 30 دقيقة.
    8. نقل 45 ميكرولتر من كل أنبوب في لوحة 384 جيدا. وسيكون لكل أنبوب PCR تعطي الآبار مكررة.
    9. تسجيل مضان من كل بئر على طبق من ذهب للقارئ. وfluorophore (فام) المستخدمة في تصميم ش ج-أجهزة الاستشعار لديها الإثارة وانبعاث قصوى تبلغ 495 و 520 نانومتر على التوالي، كما هو موضح على الموقع الإلكتروني للمورد. اختيار المناسبة الإثارة وانبعاث موجات أو مرشحات اعتمادا على ما إذا كان قارئ اللوحة هو monochromator- أو القائم على التصفية.
    10. رسم بياني من مضان في وحدات مضان التعسفية (AFU) ضد تركيز ش ج 3+.
    11. رسم بياني مع تغير مضان أضعاف ضد تركيز ش ج 3+. حساب التغير مضان أضعاف بقسمة AFU كل تركيز من قبل AFU من الحل "فارغ" (مع 0 نانومتر ش ج 3+). فإن التغيير مضان أضعاف تسمح للنormalization من النتائج، ينبغي عرض AFU بعض دورية (أيام مختلفة، وما إلى ذلك) الاختلافات.
    12. مقارنة الانبعاثات مضان من محلول يحتوي على عامل تباين و"فارغة"، وهو محلول يحتوي على 0 نانومتر GdCl 3 (العازلة فقط).
      ملاحظة: مضان أعلى من الحل GBCA يعني وجود unchelated ش ج 3+، والتي قد تتطلب المزيد من تنقية وكيل التباين. ويمكن تقدير كمية unchelated ش ج 3+ الحاضر باستخدام منحنى المعايرة التي شيدت في خطوة 3.10 أو 3.11.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    ويرد التغيير مضان نموذجي من الحل ش ج استشعار بحضور unchelated ش ج 3+ في الشكل 2. قد يكون رسم انبعاث كما تغير مضان أضعاف (الشكل 2A) أو مضان الخام القراءة (الشكل 2B) في وحدات التعسفي (AFU). كلا المؤامرات تسفر عن منحنيات المعايرة متشابهة جدا مع مجموعة خطية لتركيزات ش ج 3+ أقل من 1 ميكرومتر وتشبع إشارة في> 3 ميكرومتر. الحد من الكشف ~ 100 نيوتن متر مع نسبة 3 الإشارة إلى الضوضاء.

    في الحلول التي تحتوي على GBCA من الفائدة، وسوف تترجم وجود unchelated ش ج 3+ إلى زيادة مضان من أجهزة الاستشعار بالمقارنة مع حل "فارغ". التغييرات مضان في حلول من 2 دفعات مختلفة من مجمع ش ج-DOTA، واحدة من نقاء أعلى من الآخر، وتظهرن كأمثلة على نتائج ممثلة (الشكل 3). كلمة المدير العام-DOTA (حمض gadoteric) عبارة عن مجمع الجادولينيوم ش ج 3+ محاطة DOTA يجند العضوية التي يتم العثور عليها في وكيل النقيض التجاري. الدفعة العالي النقاء لا يعرض زيادة كبيرة في ما يصل الانبعاثات إلى 20 ملي ش ج-DOTA. عندما unchelated ش ج 3+ هو الحاضر، لوحظ التغيير الذي يمكن ملاحظته حتى بتركيزات ش ج-DOTA أقل من 5 مم. في هذا المثال حيث يتم رسم نقاط البيانات مع تغير مضان أضعاف من أجهزة الاستشعار، ويمكن تقدير الكمي لكمية unchelated ش ج 3+ باستخدام منحنى المعايرة في الشكل 2A.

    الشكل 2
    2. الممثل الشكل ش ج استشعار مضان المؤامرات منحنى المعايرة. تم تنفيذ جميع النقاط البيانات على الأقل في التكرارات والمتوسط ​​تقدر مؤامرةتيد مع الانحراف المعياري مثل أشرطة الخطأ. (أ) منحنى معايرة الحصول عليها باستخدام 100 نانومتر ش ج-أبتمر و 200 نانومتر QS. يتم رسم بياني مع التغيير مضان أضعاف كما المحور ص. (ب) نفس منحنى المعايرة كما في الفقرة (أ) مع مضان الخام في وحدات التعسفي (AFU) كما المحور ص. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الشكل (3)
    الشكل 3. الممثل تغيير كلمة المدير العام استشعار مضان عند اختبار وجود unchelated ش ج 3+ في عينات من ش ج-DOTA الجزيء. وترد دفعتين مختلفة من الحلول ش ج-DOTA المعقدة في هذه المؤامرة، واحدة من أعلى نقاء (دائرة علامة) والآخر يحتوي على unchelated ش ج 3+ (triangl الأزرقالبريد علامة). كل نقطة البيانات هي في المتوسط ​​قراءتين بانحراف معياري مثل أشرطة الخطأ. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    باستخدام كلمة المدير العام استشعار القائم على أبتمر، وزيادة في الانبعاثات مضان أن يتناسب مع تركيز unchelated ش ج 3+ لوحظ. لتقليل كمية العينة المستخدمة، يمكن تشغيل الفحص في صفيحة 384 بشكل جيد مع حجم العينة ما مجموعه 45 ميكرولتر لكل بئر. في هذا التصميم، واختيار فلوريسئين (فام) وdabcyl (DAB) ويستند في المقام الأول على تكلفة الكواشف. لتعديل الطول الموجي الانبعاثات، الاقتران مختلفة من fluorophore وفاكهه تقضي يمكن استخدامها 11.

    من المهم أن نلاحظ أن للحصول على أفضل نتيجة مع أجهزة الاستشعار، واحدة من الخطوات الحاسمة هو التدفئة إلى 95 درجة مئوية والتبريد البطيء (الخطوة 2.4) في المخزن المؤقت فحص لتحقيق التهجين الأمثل بين ش ج-أبتمر وQS فروع. وكما ذكر سابقا في البروتوكول، إذا كان cycler الحرارية غير متوفرة، ويمكن تنفيذ حضانة في 95 درجة مئوية في حمام مائي. معلمة رئيسية أخرى للسيطرة على لرانه التراكيب الحلول العازلة؛ ينصح استخدام المخزن المؤقت فحص المذكورة في الخطوة 2.1 بحل كيل النقيض من ذلك، أو يمكن استخدام الماء منزوع الأيونات أيضا. ومع ذلك، والحلول التي تحتوي على interferents المحتملين يجب تجنبها. مثال على هذا المخزن المؤقت واحد يحتوي على أيونات الفوسفات، والتي يمكن تنسيق لunchelated ش ج 3+ لتشكيل الجادولينيوم غير قابلة للذوبان الفوسفات 12. سوف يعجل لا تتفاعل مع استشعار، مما أدى إلى نتيجة سلبية كاذبة.

    يجوز تعديل على بعد خطوات قليلة في التجارب دون التأثير على النتيجة. أولا، لتبسيط الفحص وحساب، وإعداد كل من حل كلمة المدير العام استشعار والمائية GdCl 3 لمنحنى المعايرة بتركيزات 2X. إذا رغبت في ذلك، يمكن استخدام عوامل التخفيف الأخرى (على سبيل المثال، 10X الحلول)، شريطة أن يتم الحفاظ على تركيزات فحص النهائية للش ج-أبتمر وQS في 100 نانومتر و 200 نانومتر، على التوالي. الثاني، وفحص عازلة دالتضامن الإماراتي لا يجب أن تكون بالضبط درجة الحموضة 7.4. أي قيمة بين 7 - سوف تنتج 7.4 الزيادة مضان المطلوب، طالما يتم استخدام عازلة نفسها في كافة مراحل التجربة. ثالثا، مرة واحدة يتم الحصول على القراءة مضان الانبعاثات، ويمكن رسم نقاط البيانات إما مضان الخام في وحدة تعسفية (AFU) أو تغيير مضان أضعاف. لحساب التغير مضان أضعاف، وتطبيع القراءة مضان الخام من تركيز كل ل(مقسوما على) القراءة من السيطرة السلبية (0 نانومتر ش ج 3+). كما هو مبين في أرقام 2A وباء، واتجاهات الانبعاثات مضان في كل المؤامرات تكاد تكون متطابقة. قد يكون التغيير أضعاف وسيلة أكثر ملاءمة لتحليل البيانات إذا كان يعرض القارئ لوحة بعض الاختلافات في القراءات الخام سجلت في أوقات مختلفة. وأخيرا، إذا تم تجهيز المختبر مع التألق، ولكن لا قارئ لوحة، ويمكن قياس كل نقطة البيانات باستخدام كفيت، بدلا من صفيحة. اعتمادا على حجم سو في cuvettes المتاحة، قد تحتاج إلى تعديل على حجم الحلول التي يجري اعدادها في الفحص.

    طريقة ذكرت هنا يوفر بديلا للchromatographic- و / أو التقنيات المعتمدة الطيفي للكشف عن مائي ش ج 3+. بالمقارنة مع هذا الأخير، وفحص ش ج استشعار أكثر محدودية من حيث الحساسية والدقة، والقدرة على كشف في وقت واحد من أنواع متعددة. من ناحية أخرى، واستشعار القائم الطيفية يتطلب الأجهزة التي ربما قد تكون أكثر متاحة بسهولة، ويمكن إجراء في غضون فترة زمنية قصيرة، وإعداد العينات هو الحد الأدنى. وكيل النقيض من ذلك يجوز حل ببساطة في حل العازلة، ويخلط مع حل ش ج الاستشعار، وانبعاث مضان تقاس مباشرة. وعلاوة على ذلك، واستشعار قادرة على الكشف عن تركيز أقل بكثير من unchelated ش ج 3+ من مؤشر زايلينول البرتقالي (حوالي 2 أوامر من الفرق حجم بين الطريقتين) ويحتوي علىالانتقائية العليا للش ج 3+ على مدى عدة ايونات المعادن الهامة والانتقال بيولوجيا أخرى 9.

    هناك نوعان من عيوب هذا الاختبار قد تقييد استخدامه تحت بعض الظروف التجريبية. واحد القيد أن أجهزة الاستشعار ليست محددة لش ج 3+. فإنه يعرض ردا على أيونات اللانثينيدات أخرى (مثل الاتحاد الأوروبي 3+ والسل 3+) 9. ومع ذلك، هذه ليست أيونات توجد عادة في عوامل التباين أو الأنظمة البيولوجية وبالتالي، تدخلهم تكاد تكون معدومة. النقطة الثانية هو أن نلاحظ أن في تركيزات أعلى (فوق ~ 10 ميكرومتر) ش ج 3+، انخفاض تدريجي في انبعاث مضان ش ج استشعار لوحظ. تأثير التبريد بواسطة أيونات اللانثينيدات هو ظاهرة موثقة جيدا-13 التي استخدمت أيضا كأسلوب لكشف وقياس هذه 14. في حين أن هذا يحد من فائدة من أجهزة الاستشعار لقياس تركيزات عالية من ش ج 3+

    في هذا العمل، وقد وصفت استخدام تقنية القائم على مضان مريحة للكشف عن سامة unchelated ش ج 3+ في محلول مائي. ويهدف هذا الاختبار لتقييم مرحلة مبكرة من عامل تباين نقاء القائم على الجادولينيوم، وتحديدا خلال تركيب وصياغة للتجارب في المختبر. مع النمو الحالي للتصوير بالرنين المغناطيسي في التشخيص، ويجري باستمرار صممت عددا متزايدا من عوامل التباين رواية واختبارها. فإن كلمة المدير العام استشعار القائم على أبتمر تسهيل هذا التطور من خلال توفير وسيلة للكشف عن بسرعة وجود تركيزات شبه مكرومولي من غير المتفاعل أو فصل ش ج 3+ في محلول مائي عند درجة الحموضة المحيطة. وعلاوة على ذلك، لأن أجهزة الاستشعار يعرض عبر التفاعل مع غيرها من أيونات الثلاثي اللانثينيدات، قد يكون تطبيقهمددت إلى هذه المناطق للبحث.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Gd-aptamer IDTDNA Input sequence and fluorophore modification in the order form A fluorophore with a different emission wavelength may be used. The aptamer may also be ordered from another company.
    Quenching strand IDTDNA Input sequence and quencher modification in the order form A different quencher for optimal energy transfer from the fluorophore may be used. The aptamer may also be ordered from another company.
    Molecular biology grade water No specific manufacturer, both DEPC or non-DEPC treated work equally well
    Gadolinium(III) chloride anhydrous Strem 936416 Toxic
    HEPES Fisher Scientific BP310-500
    Magnesium chloride anhydrous MP Biomedicals 0520984480 - 100 g
    Sodium Chloride Acros Organics 327300025
    Potassium chloride Fisher Scientific P333-500
    Sodium hydroxide, pellets Fisher Scientific BP359 Corrosive
    Hydrochloric acid Fisher Scientific SA49 Toxic and corrosive
    384-well low flange black flat bottom polystyrene NBS plates Corning 3575 Plates which are suitable for fluorescence reading are required.
    Nalgene Rapid-Flow sterile disposable bottle top filter Thermo Scientific 5680020 The bottle top is fitted with 0.2 micron PES membrane
    Disposable sterile bottles 250 mL Corning 430281 A larger or smaller bottle may be used
    1.5 mL microcentrifuge tubes No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free
    0.2 mL PCR tubes No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free
    Micropipets No specific manufacturer
    Pipet tips (non filter) of appropriate sizes No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free
    Equipment
    Plate reader Biotek Synergy H1 Plate readers from other manufacturers would work equally well

    References

    1. Shen, C., New, E. J. Promising strategies for Gd-based responsive magnetic resonance imaging contrast agents. Curr. Opin. Chem. Biol. 17, (2), 158-166 (2013).
    2. Cheong, B. Y. C., Muthupillai, R. Nephrogenic systemic fibrosis: a concise review for cardiologists. Tex. Heart Inst. J. 37, (5), 508-515 (2010).
    3. Hao, D., Ai, T., Goerner, F., Hu, X., Runge, V. M., Tweedle, M. MRI contrast agents: basic chemistry and safety. J Magn. Reson. Imaging. 36, (5), 1060-1071 (2012).
    4. Telgmann, L., Sperling, M., Karst, U. Determination of gadolinium-based MRI contrast agents in biological and environmental samples: a review. Anal. Chim. Acta. 764, 1-16 (2013).
    5. Frenzel, T., Lengsfeld, P., Schirmer, H., Hütter, J., Weinmann, H. -J. Stability of gadolinium-based magnetic resonance imaging contrast agents in human serum at 37 degrees C. Invest. Radiol. 43, (12), 817-828 (2008).
    6. Loreti, V., Bettmer, J. Determination of the MRI contrast agent Gd-DTPA by SEC-ICP-MS. Anal. Bioanal. Chem. 379, (7), 1050-1054 (2004).
    7. Telgmann, L., et al. Speciation and isotope dilution analysis of gadolinium-based contrast agents in wastewater. Environ. Sci. Technol. 46, (21), 11929-11936 (2012).
    8. Cleveland, D., et al. Chromatographic methods for the quantification of free and chelated gadolinium species in MRI contrast agent formulations. Anal. Bioanal. Chem. 398, (7), 2987-2995 (2010).
    9. Edogun, O., Nguyen, N. H., Halim, M. Fluorescent single-stranded DNA-based assay for detecting unchelated gadolinium(III) ions in aqueous solution. Anal. Bioanal. Chem. 408, (15), 4121-4131 (2016).
    10. Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note. Contrast Med. Mol. Imaging. 1, (5), 184-188 (2006).
    11. Johansson, M. K. Choosing reporter-quencher pairs for efficient quenching through formation of intramolecular dimers. Methods Mol. Biol. 335, 17-29 (2006).
    12. Sherry, A. D., Caravan, P., Lenkinski, R. E. A primer on gadolinium chemistry. J. Magn. Reson. Imaging. 30, (6), 1240-1248 (2009).
    13. Shakhverdov, T. A. A cross-relaxation mechanism of fluorescence quenching in complexes of lanthanide ions with organic ligands. Opt. Spectrosc. 95, (4), 571-580 (2003).
    14. Brittain, H. G. Submicrogram determination of lanthanides through quenching of calcein blue fluorescence. Anal. Chem. 59, (8), 1122-1125 (1987).

    Comments

    0 Comments

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter