Name: soil microbe study using community dna
Uploaded: 2023-04-30T06:46:56.000Z
Duration: 9 min 59 s
Channel: JoVE

K12 Standards

Virginia  Standards of Learning

HIgh School

Biology

BIO.4

BIO.4.d

community-dna-extraction-from-bacterial-colonies

Community DNA Extraction from Bacterial Colonies

فئة 1. استخراج الحمض النووي للمجتمع البكتيري
<ol>
	<li>لبدء الإجراء ، قم بوزن 100 غرام من التربة المنخلة. أضف هذا إلى وعاء من مادة البولي بروبلين ، وأضف 100 مل من مخزن الاستخراج المخزن المؤقت المكون من مخزن ثلاثي المخزن المؤقت المعدل باستخدام EDTA لتعزيز إطلاق البكتيريا من مصفوفة التربة ، ثم رجها باليد.</li>
	<li>بعد ذلك ، قم بوزن 100 غرام من الخرز الزجاجي ، وأضفها إلى وعاء الخلط. حرك العينة لمدة 5 دقائق باستخدام جهاز ضرب الخرزة أو شاكر ميكانيكي للمعصم لمدة 15 دقيقة. أضف 10 مل 20٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم ، أو SDS ، إلى الخليط ، ثم حركه لمدة دقيقة إضافية. احتضان عند درجة حرارة عالية من 60 إلى 65 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.</li>
	<li>قم بتوزيع العينة بالتساوي بين أنابيب منفصلة سعة 50 مل ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 6,000 × جم. انقل المادة الطافية من الأنابيب إلى حاوية واحدة معقمة. بعد ذلك, كرر الاستخراج على حبيبات التربة كما هو موضح سابقا, باستخدام حجم جديد من المخزن المؤقت للاستخراج.</li>
	<li>بعد ذلك ، أضف الحجم الإجمالي للطافي المعالج ، حوالي 200 مل ، إلى أنبوب نظيف سعة 50 مل مملوء بنصف الحجم بمحلول 30٪ بولي إيثيلين جلايكول و 1.6 مليون كلوريد الصوديوم. اقلب الزجاجات عدة مرات باليد لخلطها ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. عينات أجهزة الطرد المركزي عند 10,000 × جم لمدة 20 دقيقة لحبيبات الحمض النووي.</li>
	<li>قم بإزالة المادة الطافية بعناية من أنبوب الطرد المركزي ، تاركا وراءها حبيبات الحمض النووي المنقاة جزئيا. أضف 20 مل من TE Buffer و 1.5 مل من محلول أسيتات البوتاسيوم 7.5 M لإعادة تعليق الحبيبات ، ثم الدوامة. ضع المعلق على الثلج لمدة 5 دقائق. جهاز طرد مركزي عند 16,000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية لترسيب البروتينات والسكريات.</li>
	<li>بعد ذلك ، أضف RNAse و proteinase K إلى العينة ، واخلطها برفق باليد ، واتركها للحظة. أضف حجما مكافئا من الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزواميل (خليط نسبي 25:24: 1) إلى المعلق المراد استخراجه ، واخلطه برفق باليد. الطرد المركزي التحضير لمدة 10 دقائق عند 13,000 × جم. قم بإزالة الوعاء بعناية من جهاز الطرد المركزي ، ولاحظ الطبقتين.</li>
	<li>تتكون الطبقة السفلية الأثقل من الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزواميل والحطام المستخرج ، والطبقة العليا هي المائية وتحتوي على الحمض النووي. ضع الطور المائي في وعاء معقم ، وأضف حجما مكافئا من الأيزوبروبانول ، واقلبها برفق لبدء ترسيب الحمض النووي. احتضان التعليق في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. بيليه الحمض النووي المنقى عن طريق الطرد المركزي عند 16,000 × جم لمدة 30 دقيقة. قم بإزالة المادة الطافية بعناية لأن الحمض النووي المحبب قد يكون مرئيا أو لا يكون مرئيا في قاع الوعاء ، ثم أعد تعليقه في 1 مل من TE Buffer.</li>
	<li>باستخدام مقياس الطيف الضوئي أو مقياس فلوري القياس الكمي للحمض النووي / الحمض النووي الريبي ، قم بقياس مستوى الحمض النووي المستخرج من العينة. تقدر كمية الحمض النووي من قراءة 260 نانومتر. قراءة الامتصاص 1.0 تعادل 50 ميكروغرام من الحمض النووي لكل مل من المحلول. إذا كان التركيز مرتفعا جدا لإجراء قراءات دقيقة ، فقم بتخفيف المعلق من 1 إلى 10 ، أو 1 إلى 100 باستخدام الماء الجزيئي.</li>
	<li>يقدر نقاء الحمض النووي من نسبة القراءة عند 260 نانومتر إلى تلك عند 280 نانومتر. تشير القيمة > 1.7 إلى الحمض النووي النقي نسبيا. القيمة النظرية القصوى هي 2.0.</li>
</ol>
<div class = "chapter_text" id = "script_0" >
استخراج الحمض النووي للمجتمع البكتيري هو عملية يتم من خلالها الحصول على الحمض النووي من أنواع بكتيرية متعددة داخل المجتمع أثناء إجراء استخراج واحد.
عادة ما تتضمن التحليلات التقليدية للمجتمعات الميكروبية في التربة فحوصات ثقافية ، باستخدام منهجية التخفيف والطلاء على وسائط انتقائية مختلفة. ومع ذلك ، فإن العديد من البكتيريا تنمو بشكل سيئ في ظل ظروف المختبر أو في ظروف وسائط النمو المحددة المختارة ، مما يعني أنها قد تفوتك أو ممثلة تمثيلا ناقصا بشدة.
في الآونة الأخيرة ، سمح استخراج الحمض النووي للمجتمع من عينات بكتيرية التربة بأخذ عينات أكثر شمولا من المجتمعات البكتيرية. يعتقد أن هذا النهج غير القائم على الثقافة أكثر تمثيلا للمجتمعات الفعلية الحالية من الأساليب التقليدية القائمة على الثقافة.
سيوضح هذا الفيديو طريقة غير مزروعة لاستخراج الحمض النووي للمجتمع البكتيري ، وكيفية التحقق من جودة وكمية الحمض النووي المستخرج ، واستكشاف كيفية استخدام هذا الحمض النووي لدراسة التنوع البكتيري.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_1">
يمكن إجراء استخراج الحمض النووي من التربة بإحدى طريقتين. في طريقة التجزئة ، يتم فصل الخلايا أولا عن مصفوفة التربة قبل استخراج المادة الوراثية. ثم تخضع العينة لدورات متتالية من المزج والطرد المركزي البطيء من أجل جمع الخلايا السليمة في الحبيبات.
ثم تضاف الليزوزيم إلى الخلايا ، ويتم تحضين المعلق. الليزوزيم هي إنزيمات تكسر جدران الخلايا البكتيرية. بمجرد اختراق بنية جدار الخلية ، يمكن بعد ذلك تحرير الحمض النووي للتنقية. ومع ذلك ، فقد ثبت أن الطريقة الثانية لاستخراج الحمض النووي المجتمعي ، وهي الطريقة في الموقع ، تنتج تركيزا أكبر للحمض النووي.
هنا ، يتم دمج كتلة من التربة مع حجم مكافئ من مخزن الاستخراج Tris-EDTA والخرز الزجاجي ، ويتم خلطها بقوة لتسهيل فصل الخلايا عن جزيئات التربة. ثم يضاف المنظف ، بشكل عام كبريتات دوديسيل الصوديوم ، أو SDS ، ويتم مزج العينة بشكل أكبر لتعزيز تحلل الخلايا وإطلاق محتوياتها ، بما في ذلك الحمض النووي.
ثم يتم إجراء الحضانة عند درجة حرارة عالية لتحلل أي خلايا بكتيرية متبقية. يتم طرد العينات ، ويتم إجراء استخراج واحتضان البولي إيثيلين جلايكول على المادة الطافية من أجل ترسيب الحمض النووي ، والذي يتم طرده بعد ذلك في حبيبات.
يتم إعادة تعليق الحمض النووي في TE Buffer وخلات البوتاسيوم من أجل غسل الحمض النووي للبروتينات والسكريات ، ثم يتم إجراء الطرد المركزي لحبيبات هذه المكونات غير المرغوب فيها. تتم إزالة المادة الطافية المائية التي تحتوي على الحمض النووي ، وإخضاعها لاستخراج الفينول كلوروفورم وترسيب الأيزوبروبانول لمزيد من التنظيف والتركيز على الحمض النووي. بعد فترة حضانة درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين ، يتم طرد الحمض النووي وإعادة تعليقه في TE Buffer للتخزين حتى التحليل.
الآن بعد أن أصبحنا على دراية بالمفاهيم والعمليات الكامنة وراء استخراج الحمض النووي للمجتمع البكتيري ، دعنا نلقي نظرة على كيفية إجراؤه في المختبر.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_2">
لبدء الإجراء ، قم بوزن 100 غرام من التربة المنخلة. أضف هذا إلى وعاء من مادة البولي بروبلين ، وأضف 100 مل من مخزن الاستخراج المخزن المؤقت المكون من مخزن ثلاثي المخزن المؤقت المعدل باستخدام EDTA لتعزيز إطلاق البكتيريا من مصفوفة التربة ، ثم رجها باليد.
بعد ذلك ، قم بوزن 100 غرام من الخرز الزجاجي ، وأضفها إلى وعاء الخلط. حرك العينة لمدة 5 دقائق باستخدام جهاز ضرب الخرزة أو شاكر ميكانيكي للمعصم. أضف 10 مل 20٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم ، أو SDS ، إلى الخليط ، ثم حركه لمدة دقيقة إضافية. احتضان على درجة حرارة عالية لمدة 60 دقيقة.
قم بتوزيع العينة بالتساوي بين أنابيب منفصلة سعة 50 مل ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 6,000 × جم. انقل المادة الطافية من الأنابيب إلى حاوية واحدة معقمة. بعد ذلك, كرر الاستخراج على حبيبات التربة كما هو موضح سابقا, باستخدام حجم جديد من المخزن المؤقت للاستخراج.
بعد ذلك ، أضف الحجم الإجمالي للطافي المعالج إلى أنبوب نظيف سعة 50 مل مملوء بنصف الحجم بمحلول 30٪ من البولي إيثيلين جلايكول و 1.6 مليون كلوريد الصوديوم. اقلب الزجاجات عدة مرات باليد لخلطها ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. عينات أجهزة الطرد المركزي عند 10,000 × جم لمدة 20 دقيقة لحبيبات الحمض النووي.
قم بإزالة المادة الطافية بعناية من أنبوب الطرد المركزي ، تاركا وراءها حبيبات الحمض النووي المنقاة جزئيا. أضف 20 مل من TE Buffer و 1.5 مل من محلول أسيتات البوتاسيوم 7.5 M لإعادة تعليق الحبيبات ، ثم الدوامة. ضع المعلق على الثلج لمدة 5 دقائق. جهاز طرد مركزي عند 16,000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية لترسيب البروتينات والسكريات.
بعد ذلك ، أضف RNAse و proteinase K إلى العينة ، واخلطها برفق باليد ، واتركها للحظة. أضف حجما مكافئا من الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزواميل إلى المعلق المراد استخراجه ، واخلطه برفق باليد. الطرد المركزي التحضير لمدة 10 دقائق عند 13,000 × جم. قم بإزالة الوعاء بعناية من جهاز الطرد المركزي ، ولاحظ الطبقتين.
تتكون الطبقة السفلية الأثقل من الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزواميل والحطام المستخرج ، والطبقة العليا هي المائية وتحتوي على الحمض النووي. ضع الطور المائي في وعاء معقم ، وأضف حجما مكافئا من الأيزوبروبانول ، واقلبها برفق لبدء ترسيب الحمض النووي. احتضان التعليق في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. بيليه الحمض النووي المنقى عن طريق الطرد المركزي عند 16,000 × جم لمدة 30 دقيقة. قم بإزالة المادة الطافية بعناية لأن الحمض النووي المحبب قد يكون مرئيا أو لا يكون مرئيا في قاع الوعاء ، ثم أعد تعليقه في 1 مل من TE Buffer.
باستخدام مقياس الطيف الضوئي أو مقياس فلوري القياس الكمي للحمض النووي / الحمض النووي الريبي ، قم بقياس مستوى الحمض النووي المستخرج من العينة. ستنتج مقاييس فلورية الحمض النووي / الحمض النووي الريبي مستويات الحمض النووي بوحدات نانوجرام لكل ملليلتر. إذا كان التركيز مرتفعا جدا لإجراء قراءات دقيقة ، فقم بتخفيف المعلق من 1 إلى 10 ، أو 1 إلى 100 باستخدام الماء الجزيئي.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_3">
بمجرد الحصول على الحمض النووي من مجتمع بكتيري ، يمكن استخدام ذلك بعدة طرق مختلفة. يتم استكشاف بعض هذه التطبيقات هنا.
يمكن أن توفر التحليلات الطيفية للحمض النووي المستخرج من الحمض النووي للمجتمع نظرة ثاقبة لعدد الخلايا البكتيرية الموجودة في عينة معينة من التربة. يمكن ربط الكمية المقدرة للحمض النووي في نانوغرام لكل مل من المحلول بالحجم الإجمالي للحمض النووي المستخرج في المحلول ، لإعطاء الكمية الإجمالية للحمض النووي لكل غرام من التربة. بمعرفة القيمة النظرية للحمض النووي لكل خلية ، يمكن حساب العدد الإجمالي للخلايا لكل غرام من التربة.
بالنسبة للتطبيقات الأكثر استهدافا ، يمكن إخضاع الحمض النووي المستخرج من المجتمعات البكتيرية لتفاعل البوليميراز المتسلسل لتحديد ما إذا كان نوع معين موجودا داخل المجتمع. على سبيل المثال ، قد يرغب العلماء في تحديد ما إذا كانت عينات التربة تحتوي على مسببات أمراض معينة ، مثل Clostridium perfringens أو Bacillus anthracis.
أخيرا ، للحصول على فهم أكثر شمولا للبكتيريا الموجودة في المجتمع ، يمكن أن تخضع عينات الحمض النووي للتوصيف "الصوتي" والمعلوماتية الحيوية التي تسمح بتحليل أعمق للبكتيريا الأصلية داخل العينة. يصف "Omics" مجموعة من التقنيات التي تستكشف أدوار وعلاقات وإجراءات الجزيئات في الكائنات الحية أو المجتمعات. يتضمن ذلك دراسات الجينات ووظيفتها ، أو "علم الجينوم" ، و "البروتينات" ، دراسة البروتينات وأدوارها. على سبيل المثال ، يمكن أن يسمح تسلسل 16S RNA من العينات بتحديد ميتاجينومي لأنواع معينة داخل المجتمع ، مما يعطي تقديرا أكثر تفصيلا للتنوع. يمكن أن يمنح هذا النهج العلماء فهما أفضل لتكوين الأنواع في المجتمع ، والأدوار التي قد يقومون بها.
</div>
<div class = "chapter_text" id = "script_4" >
لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE لاستخراج الحمض النووي للمجتمع البكتيري. يجب أن تفهم الآن كيفية استخراج الحمض النووي من مجتمع بكتيري ، وكيفية التحقق من جودة هذا الحمض النووي ، وكيف يمكن استخدام هذا الحمض النووي للتحقيقات في تكوين المجتمع البكتيري. شكرا للمشاهدة!
</div>

يمكن إخضاع الحمض النووي للمجتمع من المستعمرات المستزرعة أو المستخرجة من التربة للمعلوماتية الحيوية والأساليب "الشاملة" التي تسمح بتوصيف البكتيريا الأصلية داخل العينة. تشمل الأساليب omic علم الميتاجينوم - تحديد "من" داخل المجتمع عبر تسلسل 16S rRNA. هذا يعطي تقديرا للتنوع داخل المجتمع.
يمكن أيضا حساب عدد الخلايا البكتيرية في عينة التربة الأصلية. يتم استخراج الحمض النووي للمجتمع من التربة وقياسه عن طريق التحليلات الطيفية. ترتبط الكمية المقدرة للحمض النووي المقاسة على أنها ميكروغرام من الحمض النوو...

استخراج الحمض النووي المجتمعي من المستعمرات البكتيرية

المصدر: مختبرات الدكتور إيان بيبر والدكتور تشارلز جيربا - جامعة أريزونا 
المؤلف التوضيحي: لويزا إيكنر
عادة ما تتضمن الطرق التقليدية للتحليل للمجتمعات الميكروبية داخل التربة إما فحوصات ثقافية باستخدام منهجية التخفيف والطلاء على الوسائط الانتقائية والتفاضلية أو فحوصات العد المباشر. تقدم العدادات المباشرة معلومات حول العدد الإجمالي للبكتيريا الموجودة ، ولكنها لا تعطي معلومات حول عدد أو تنوع السكان الموجودين داخل المجتمع. يسمح تعداد اللوحات بتعداد إجمالي السكان الثقافيين أو الثقافيين المختارين ، وبالتالي توفر معلومات عن المجموعات السكانية المختلفة الموجودة. ومع ذلك ، نظرا لأن أقل من 1٪ من بكتيريا التربة قابلة للزراعة بسهولة ، فإن المعلومات الثقافية لا تقدم سوى جزء من الصورة. يعتمد الجزء الفعلي من المجتمع الذي يمكن استزراعه على الوسيط المختار للتهم الثقافية. ستختار أي وسيط واحد السكان الأنسب لتلك الوسيلة المحددة. 
في السنوات الأخيرة ، أصبحت مزايا دراسة الحمض النووي المجتمعي المستخرج من عينات التربة واضحة. يعتقد أن هذا النهج غير القائم على الثقافة أكثر تمثيلا للمجتمع الفعلي الحاضر من النهج القائمة على الثقافة. بالإضافة إلى توفير معلومات حول أنواع السكان الموجودين ، يمكن أن يوفر هذا النهج أيضا معلومات حول إمكاناتهم الجينية. كما هو الحال مع أي تقنية ، هناك قيود على البيانات التي يمكن الحصول عليها من خلال استخراج الحمض النووي. لذلك ، يستخدم العديد من الباحثين الآن استخراج الحمض النووي جنبا إلى جنب مع التعداد المباشر والثقافي لتعظيم البيانات التي تم الحصول عليها من عينة بيئية.

Source: Laboratories of Dr. Ian Pepper and Dr. Charles Gerba - The University of Arizona
Demonstrating Author: Luisa Ikner
Traditional methods of analysis ...

استخراج الحمض النووي للمجتمع البكتيري هو عملية يتم من خلالها الحصول على الحمض النووي من أنواع بكتيرية متعددة داخل المجتمع أثناء إجراء استخراج واحد. عادة ما تتضمن التحليلات التقليدية للمجتمعات الميكروبية في التربة فحوصات ثقافية ، باستخدام منهجية التخفيف والطلاء على وسائط انتقائية مختلفة. ومع ذلك ، فإن العديد من البكتيريا تنمو بشكل سيئ في ظل ظروف المختبر أو في ظروف وسائط النمو المحددة المختارة ، مما يعني أنها قد تفوتك أو ممثلة تمثيلا ناقصا بشدة. في الآونة الأخيرة ، سمح استخراج الحمض النووي للمجتمع من عينات بكتيرية التربة بأخذ عينات أكثر شمولا من المجتمعات البكتيرية. يعتقد أن هذا النهج غير القائم على الثقافة أكثر تمثيلا للمجتمعات الفعلية الحالية من الأساليب التقليدية القائمة على الثقافة. سيوضح هذا الفيديو طريقة غير مزروعة لاستخراج الحمض النووي للمجتمع البكتيري ، وكيفية التحقق من جودة وكمية الحمض النووي المستخرج ، واستكشاف كيفية استخدام هذا الحمض النووي لدراسة التنوع البكتيري. يمكن إجراء استخراج الحمض النووي من التربة بإحدى طريقتين. في طريقة التجزئة ، يتم فصل الخلايا أولا عن مصفوفة التربة قبل استخراج المادة الوراثية. ثم تخضع العينة لدورات متتالية من المزج والطرد المركزي البطيء من أجل جمع الخلايا السليمة في الحبيبات. ثم تضاف الليزوزيم إلى الخلايا ، ويتم تحضين المعلق. الليزوزيم هي إنزيمات تكسر جدران الخلايا البكتيرية. بمجرد اختراق بنية جدار الخلية ، يمكن بعد ذلك تحرير الحمض النووي للتنقية. ومع ذلك ، فقد ثبت أن الطريقة الثانية لاستخراج الحمض النووي المجتمعي ، وهي الطريقة في الموقع ، تنتج تركيزا أكبر للحمض النووي. هنا ، يتم دمج كتلة من التربة مع حجم مكافئ من مخزن الاستخراج Tris-EDTA والخرز الزجاجي ، ويتم خلطها بقوة لتسهيل فصل الخلايا عن جزيئات التربة. ثم يضاف المنظف ، بشكل عام كبريتات دوديسيل الصوديوم ، أو SDS ، ويتم مزج العينة بشكل أكبر لتعزيز تحلل الخلايا وإطلاق محتوياتها ، بما في ذلك الحمض النووي. ثم يتم إجراء الحضانة عند درجة حرارة عالية لتحلل أي خلايا بكتيرية متبقية. يتم طرد العينات ، ويتم إجراء استخراج واحتضان البولي إيثيلين جلايكول على المادة الطافية من أجل ترسيب الحمض النووي ، والذي يتم طرده بعد ذلك في حبيبات. يتم إعادة تعليق الحمض النووي في TE Buffer وخلات البوتاسيوم من أجل غسل الحمض النووي للبروتينات والسكريات ، ثم يتم إجراء الطرد المركزي لحبيبات هذه المكونات غير المرغوب فيها. تتم إزالة المادة الطافية المائية التي تحتوي على الحمض النووي ، وإخضاعها لاستخراج الفينول كلوروفورم وترسيب الأيزوبروبانول لمزيد من التنظيف والتركيز على الحمض النووي. بعد فترة حضانة درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين ، يتم طرد الحمض النووي وإعادة تعليقه في TE Buffer للتخزين حتى التحليل. الآن بعد أن أصبحنا على دراية بالمفاهيم والعمليات الكامنة وراء استخراج الحمض النووي للمجتمع البكتيري ، دعنا نلقي نظرة على كيفية إجراؤه في المختبر. لبدء الإجراء ، قم بوزن 100 غرام من التربة المنخلة. أضف هذا إلى وعاء من مادة البولي بروبلين ، وأضف 100 مل من مخزن الاستخراج المخزن المؤقت المكون من مخزن ثلاثي المخزن المؤقت المعدل باستخدام EDTA لتعزيز إطلاق البكتيريا من مصفوفة التربة ، ثم رجها باليد. بعد ذلك ، قم بوزن 100 غرام من الخرز الزجاجي ، وأضفها إلى وعاء الخلط. حرك العينة لمدة 5 دقائق باستخدام جهاز ضرب الخرزة أو شاكر ميكانيكي للمعصم. أضف 10 مل 20٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم ، أو SDS ، إلى الخليط ، ثم حركه لمدة دقيقة إضافية. احتضن العينة على درجة حرارة عالية لمدة 60 دقيقة. قم بتوزيع العينة بالتساوي بين أنابيب منفصلة سعة 50 مل ، وجهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 6,000 × جم. انقل المادة الطافية من الأنابيب إلى حاوية واحدة معقمة. بعد ذلك, كرر الاستخراج على حبيبات التربة كما هو موضح سابقا, باستخدام حجم جديد من المخزن المؤقت للاستخراج. بعد ذلك ، أضف الحجم الإجمالي للطافي المعالج إلى أنبوب نظيف سعة 50 مل مملوء بنصف الحجم بمحلول 30٪ من البولي إيثيلين جلايكول و 1.6 مليون كلوريد الصوديوم. اقلب الزجاجات عدة مرات باليد لخلطها ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. عينات أجهزة الطرد المركزي عند 10,000 × جم لمدة 20 دقيقة لحبيبات الحمض النووي. قم بإزالة المادة الطافية بعناية من أنبوب الطرد المركزي ، تاركا وراءها حبيبات الحمض النووي المنقاة جزئيا. أضف 20 مل من TE Buffer و 1.5 مل من محلول أسيتات البوتاسيوم 7.5 M لإعادة تعليق الحبيبات ، ثم الدوامة. ضع المعلق على الثلج لمدة 5 دقائق. جهاز طرد مركزي عند 16,000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4؟ C لترسيب البروتينات والسكريات. بعد ذلك ، أضف RNAse و proteinase K إلى العينة ، واخلطها برفق باليد ، واتركها للحظة. أضف حجما مكافئا من الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزواميل إلى المعلق المراد استخراجه ، واخلطه برفق باليد. الطرد المركزي التحضير لمدة 10 دقائق عند 13,000 × جم. قم بإزالة الوعاء بعناية من جهاز الطرد المركزي ، ولاحظ الطبقتين. تتكون الطبقة السفلية الأثقل من الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزواميل والحطام المستخرج ، والطبقة العليا هي المائية وتحتوي على الحمض النووي. ضع الطور المائي في وعاء معقم ، وأضف حجما مكافئا من الأيزوبروبانول ، واقلبها برفق لبدء ترسيب الحمض النووي. احتضان التعليق في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. بيليه الحمض النووي المنقى عن طريق الطرد المركزي عند 16,000 × جم لمدة 30 دقيقة. قم بإزالة المادة الطافية بعناية لأن الحمض النووي المحبب قد يكون مرئيا أو لا يكون مرئيا في قاع الوعاء ، ثم أعد تعليقه في 1 مل من TE Buffer. باستخدام مقياس الطيف الضوئي أو مقياس فلوري القياس الكمي للحمض النووي / الحمض النووي الريبي ، قم بقياس مستوى الحمض النووي المستخرج من العينة. ستنتج مقاييس فلورية الحمض النووي / الحمض النووي الريبي مستويات الحمض النووي بوحدات نانوجرام لكل ملليلتر. إذا كان التركيز مرتفعا جدا لإجراء قراءات دقيقة ، فقم بتخفيف المعلق من 1 إلى 10 ، أو 1 إلى 100 باستخدام الماء الجزيئي. بمجرد الحصول على الحمض النووي من مجتمع بكتيري ، يمكن استخدام ذلك بعدة طرق مختلفة. يتم استكشاف بعض هذه التطبيقات هنا. يمكن أن توفر التحليلات الطيفية للحمض النووي المستخرج من الحمض النووي للمجتمع نظرة ثاقبة لعدد الخلايا البكتيرية الموجودة في عينة معينة من التربة. يمكن ربط الكمية المقدرة للحمض النووي في نانوغرام لكل مل من المحلول بالحجم الإجمالي للحمض النووي المستخرج في المحلول ، لإعطاء الكمية الإجمالية للحمض النووي لكل غرام من التربة. بمعرفة القيمة النظرية للحمض النووي لكل خلية ، يمكن حساب العدد الإجمالي للخلايا لكل غرام من التربة. بالنسبة للتطبيقات الأكثر استهدافا ، يمكن إخضاع الحمض النووي المستخرج من المجتمعات البكتيرية لتفاعل البوليميراز المتسلسل لتحديد ما إذا كان نوع معين موجودا داخل المجتمع. على سبيل المثال ، قد يرغب العلماء في تحديد ما إذا كانت عينات التربة تحتوي على مسببات أمراض معينة ، مثل Clostridium perfringens أو Bacillus anthracis. أخيرا ، للحصول على فهم أكثر شمولا للبكتيريا الموجودة في المجتمع ، يمكن أن تخضع عينات الحمض النووي لتوصيف "أومي" والمعلوماتية الحيوية التي تسمح بتحليل أعمق للبكتيريا الأصلية داخل العينة. ? أوميكس؟ يصف مجموعة من التقنيات التي تستكشف أدوار وعلاقات وإجراءات الجزيئات في الكائنات الحية أو المجتمعات. وهذا يشمل دراسات الجينات ووظيفتها ، أو ؟ علم الجينوم؟، و؟ البروتينات؟, دراسة البروتينات وأدوارها.? على سبيل المثال ، تسلسل 16S؟ يمكن أن يسمح الحمض النووي الريبي من العينات بتحديد ميتاجينومي لأنواع معينة داخل المجتمع ، مما يعطي تقديرا أكثر تفصيلا للتنوع. يمكن أن يمنح هذا النهج العلماء فهما أفضل لتكوين الأنواع في المجتمع ، والأدوار التي قد يقومون بها. لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE لاستخراج الحمض النووي للمجتمع البكتيري. يجب أن تفهم الآن كيفية استخراج الحمض النووي من مجتمع بكتيري ، وكيفية التحقق من جودة هذا الحمض النووي ، وكيف يمكن استخدام هذا الحمض النووي للتحقيقات في تكوين المجتمع البكتيري. شكرا للمشاهدة!

Education

JoVE Science Education

Environmental Sciences

العلوم البيئية

Environmental Microbiology

علم الأحياء الدقيقة البيئي

soil microbe study using community dna

Community DNA from soil helps scientists study microbial communities without relying only on culture tests. Traditional methods use dilution and plating on selective or differential media, or they use direct count assays. Direct counts show the total number of bacteria present, but they do not show how many populations are in the community or how diverse those populations are.

Plate counts can measure total culturable bacteria or selected culturable groups. That makes them useful for comparing different populations. However, less than 1% of soil bacteria are readily culturable, so these results show only part of the full community. The fraction that grows also depends on the medium used, because one medium favors the organisms best suited to it.

DNA extraction from soil gives a nonculture-based way to study the community. Researchers consider it more representative of the actual community than culture-based methods alone. It can also provide information about the genetic potential of the organisms present. Because each method has limits, many researchers combine DNA extraction with direct counts and cultural counts to get the most complete picture from an environmental sample.

Soil Microbe Study Using Community DNA

determination of moisture content in soil

determination-of-moisture-content-in-soil

Soil Pore Space and Water Content

Soil pore space holds water and air. Soil moisture content is the amount of water present in soil. This water sits in the spaces between soil aggregates and inside the aggregates themselves. These spaces are called inter-aggregate pore space and intra-aggregate pore space. In normal soil, pore space is usually filled by air, water, or both. If the pores contain only air, the soil is completely dry. If the pores are filled with water, the soil is saturated.

aseptic technique in environmental science

aseptic-technique-in-environmental-science

Preventing Contamination in Microbiology Labs

Aseptic technique helps prevent contamination in environmental microbiology labs. It is a careful lab skill that takes practice and attention. When used correctly, it lowers the chance that bacteria or fungi will contaminate reagents, culture media, or environmental samples. This technique also protects data quality. Keeping samples and cultures clean helps preserve the purity of culture libraries, including rare isolates that are difficult to grow. In this way, aseptic technique supports...

gram staining of bacteria from environmental sources

gram-staining-of-bacteria-from-environmental-sources

Visualizing Environmental Bacteria with Gram Stain

Gram staining helps scientists visualize bacteria collected from environmental sources. It is a fast, practical method for sorting culturable bacterial populations of interest. For environmental microbiologists, this can be useful whether the sample comes from a known isolate in the lab or from soil or water collected in the field. Environmental microbiology includes many kinds of research, from bench-scale work to field sampling. Soil and water samples often contain unknown bacterial...

visualizing soil microorganisms via the contact slide assay and microscopy

visualizing-soil-microorganisms-via-contact-slide-assay

Soil Life, Microbes, and the Rhizosphere

Soil is the thin layer at Earth’s surface that supports life. It contains both abiotic factors, which are nonliving parts, and biotic factors, which are living or once-living parts. The abiotic portion includes inorganic particles of different sizes and shapes that help determine soil texture. The biotic portion of soil includes plant residues, roots, organic matter, and microorganisms. Soil is especially rich in microbes. One gram of soil can contain large numbers of bacteria, actinomycetes,...

filamentous fungi

Fungi in Soil and Nutrient Cycling

Fungi are heterotrophic eukaryotic organisms that play an important role in soil. With the exception of yeasts, they are aerobic, which means they use oxygen. They are abundant in surface soils and help break down organic matter and some organic contaminants. These organisms also support nutrient cycling in the environment. White rot fungi, such as Phanerochaete chrysosporium, are a well-known example. They can degrade aromatics, which are ring-shaped organic compounds found in many materials.

community dna extraction from bacterial colonies

Community DNA from soil helps scientists study microbial communities without relying only on culture tests. Traditional methods use dilution and plating on selective or differential media, or they use direct count assays. Direct counts show the total number of bacteria present, but they do not show how many populations are in the community or how diverse those populations are. Plate counts can measure total culturable bacteria or selected culturable groups. That makes them useful for comparing...

detecting environmental microorganisms with the polymerase chain reaction and gel electrophoresis

detecting-environmental-microorganisms-with-polymerase-chain-reaction

PCR for Tracking Microbes in Soil and Water

PCR is used to track microorganisms in soil, water, and air samples by detecting their DNA. The technique copies a specific DNA segment, which helps identify target microbes at the species, strain, and serovar or pathovar level. It can also help describe whole microbial communities in a sample. Culture-based methods are still used to detect microorganisms in environmental samples. These methods grow microbes on special media in the lab. They are useful, but they can miss microbes that are...

rna analysis of environmental samples using rt-pcr

rna-analysis-of-environmental-samples-using-rt-pcr

RT-PCR for Detecting RNA in Samples

RT-PCR is used to detect RNA in environmental samples by first converting RNA into DNA. It follows the same temperature-cycling steps as conventional PCR, but it begins with ribonucleic acid (RNA) instead of deoxyribonucleic acid (DNA). The RNA is turned into complementary DNA, or cDNA, so DNA-based tools can be used to study it. This method is important for finding RNA-based organisms in soil, water, and agricultural samples. Many viruses in the environment use RNA as their genetic material.

quantifying environmental microorganisms and viruses using qpcr

quantifying-environmental-microorganisms-and-viruses-using-qpcr

qPCR for Detecting Waterborne Viruses

Quantitative polymerase chain reaction (qPCR), also called real-time PCR, is a molecular method used to measure microorganisms in environmental samples. It helps researchers estimate how much microbial material is present, including disease-causing pathogens. This makes qPCR useful in environmental microbiology when samples need accurate counts. Before qPCR, scientists mainly relied on culture-based methods to quantify microbes. Those methods can be difficult to use with environmental samples.

water quality analysis via indicator organisms

water-quality-analysis-via-indicator-organisms

Indicator Organisms for Safe Water Testing

Water quality analysis can use indicator organisms to check for contamination in a fast and practical way. It helps monitor pollutants, nutrients, pathogens, and other substances that can affect water as a resource. When water is affected by human activity, its integrity can change. Fecal contamination is especially important because it can introduce microbial pathogens. These pathogens can threaten plant, animal, and human health and lead to disease or illness. As water demand increases and...

isolation of fecal bacteria from water samples by filtration

isolation-of-fecal-bacteria-from-water-samples-by-filtration

Coliform Testing in Water Safety Monitoring

Coliform testing helps monitor water safety in agricultural, recreational, and domestic settings. It is used because contaminated water can spread waterborne disease to people and animals. The microorganisms linked to these outbreaks include parasites, bacteria, and viruses. They are shed in high numbers in the feces of infected hosts. Infection can then spread by the fecal-oral route when a person ingests contaminated water. Testing every possible pathogen in water is not practical or...

detection of bacteriophages in environmental samples

detection-of-bacteriophages-in-environmental-samples

Bacteriophages and Coliphages in Wastewater

Bacteriophages are viruses that infect bacteria, and coliphages are the ones that infect coliform bacteria. These viruses can be found wherever coliform bacteria are present. The page focuses on how these phages relate to environmental samples, especially domestic wastewater. Viruses are a special group of biological entities that can infect both eukaryotic and prokaryotic organisms. They are obligate parasites, which means they must use a host cell to make more virus particles. They have no...

culturing and enumerating bacteria from soil samples

culturing-and-enumerating-bacteria-from-soil-samples

Soil Bacteria and Actinomycete Plating

Soil bacteria can be counted and grown using dilution and plating methods. Surface soils contain inorganic and organic particles that form secondary aggregates. The spaces between these aggregates hold air and water. That mix creates a good habitat for bacteria, and soil often contains more than 1 million bacteria per gram. Bacteria are the simplest microorganisms and are known as prokaryotes. A special group within this group is the actinomycetes. Actinomycetes are bacteria with a filamentous...

bacterial growth curve analysis and its environmental applications

bacterial-growth-curve-analysis-and-its-environmental-applications

Tracking Bacterial Growth in Pure Culture

Bacterial growth in pure culture shows how one species increases under controlled laboratory conditions. Pure culture means that only one type of bacterium is being studied. Because bacteria grow quickly, their cell numbers can rise sharply in a short time. Scientists measure how the bacterial population changes over time to create a growth curve. This curve helps show the rate of growth for the isolate being tested. It is a useful way to study bacteria in the lab instead of mixing many...

algae enumeration via culturable methodology

algae-enumeration-via-culturable-methodology

Counting Algae in Soil and Water Samples

Algae can be counted in soil and water samples using a culture-based most probable number (MPN) method. These microorganisms share one key trait: they contain photosynthetic pigments. The method helps measure algae that may grow in swimming pools, surface waters, and soils. Algae can create problems in lakes and reservoirs when blooms release toxins. They are also important in biofuel research because some species are being explored as energy sources. Blue-green algae are actually bacteria...

environmental microbiology

This collection provides an introduction to microbial communities in the environment and their roles in ecosystems; and also explores common methods used to study environmental microbiology. 

Learn how soil community DNA, direct counts, and plate counts help scientists study microbial diversity and genetic potential beyond culture methods.

Soil Microbe Study Using Community DNA | JoVE K12

new-york-state-science-learning-standards

New York State Science Learning Standards

High School

Physical Science

HS. Waves and Electromagnetic Radiation

HS-PS4-5.

Life Science

Structure and Function

HS-LS1-1.

matter-and-energy-in-organisms-and-ecosystems

Matter and Energy in Organisms and Ecosystems

HS-LS1-6.

Inheritance and Variation of Traits

HS-LS3-1.

Ian Pepper

Overview

Principles of Bacterial Community DNA Extraction

Bacterial Community DNA Extraction

Applications

Summary

Introduction to Virus

Viruses are unique biological entities that blur the boundary between living and non-living systems. Although they lack cellular structure and metabolic ...

Size and Structure of Viral Genomes

Viral genomes exhibit remarkable diversity in size, structure, and composition, influencing their replication strategies and interactions with host cells. ...

Viral Replication: Lytic Cycle

Bacteriophages, or phages, are viruses that specifically infect bacteria. Among them, T-even bacteriophages, such as T4, exhibit a well-characterized ...

Viral Replication: Lysogenic Cycle

The lysogenic cycle is a crucial viral replication strategy that allows bacteriophages to persist within host cells without immediately destroying them. ...

DNA Bacteriophages

Bacteriophages, or phages, are viruses that specifically infect bacteria, utilizing their genetic material to hijack host cellular machinery for ...

Viruses of Archaea

Archaeal viruses play a crucial role in the ecosystems of extremophilic archaea, particularly those belonging to the phyla Euryarchaeota and ...

Viruses with RNA Genomes

RNA viruses are categorized into positive-strand, negative-strand, or double-stranded groups based on their genomic structure and replication mechanisms. ...

the-antiviral-system-of-bacteria-and-archaea-crispr

The Antiviral System of Bacteria and Archaea: CRISPR

CRISPR stands for Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats is a adaptive immune system found in bacteria and archaea that protects ...

CRISPR/Cas9 Genome Editing

The CRISPR-Cas system serves as a bacterial defense mechanism against invading genetic elements such as viruses and plasmids, forming the foundation for ...

Subviral Agents

Subviral agents are infectious entities that resemble viruses but lack one or more viral components, such as a capsid or essential replication machinery. ...

The student will investigate and understand that bacteria and viruses have an effect on living systems. Key ideas include  viruses depend on a host for metabolic processes;

BIO.4.a

Binary Fission

Binary fission is the primary mode of asexual reproduction in prokaryotes, such as bacteria. It results in the production of two genetically identical ...

Generation Time

Bacterial generation time, the period required for a bacterial population to double during its exponential growth phase, serves as a critical measure of ...

Bacterial Growth Curve

The bacterial growth curve is a fundamental concept in microbiology that describes the dynamics of bacterial population growth in a closed system with ...

microbial-growth-measurement-direct-methods

Microbial Growth Measurement: Direct Methods

Direct methods for measuring microbial populations in a culture are essential tools in microbiology, providing quantitative data for various applications. ...

microbial-growth-measurement-indirect-methods

Microbial Growth Measurement: Indirect Methods

Estimating microbial growth is essential for understanding population dynamics and environmental adaptations. Indirect methods provide valuable insights ...

Microbial Growth Media

Microbial growth media are essential tools in microbiology, providing the nutrients and conditions necessary to cultivate and study microorganisms. These ...

Need for Obtaining Pure Cultures

Pure cultures, defined as the growth of a single microorganism species isolated from mixed populations, are fundamental tools in microbiological research ...

techniques-for-isolation-of-pure-cultures

Techniques for Isolation of Pure Cultures

Microorganisms are routinely cultured in the laboratory using various techniques to isolate, grow, and quantify them for further study. These methods rely ...

Factors Influencing Microbial Growth: pH

Microorganisms are classified as acidophiles, neutrophiles, or alkaliphiles based on their pH growth preferences, reflecting their adaptations to specific ...

factors-influencing-microbial-growth-temperature

Factors Influencing Microbial Growth: Temperature

Microorganisms display remarkable adaptations, enabling them to thrive in diverse ecological niches across a wide range of temperatures. Temperature ...

factors-influencing-microbial-growth-osmolarity

Factors Influencing Microbial Growth: Osmolarity

Osmolarity is the measure of solute concentration in a solution. It plays a critical role in determining water availability for organisms. Water moves ...

Oxygen Requirements and Growth Patterns

Microorganisms exhibit diverse oxygen requirements and growth patterns driven by their metabolic strategies and environmental adaptations. Oxygen, while ...

Biofilms

Biofilms are complex communities of microorganisms encased in a self-produced extracellular polysaccharide matrix attached to surfaces. These microbial ...

The student will investigate and understand that bacteria and viruses have an effect on living systems. Key ideas include the modes of reproduction/replication can be compared

BIO.4.b

Prokaryotic vs. Eukaryotic Cells

Prokaryotic and eukaryotic cells represent two fundamental types of cellular organization, differing significantly in structure, complexity, and function. ...

Microbial Morphologies 

Bacterial and archaeal cells exhibit remarkable diversity in shape and structure, critical in their adaptability and functionality. Among bacteria, the ...

Bacterial Cell Wall 

The bacterial cell wall is an essential structural component that encases the plasma membrane, preserving cellular integrity, determining shape, and ...

Archaeal Cell Wall

Archaeal cell walls are structurally and compositionally distinct from their bacterial counterparts, lacking the characteristic peptidoglycan layer found ...

Peptidoglycan Synthesis

Structure of PeptidoglycanPeptidoglycan is a vital structural component of the bacterial cell wall, providing mechanical strength and shape to the cell. ...

Plasma Membrane in Bacteria and Archaea

The plasma membrane is an essential cellular structure responsible for maintaining cellular integrity and regulating the selective transport of molecules. ...

Outer Layers of the Cell Envelope

The outermost layers of prokaryotic cells play a critical role in their survival, virulence, and interaction with the environment. These layers, often ...

Flagella and Motility in Bacteria

Flagella are specialized, thread-like structures that extend from a bacteria's cell envelope. They play a crucial role in motility and chemotaxis. Their ...

Fimbriae, Pili, and Axial Filaments

Fimbriae and pili are specialized bacterial surface structures that play pivotal roles in adhesion, genetic exchange, and motility. Composed primarily of ...

Cell Inclusions

Prokaryotic cells possess a variety of inclusions that play crucial roles in nutrient storage, metabolic processes, and environmental adaptation. These ...

Endospores and Sporulation

Endospores are specialized, dormant cells primarily formed by Gram-positive bacteria, including Bacillus and Clostridium, enabling survival under extreme ...

Nucleoid

The nucleoid represents a structurally and functionally distinct region within prokaryotic cells, where the cell's DNA and associated proteins are housed. ...

Surface Appendages of Archaea

Archaeal surface appendages are highly specialized structures essential for environmental adaptation, encompassing roles in adhesion, biofilm formation, ...

The student will investigate and understand that bacteria and viruses have an effect on living systems. Key ideas include  the structures and functions can be compared

BIO.4.c

Types of Microorganisms

Microorganisms are a diverse group of microscopic entities broadly categorized into cellular and acellular types based on their structural organization. ...

environmental-applications-of-microorganisms

Environmental Applications of Microorganisms

Microorganisms play a pivotal role in maintaining ecosystem balance by recycling essential elements such as carbon, nitrogen, and phosphorus, as well as ...

Detecting Environmental Microorganisms with the Polymerase Chain Reaction and Gel Electrophoresis

Source: Laboratories of Dr. Ian Pepper and Dr. Charles Gerba - Arizona University
Demonstrating Author: Bradley Schmitz
Polymerase chain reaction (PCR) is ...

RNA Analysis of Environmental Samples Using RT-PCR

Source: Laboratories of Dr. Ian Pepper and Dr. Charles Gerba - The University of Arizona
Demonstrating Author: Bradley Schmitz
Reverse ...

Quantifying Environmental Microorganisms and Viruses Using qPCR

Source: Laboratories of Dr. Ian Pepper and Dr. Charles Gerba - The University of Arizona
Demonstrating Author: Bradley Schmitz
Quantitative polymerase ...

Water Quality Analysis via Indicator Organisms

Source: Laboratories of Dr. Ian Pepper and Dr. Charles Gerba -The University of Arizona
Demonstrating Author: Luisa Ikner
Water quality analysis monitors ...

The student will investigate and understand that bacteria and viruses have an effect on living systems. Key ideas include  bacteria and viruses have a role in other organisms and the environment; and

Soil Microbe Study Using Community DNA

Description

Transcript

Tags

More videos by Standards