Name: protein purification with sec and imac
Uploaded: 2023-04-30T06:30:54.000Z
Duration: 7 min 51 s
Channel: JoVE

K12 Standards

new-york-state-science-learning-standards

New York State Science Learning Standards

High School

Life Science

matter-and-energy-in-organisms-and-ecosystems

Matter and Energy in Organisms and Ecosystems

HS-LS1-6.

chromatography-based-biomolecule-purification-methods

Chromatography-based Biomolecule Purification Methods

في الكيمياء الحيوية ، يتم استخدام طرق التنقية القائمة على الكروماتوغرافيا لعزل المركبات من خليط معقد. هناك طريقتان يستخدمان عادة من قبل علماء الكيمياء الحيوية هما كروماتوغرافيا استبعاد الحجم وكروماتوغرافيا التقارب. في كروماتوغرافيا استبعاد الحجم ، يفصل العمود المليء بالخرز المسامي مكونات الخليط بناء على الحجم. من ناحية أخرى ، يسمح كروماتوغرافيا التقارب بفصل أكثر تحديدا للجزيئات الحيوية باستخدام عمود يتكون من مرحلة ثابتة تحتوي على روابط خاصة بالهدف. 
يعد هذا الفيديو بمثابة مقدمة لاستبعاد الحجم وكروماتوغرافيا التقارب ، بالإضافة إلى المفاهيم التي تحكمها. يتم وصف إجراء خطوة بخطوة لتنقية البروتين الموسوم بالهيستيدين عن طريق كروماتوغرافيا تقارب المعادن المجمدة. كما يتم تحديد تطبيقات كل من هذه الطريقتين الكروماتوغرافيات في الكيمياء الحيوية والبحوث الطبية الحيوية.

طرق تنقية الجزيئات الحيوية القائمة على الكروماتوغرافيا

في الكيمياء الحيوية ، يتم استخدام طرق التنقية القائمة على الكروماتوغرافيا لعزل المركبات من خليط معقد. هناك طريقتان يستخدمان عادة من قبل علماء الكيمياء الحيوية هما كروماتوغرافيا استبعاد الحجم وكروماتوغرافيا التقارب. في كروماتوغرافيا استبعاد الحجم ، يفصل العمود المليء بالخرز المسامي مكونات الخليط بناء على الحجم. من ناحية أخرى ، يسمح كروماتوغرافيا التقارب بفصل أكثر تحديدا للجزيئات الحيوية باستخدام عمود يتكون من مرحلة ثابتة تحتوي على روابط خاصة بالهدف. 
يعد هذا الفيديو بمثابة مقدمة لاستبعاد الحجم وكروماتوغرافيا التقارب ، بالإضافة إلى المفاهيم التي تحكمها. يتم وصف إجراء خطوة بخطوة لتنقية البروتين الموسوم بالهيستيدين عن طريق كروماتوغرافيا تقارب المعادن المجمدة. كما يتم تحديد تطبيقات كل من هذه الطريقتين الكروماتوغرافيات في الكيمياء الحيوية والبحوث الطبية الحيوية. 
<div class="chapter_text" id="script_0">
 "الكروماتوغرافيا" يشير إلى مجموعة واسعة من الطرق المستخدمة لعزل مكون من خليط معقد ، وهي خطوة أساسية قبل تحديد خصائص وأنشطة الجزيء الحيوي. كل تقنية كروماتوغرافية لها آلية مختلفة للفصل ، اعتمادا على مصفوفة العينة والمركب المستهدف. سيركز هذا الفيديو على مبادئ وتشغيل طريقتين شائعتين في الكيمياء الحيوية: استبعاد الحجم وكروماتوغرافيا التقارب. 
</div>
<div class="chapter_text" id="script_1">
يعتمد كروماتوغرافيا استبعاد الحجم أو SEC على حجم المركبات في العينة. تتم إضافة مرحلة متحركة تحتوي على العينة إلى عمود به مادة مسامية: المرحلة الثابتة. تنقسم الجزيئات الموجودة في العينة إلى 1 من 3 فئات. 
تقطع الجزيئات الكبيرة جدا لدخول المسام أقصر مسافة عبر العمود. أي نوع له وزن جزيئي أعلى من "حد الاستبعاد" سيخرج من العمود في نفس الوقت. سيتم الاحتفاظ بالجزيئات الصغيرة بما يكفي لدخول المسام بحرية لفترة أطول ، وستخرج من العمود معا. الوزن الجزيئي الذي يسمح بدخول المسام بالكامل هو "حد النفاذ". 
سيتم فصل الجزيئات بين هذه الحدود فقط عن بعضها البعض ، لأنها تقضي فترات متفاوتة من الوقت في الانتشار داخل وخارج المسام. يتم الاحتفاظ بالجزيئات الأصغر لفترة أطول على العمود لأنها تقضي وقتا أطول في المرحلة الثابتة ، بينما تخرج الجزيئات الأكبر داخل هذه الحدود في وقت مبكر. 
تقع الأوزان الجزيئية عبر 1 إلى 2 من حيث الحجم ضمن هذه الحدود. يتم اختيار الأعمدة مع وضع ذلك في الاعتبار ، أو يمكن استخدام أعمدة متعددة في سلسلة إذا كان هناك مجموعة واسعة من المركبات المرغوبة. 
الآن بعد أن رأيت نظرية SEC ، دعنا نلقي نظرة على كيفية تنفيذها. 
</div>
<div class="chapter_text" id="script_2">
لبدء إجراء SEC ، يجب أن يكون العمود متوازنا بالماء منزوع الأيونات والمخزن المؤقت للكروماتوغرافيا. بمجرد التحضير ، يتم حقن المخزن المؤقت الذي يحتوي على العينة على العمود. ثم يتم دفع المخزن المؤقت بمعدل تدفق منخفض. يراقب الكاشف ما يخرج من العمود لتحديد وجود المادة المراد تحليلها. تخرج الجزيئات الكبيرة ذات الأوزان الجزيئية فوق حد الاستبعاد من العمود في نفس الوقت. يتم جمع كسور صغيرة من العمود في أنابيب. يتم اختبار كل جزء لجودة الجزيء المستهدف عن طريق الرحلان الكهربائي الهلامي أو تقنيات تحليلية أخرى. 
</div>
<div class="chapter_text" id="script_3">
الآن دعونا نلقي نظرة على كروماتوغرافيا التقارب أو AC ، وهي واحدة من أكثر الطرق فعالية لتنقية البروتينات. ترتبط العديد من الجزيئات الحيوية بشكل انتقائي بروابط معينة - وهي خاصية يستخدمها AC عن طريق الالتصاق برابط خاص بالهدف بالمرحلة الثابتة. 
عندما يتدفق الخليط عبر العمود ، تلتصق الجزيئات المستهدفة بالترابط ، ويتدفق الباقي من خلاله. بعد مرور الخليط عبر العمود ، يمكن جمع الجزيء المستهدف من خلال إحدى طريقتي الشطف بناء على الخصوصية. 
يمكن القول أن الشطف الحيوي له "عادي" أو "دور عكسي". في الشطف الحيوي النوعي الطبيعي ، تتم إضافة عامل يتنافس مع الترابط الملتصق بالارتباط بالجزيء الحيوي المستهدف. 
في الشطف الحيوي ذو الدور العكسي ، يتنافس العامل مع الهدف للارتباط بالترابط الملتصق. النوع الثاني من الشطف ، غير محدد الشطف ، يقلل من الارتباط من الهدف إلى الترابط عن طريق تغيير درجة الحموضة أو القوة الأيونية أو القطبية. إذا لم يرتبط البروتين برابط يمكن تجميده ، فيمكن التعبير عن البروتين الذي يحتوي على "علامة": تسلسلات الببتيد القصيرة المصممة للارتباط بالرابط. 
أحد الأنواع هو كروماتوغرافيا تقارب أيون المعادن المجمدة ، "IMAC" باختصار ، حيث يرتبط الترابط المعدني الملتصق ، مثل النيكل أو الكوبالت ، ببقايا الهيستيدين على البروتين المعدل. من خلال تقنيات البيولوجيا الجزيئية ، يتم إنشاء البروتينات المستهدفة بتكرار بقايا الهيستيدين ، والتي تسمى علامة بولي هيستيدين ، والتي ترتبط بالمعدن عبر سلسلة جانب إيميدازول على الهيستيدين. بمجرد ربطه ، يمكن جمع البروتين باستخدام الإيميدازول الحر عن طريق شطف محدد للدور العكسي واستخدامه لاحقا في مجموعة متنوعة من التطبيقات النهائية. الآن بعد أن رأيت نظرية كروماتوغرافيا التقارب ، دعنا نلقي نظرة على إجراء IMAC في المختبر. 

</div>
<div class="chapter_text" id="script_4">
في IMAC ، يمكن إضافة المرحلة الثابتة مباشرة إلى خليط الطور المتحرك والعينة ، مما يسمح بربط البروتين الموسومة به. ثم يسكب هذا الملاط في العمود ، حيث تتساقط المركبات غير المرتبطة في النفايات ، بينما يبقى الملاط. يتم شطف حاوية الملاط لجمع الراتنج المتبقي والعينة ، والتي تضاف إلى العمود. 
يتم تقليب الراتنج لضمان تدفق المكونات غير المقيدة بحرية. يساعد المخزن المؤقت الإضافي للغسيل على طردهم بعيدا. بمجرد إزالة جميع المكونات غير المرتبطة ، يتم استبدال النفايات بوعاء لجمع البروتين المستهدف. 
يضاف المخزن المؤقت الذي يحتوي على إيميدازول ويقلب ويترك للراحة لفك ربط الجزيء المستهدف. يرتبط الإيميدازول بالمعدن ، ويحل محل البروتين الموسوم ويطلقه. يتم جمع البروتين المحرر ، ويتم تكرار خطوة الإيميدازول لضمان الجمع الكامل. لمزيد من تنقية العينة ، يمكن تشغيل SEC على العينة قبل التحليل. 
</div>
<div class="chapter_text" id="script_5">
والآن بعد أن رأينا نظرية وإجراءات هاتين التقنيتين، دعونا نلقي نظرة على بعض الطرق التي يتم بها تطبيقهما في المجال الكيميائي الحيوي. 
السبب الشائع لتنقية البروتينات هو دراسة دورها في المرض. يحدث التليف الكيسي بسبب عيوب في بروتين منظم التوصيل عبر الغشاء للتليف الكيسي أو CFTR. بعد زراعة البروتين بعلامته في الخميرة ، يسمح كل من كروماتوغرافيا التقارب واستبعاد الحجم بعزل البروتين ، متبوعا بدراسة وظيفته. 
في بعض الحالات ، يمكن أن يؤدي وجود علامة بولي هيستيدين إلى تغيير بنية البروتين ، مما يؤثر على وظيفته. علامة شائعة أخرى هي البروتين المرتبط بالمالتوز أو MBP ، والذي سيرتبط بالأميليوز المرتبط في عمود. ثم يتم استخدام المالتوز لتحرير المجمع. يمكن بعد ذلك شق MBP وإزالته باستخدام SEC لإنتاج البروتين النقي المطلوب. 
</div>
<div class="chapter_text" id="script_6">
لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول استبعاد الحجم وكروماتوغرافيا التقارب. غطت نظرية التقنيات ، وتناولت الإجراءات العامة ، وغطت بعض استخدامات التقنيات. 
شكرا للمشاهدة! 
</div>

In biochemistry, chromatography-based purification methods are employed to isolate compounds from a complex mixture. Two such methods used commonly by ...

"الكروماتوغرافيا" يشير إلى مجموعة واسعة من الطرق المستخدمة لعزل مكون من خليط معقد ، وهي خطوة أساسية قبل تحديد خصائص الجزيء الحيوي وأنشطته. كل تقنية كروماتوغرافية لها آلية مختلفة للفصل ، اعتمادا على مصفوفة العينة والمركب المستهدف. سيركز هذا الفيديو على مبادئ وتشغيل طريقتين شائعتين في الكيمياء الحيوية: استبعاد الحجم وكروماتوغرافيا التقارب. يعتمد كروماتوغرافيا استبعاد الحجم أو SEC على حجم المركبات في العينة. تتم إضافة مرحلة متحركة تحتوي على العينة إلى عمود به مادة مسامية: المرحلة الثابتة. تنقسم الجزيئات الموجودة في العينة إلى 1 من 3 فئات. تقطع الجزيئات الكبيرة جدا لدخول المسام أقصر مسافة عبر العمود. أي نوع له وزن جزيئي أعلى من "حد الاستبعاد" سيخرج من العمود في نفس الوقت. سيتم الاحتفاظ بالجزيئات الصغيرة بما يكفي لدخول المسام بحرية لفترة أطول ، وستخرج من العمود معا. الوزن الجزيئي الذي يسمح بدخول المسام بالكامل هو "حد النفاذ". سيتم فصل الجزيئات بين هذه الحدود فقط عن بعضها البعض ، لأنها تقضي فترات متفاوتة من الوقت في الانتشار داخل وخارج المسام. يتم الاحتفاظ بالجزيئات الأصغر لفترة أطول على العمود لأنها تقضي وقتا أطول في المرحلة الثابتة ، بينما تخرج الجزيئات الأكبر داخل هذه الحدود في وقت مبكر. تقع الأوزان الجزيئية عبر 1 إلى 2 من حيث الحجم ضمن هذه الحدود. يتم اختيار الأعمدة مع وضع ذلك في الاعتبار ، أو يمكن استخدام أعمدة متعددة في سلسلة إذا كان هناك مجموعة واسعة من المركبات المرغوبة. الآن بعد أن رأيت نظرية SEC ، دعنا نلقي نظرة على كيفية تنفيذها. لبدء إجراء SEC ، يجب أن يكون العمود متوازنا بالماء منزوع الأيونات والمخزن المؤقت للكروماتوغرافيا. بمجرد التحضير ، يتم حقن المخزن المؤقت الذي يحتوي على العينة على العمود. ثم يتم دفع المخزن المؤقت بمعدل تدفق منخفض. يراقب الكاشف ما يخرج من العمود لتحديد وجود المادة المراد تحليلها. تخرج الجزيئات الكبيرة ذات الأوزان الجزيئية فوق حد الاستبعاد من العمود في نفس الوقت. يتم جمع كسور صغيرة من العمود في أنابيب. يتم اختبار كل جزء لجودة الجزيء المستهدف عن طريق الرحلان الكهربائي الهلامي أو تقنيات تحليلية أخرى. الآن دعونا نلقي نظرة على كروماتوغرافيا التقارب أو AC ، وهي واحدة من أكثر الطرق فعالية لتنقية البروتينات. ترتبط العديد من الجزيئات الحيوية بشكل انتقائي بروابط معينة - وهي خاصية يستخدمها AC عن طريق الالتصاق برابط خاص بالهدف بالمرحلة الثابتة. عندما يتدفق الخليط عبر العمود ، تلتصق الجزيئات المستهدفة بالترابط ، ويتدفق الباقي من خلاله. بعد مرور الخليط عبر العمود ، يمكن جمع الجزيء المستهدف من خلال إحدى طريقتي الشطف بناء على الخصوصية. يمكن القول أن الخصائص الحيوية لها "دور طبيعي" أو "عكسي". في الشطف الحيوي النوعي الطبيعي ، تتم إضافة عامل يتنافس مع الترابط الملتصق بالارتباط بالجزيء الحيوي المستهدف. في الشطف الحيوي ذو الدور العكسي ، يتنافس العامل مع الهدف للارتباط بالترابط الملتصق. يقلل نوع الشطف الثاني ، الشطف غير المحدد ، من الارتباط من الهدف إلى الترابط عن طريق تغيير درجة الحموضة أو القوة الأيونية أو القطبية. إذا لم يرتبط البروتين برابط يمكن تجميده ، فيمكن التعبير عن البروتين الذي يحتوي على "علامة": تسلسلات الببتيد القصيرة المصممة للارتباط بالرابط. أحد الأنواع هو كروماتوغرافيا تقارب أيون المعادن المجمدة ، "IMAC" باختصار ، حيث يرتبط الترابط المعدني الملتصق ، مثل النيكل أو الكوبالت ، ببقايا الهيستيدين على البروتين المعدل. من خلال تقنيات البيولوجيا الجزيئية ، يتم إنشاء البروتينات المستهدفة بتكرار بقايا الهيستيدين ، والتي تسمى علامة بولي هيستيدين ، والتي ترتبط بالمعدن عبر سلسلة جانب إيميدازول على الهيستيدين. بمجرد ربطه ، يمكن جمع البروتين باستخدام إيميدازول حر عن طريق شطف محدد للدور العكسي واستخدامه لاحقا في مجموعة متنوعة من التطبيقات النهائية. الآن بعد أن رأيت نظرية كروماتوغرافيا التقارب ، دعنا نلقي نظرة على إجراء IMAC في المختبر. في IMAC ، يمكن إضافة المرحلة الثابتة مباشرة إلى خليط الطور المتحرك والعينة ، مما يسمح بربط البروتين الموسومة به. ثم يسكب هذا الملاط في العمود ، حيث تتساقط المركبات غير المرتبطة في النفايات ، بينما يبقى الملاط. يتم شطف حاوية الملاط لجمع الراتنج المتبقي والعينة ، والتي تضاف إلى العمود. يتم تقليب الراتنج لضمان تدفق المكونات غير المقيدة بحرية. يساعد المخزن المؤقت الإضافي للغسيل على طردهم بعيدا. بمجرد إزالة جميع المكونات غير المرتبطة ، يتم استبدال النفايات بوعاء لجمع البروتين المستهدف. يضاف المخزن المؤقت الذي يحتوي على إيميدازول ويقلب ويترك للراحة لفك ربط الجزيء المستهدف. يرتبط الإيميدازول بالمعدن ، ويحل محل البروتين الموسوم ويطلقه. يتم جمع البروتين المحرر ، ويتم تكرار خطوة الإيميدازول لضمان الجمع الكامل. لمزيد من تنقية العينة ، يمكن تشغيل SEC على العينة قبل التحليل. والآن بعد أن رأينا نظرية وإجراءات هاتين التقنيتين، دعونا نلقي نظرة على بعض الطرق التي يتم بها تطبيقهما في المجال الكيميائي الحيوي. السبب الشائع لتنقية البروتينات هو دراسة دورها في المرض. يحدث التليف الكيسي بسبب عيوب في بروتين منظم التوصيل عبر الغشاء للتليف الكيسي أو CFTR. بعد زراعة البروتين بعلامته في الخميرة ، يسمح كل من كروماتوغرافيا التقارب واستبعاد الحجم بعزل البروتين ، متبوعا بدراسة وظيفته. في بعض الحالات ، يمكن أن يؤدي وجود علامة بولي هيستيدين إلى تغيير بنية البروتين ، مما يؤثر على وظيفته. علامة شائعة أخرى هي البروتين المرتبط بالمالتوز أو MBP ، والذي سيرتبط بالأميليوز المرتبط في عمود. ثم يتم استخدام المالتوز لتحرير المجمع. يمكن بعد ذلك شق MBP وإزالته باستخدام SEC لإنتاج البروتين النقي المطلوب. لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول استبعاد الحجم وكروماتوغرافيا التقارب. غطت نظرية التقنيات ، وتناولت الإجراءات العامة ، وغطت بعض استخدامات التقنيات. شكرا للمشاهدة!

Education

JoVE Science Education

Chemistry

الكيمياء

Biochemistry

الكيمياء الحيوية

protein purification with sec and imac

Protein purification with size-exclusion chromatography and affinity chromatography helps isolate biomolecules from complex mixtures. These methods are common in biochemistry because purified samples are needed before a biomolecule’s properties and activity can be studied. The video focuses on the principles behind size-exclusion chromatography, affinity chromatography, and immobilized metal affinity chromatography, or IMAC.

Size-exclusion chromatography, or SEC, separates molecules by size. A sample moves through a column packed with porous beads, which make up the stationary phase. Large molecules that cannot enter the pores travel the shortest path and leave first. Smaller molecules enter the pores, spend more time in the column, and leave later. Molecules between the exclusion limit and the permeation limit can be separated from each other, while molecules above or below those limits exit together.

The SEC procedure begins with equilibration of the column using deionized water and chromatography buffer. Sample-containing buffer is then injected, and the liquid is pushed through at a low flow rate. A detector watches what comes out of the column, and fractions are collected in tubes. These fractions can then be checked for the target molecule by gel electrophoresis or other analytical methods.

Affinity chromatography, or AC, uses the fact that many biomolecules bind selectively to certain ligands. In this method, a target-specific ligand is attached to the stationary phase. As the mixture passes through the column, the target binds to the ligand while the rest flows through. The target can then be released by biospecific elution, which may use a competing agent in normal-role or reverse-role form, or by nonspecific elution, which changes pH, ionic strength, or polarity.

If a protein does not naturally bind to an immobilized ligand, it can be engineered with a tag. A common example is a polyhistidine tag, or his-tag. In immobilized metal ion affinity chromatography, nickel or cobalt on the column binds to histidine residues through the imidazole side chain. The tagged protein is then released with free imidazole by reverse-role specific elution and can be used in downstream applications.

The IMAC procedure begins by mixing the stationary phase with the sample so the his-tagged protein can bind. The slurry is poured into the column, and unbound material drains to waste. The resin is rinsed into the column, stirred, and washed to remove leftover unbound components. After that, a container is placed to collect the target protein, and imidazole buffer is added to release it. The imidazole binds the metal, displaces the tagged protein, and the collected step may be repeated to improve recovery. For further cleanup, SEC can be run before analysis.

These purification methods are useful in biochemical and biomedical research. One example is cystic fibrosis research, where the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein, or CFTR, is grown with a his-tag in yeast and then isolated with affinity and size-exclusion chromatography. In some cases, a polyhistidine tag can change protein structure and affect function. Another tag used in protein work is maltose-binding protein, or MBP, which binds amylose in a column and is released with maltose. The MBP can then be cleaved and removed with SEC to produce the desired pure protein.

Protein Purification with SEC and IMAC

dialysis: diffusion based separation

Dialysis for Buffer Exchange in Biochemistry

Dialysis is a common biochemistry technique for buffer exchange and desalting. It separates molecules by diffusion through a semipermeable membrane, which lets small molecules pass while holding larger biomolecules inside the sample. The membrane is the key part of the setup. Its pores create a molecular weight cutoff, so a membrane such as a 10 kDa membrane usually keeps molecules larger than 10 kilodaltons inside. This cutoff is not exact, because membranes have a range of pore sizes.

enzyme assays and kinetics

Measuring Enzyme Reaction Rates

Enzyme reaction rates can be measured with assays that track how substrate or product levels change over time. Enzymes are proteins, or sometimes RNAs, that speed up chemical reactions by lowering the activation energy needed to start them. They act on a specific substrate and help form a product that supports life processes. Enzymatic reactions are often described in three steps. First, the substrate binds to the enzyme active site and forms an enzyme-substrate complex. That complex can fall...

maldi-tof mass spectrometry

How MALDI-TOF Reads Biomolecules

MALDI-TOF mass spectrometry reads biomolecules by using a laser, a matrix, and a time-of-flight analyzer. MALDI, or matrix-assisted laser desorption ionization, helps fragile molecules keep their structure while they are moved into the mass analyzer. The analyzer then separates compounds based on size and charge. In MALDI, the sample is mixed into a matrix, usually an organic compound with aromatic and conjugated double bonds. A laser pulse strikes the spot, and the matrix absorbs most of the...

tandem mass spectrometry

Tandem Mass Spectrometry for Biomolecule Analysis

Tandem mass spectrometry is used to isolate a biomolecule and break it into smaller pieces so its makeup can be studied. Because biomolecules often have large, complex structures, it can be hard to identify their molecular composition and sequence from a single measurement. By linking mass spectrometers in series, the technique first selects one ion and then analyzes the fragments it produces. The process starts with an ion source that converts the sample into ions. A mass analyzer then...

protein crystallization

Protein Crystals for Structure Analysis

Protein crystals help scientists study protein structure and function. A crystal is a solid lattice made from purified protein molecules. These crystals are useful in structural biology because they reveal details that methods like mass spectrometry and SDS-PAGE cannot show on their own. Protein crystallization is paired with recombinant protein expression and x-ray diffraction to support this work. The process starts with a large amount of very pure protein. Researchers often make that...

chromatography-based biomolecule purification methods

Protein purification with size-exclusion chromatography and affinity chromatography helps isolate biomolecules from complex mixtures. These methods are common in biochemistry because purified samples are needed before a biomolecule’s properties and activity can be studied. The video focuses on the principles behind size-exclusion chromatography, affinity chromatography, and immobilized metal affinity chromatography, or IMAC. Size-exclusion chromatography, or SEC, separates molecules by size. A...

two-dimensional gel electrophoresis

Protein Mapping with 2D Gel Electrophoresis

Protein mapping with 2D gel electrophoresis separates complex protein mixtures across two steps. The method combines isoelectric focusing, or IEF, with sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, or SDS-PAGE. Together, these methods can resolve thousands of biomolecules from a single sample by their isoelectric point and molecular weight. The first dimension is IEF. Each protein has an isoelectric point, or pI, which is the pH where its net charge is zero. Proteins are loaded...

metabolic labeling

Tracking Cell Chemistry with Metabolic Labels

Metabolic labeling tracks cell chemistry by using chemical analogs that cells take up and build into biomolecules. These labels help scientists follow biochemical changes and modifications inside cells. The labeled products can then be studied with tools such as SDS-PAGE and NMR to learn more about metabolic pathways. Several labeling strategies are shown here. Isotopic labeling uses analogs that match the natural molecule but contain uncommon isotopes, such as carbon-13 and nitrogen-15 in an...

electrophoretic mobility shift assay (emsa)

electrophoretic-mobility-shift-assay-emsa

Detecting Protein-DNA Binding by EMSA

Electrophoretic mobility shift assay, or EMSA, is a biochemical method used to detect binding between proteins and nucleic acids. It is also called a gel shift assay. The test compares how a labeled nucleic acid moves through a gel before and after it binds a protein. EMSA is used to see whether a specific protein binds to a specific nucleic acid. First, the nucleic acid is labeled to make a probe. The transcript describes radioactive phosphorus-32 as a common label. The probe is then mixed...

photometric protein determination

Measuring Protein Concentration with Absorbance

Measuring protein concentration with absorbance is a key step in many biochemical assays. Photometric methods use the fact that samples with more light-absorbing material transmit less light. Because concentration and absorption are directly related, this makes it possible to measure an unknown sample. The core idea comes from the Beer-Lambert Law. This law states that the concentration of a light-absorbing species is proportional to its absorbance. The video also introduces the Bradford assay...

density gradient ultracentrifugation

Sucrose Gradient Separation in an Ultracentrifuge

Sucrose gradient separation in an ultracentrifuge is a lab method for isolating cell parts and biomolecules. It uses differences in density to make particles sink or rise in a liquid. A high-speed ultracentrifuge speeds up this process so components can be separated without destroying them. The basic idea starts with a suspension, which is particles mixed in a liquid solvent. Particles that are denser than the solvent sediment, while less dense particles float. A rotor inside the...

co-immunoprecipitation and pull-down assays

co-immunoprecipitation-and-pull-down-assays

Protein Interaction Capture Methods in Cells

Co-immunoprecipitation and pull-down assays are laboratory methods used to capture stable protein-protein interactions. Protein-protein interactions help control many biological functions, but many of them have not yet been identified. These assays are related to immunoprecipitation, which isolates a target protein from a mixed sample using an antibody. In co-immunoprecipitation, or CoIP, an antibody binds the target protein, and that protein is already attached to another protein that the...

reconstitution of membrane proteins

Membrane Proteins in Liposome Models

Membrane proteins can be moved into liposome models so their function can be studied outside a cell. Reconstitution means restoring an isolated biomolecule to a working form. For membrane proteins, that usually means placing a purified protein into an artificial lipid membrane. Cell membranes are made mainly of phospholipids and membrane proteins. The phospholipids form a bilayer with hydrophilic phosphate heads facing water and hydrophobic fatty acid tails facing inward. Some membrane...

f&#246;rster resonance energy transfer (fret)

FRET as a Molecular Ruler in Cells

Föster resonance energy transfer, or FRET, is a way to study close-range biochemical interactions using light-emitting molecules. A donor fluorophore can pass energy to an acceptor fluorophore when their emission and absorption spectra overlap. This transfer happens only when the pair is very close together, usually within 10 nm. Because FRET depends on distance, it is often called a molecular or spectroscopic ruler. The strength of the signal is measured as FRET efficiency, which describes...

surface plasmon resonance (spr)

SPR Biosensors for Tracking Binding Kinetics

Surface plasmon resonance, or SPR, is a way to track biomolecular binding on a label-free biosensor. It is used to measure molecular affinity, kinetics, specificity, and concentration. The method works with a thin metal layer on a prism, where changes in reflected light reveal interactions in real time. SPR sensors use a thin layer of a noble metal on the face of a prism. Light is reflected from the prism-metal interface into a photodetector. At one specific angle, called the surface plasmon...

biochemistry

This collection presents commonly used purification methods, such as affinity chromatography, as well as analytical methods, like MALDI-TOF. In addition, the videos showcase methods for assessing biomolecule interaction and function, such as co-immunoprecipitation and metabolic labeling.

Explore how size-exclusion chromatography and IMAC separate proteins by size or binding, and see how tagged proteins are purified for research.

Protein Purification with SEC and IMAC | JoVE K12

Overview

Size-Exclusion Chromatography

Operation of Size-Exclusion Chromatography

Affinity Chromatography

Operation of Affinity Chromatography

Applications

Summary

What is Photosynthesis?

Photosynthesis is a multipart, biochemical process that occurs in plants as well as in some bacteria. It captures carbon dioxide and solar energy to ...

Light as Energy

The energy required to carry out photosynthesis is light&#8212; typically electromagnetic radiation from the sun. The range of all possible wavelengths is ...

Anatomy of Chloroplasts

Green algae and plants, including green stems and unripe fruit, harbor chloroplasts&mdash;the vital organelles where photosynthesis takes place. In ...

Photosystem II

The multi-protein complex photosystem II (PS II) harvests photons and transfers their energy through its bound pigments to its reaction center, and ...

Photosystem I

Although structurally similar to photosystem II (PSII), photosystem I (PSI) is has a different electron supplier and electron acceptor.
Both these ...

The Calvin Cycle

Overview

Oxygenic photosynthesis converts approximately 200 billion tons of carbon dioxide (CO2) annually to organic compounds and produces approximately ...

C4 Pathway and CAM

Most plants use the C3 pathway for carbon fixation. However, some plants, such as sugar cane, corn, and cacti that grow in hot conditions, use alternative ...

the-z-scheme-of-electron-transport-in-photosynthesis

The Z-Scheme of Electron Transport in Photosynthesis

The light reactions of photosynthesis assume a linear flow of electrons from water to NADP+. During this process, light energy drives the splitting of ...

Photosynthesis

Autotrophs

Almost all living organisms on Earth depend on photosynthesis, which is the process that converts sunlight energy into a simple sugar called ...

Plant Pigment Chromatography and Floating Leaf Discs in a Vacuum
ExpandOn the day before the experiment, fill a container with water.
Place the spinach ...

Plant Pigment Chromatography
ExpandNOTE: In this experiment you will separate pigments from spinach leaves using chromatography paper. Individual pigments ...

First Law of Thermodynamics

The First Law of Thermodynamics states that energy cannot be created or destroyed, only transformed. This can be demonstrated within a classic food web ...

Photosystems

Photosystems are multiprotein complexes that form the functional units of photosynthesis in plants, algae, and cyanobacteria. They are found embedded in ...

An Introduction to Cell Metabolism

In cells, critical molecules are either built by joining together individual units like amino acids or nucleotides, or broken down into smaller ...

Reconstitution of Membrane Proteins

Reconstitution is the process of returning an isolated biomolecule to its original form or function. This is particularly useful for studying membrane ...

Use a model to illustrate how photosynthesis transforms light energy into stored chemical energy.

HS-LS1-5.

Macromolecules

Biomolecules
Organisms contain a wide variety of organic molecules with numerous functions which depend on the chemical structures and properties of these ...

Solution Preparation
ExpandCAUTION: It is important to always use care when handling reagents. For example, iodine will stain clothes and skin so wear ...

Identifying Macromolecules with Indicator Solutions
ExpandHYPOTHESES: In this activity, the experimental hypothesis might be that the addition of an ...

Introduction to Carbohydrates

Carbohydrates, proteins, and fats are the primary macronutrients in the human diet. However, carbohydrates are the most favored source of energy in the ...

Carbohydrate Metabolism

Sugars as Energy Storage Molecules

Chemistry of Carbohydrates

Carbohydrates are an essential part of the diet in humans and animals. Grains, fruits, and vegetables are natural sources of carbohydrates that provide ...

Oligosaccharide Assembly

Protein glycosylation starts in the ER lumen and continues in the Golgi apparatus. Glycosyltransferases catalyze the addition of sugar molecules or ...

What are Lipids?

lipid-derived-compounds-in-the-human-body

Lipid-derived Compounds in the Human Body

Fats and lipids are crucial components in the human body. Some lipid-derived compounds, such as fat-soluble vitamins, eicosanoids, lipoproteins, and ...

Fats as Energy Storage Molecules

Structure of Lipids

Lipids include a diverse group of compounds that are largely nonpolar in nature. This is because they are hydrocarbons that include mostly nonpolar ...

Proteins and Amino Acids

Overview

Proteins are chains of amino acids that are connected by peptide bonds and folded into a 3-dimensional structure. The side chains of individual ...

Amino acids

Amino acids are the monomers that comprise proteins. Each amino acid has the same fundamental structure, which consists of a central carbon atom, or the ...

Peptide Bonds

A peptide bond covalently attaches amino acids through a dehydration reaction. One amino acid&#39;s carboxyl group and another amino acid&#39;s amino ...

Nucleic Acids and Nucleotides

Nucleic acids are the most important macromolecules for the continuity of life. They carry the cell&#39;s genetic blueprint and have instructions for its ...

Nucleic Acid Structure

The pentose sugar in DNA is deoxyribose, while in RNA the pentose sugar is ribose. The difference between the sugars is the presence of the hydroxyl group ...

Conditions on Early Earth

Around 4 billion years ago, oceans began to condense on earth while volcanic eruptions released nitrogen, carbon dioxide, methane, ammonia, and hydrogen ...

ATP and Macromolecule Synthesis

Biological macromolecules are organic compounds, predominantly composed of carbon atoms. The carbon atoms are covalently bonded with hydrogen, oxygen, ...

Dietary Connections

In biological systems, most metabolic pathways are interconnected. The cellular respiration processes that convert glucose to ATP&#8212;such as ...

From DNA to Protein

The flow of genetic information in cells from DNA to mRNA to protein is described by the central dogma, which states that genes specify the sequence of ...

Overview of Nitrogen Metabolism

Nitrogen is a very important element for life because it is a major constituent of proteins and nucleic acids. It is a macronutrient, and in nature, it is ...

Compounds Essential to Human Function

The human body is composed of cells that are fundamentally made up of several different molecules. These molecules are essential to carry out all ...

an-introduction-to-molecular-developmental-biology

An Introduction to Molecular Developmental Biology

Molecular signals play a major role in the complex processes occurring during embryonic development. These signals regulate activities such as cell ...

Dehydration Synthesis

Dehydration synthesis (also called a condensation reaction) is the chemical process in which two molecules covalently link together to form a new ...

an-introduction-to-saccharomyces-cerevisiae

An Introduction to Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae (commonly known as baker&rsquo;s yeast) is a single-celled eukaryote that is frequently used in scientific research.  S. ...

An Introduction to Transfection

Transfection is the process of inserting genetic material, such as DNA and double stranded RNA, into mammalian cells. The insertion of DNA into a cell ...

All living organisms on Earth are directly or indirectly dependent on photosynthesis. It is the only biological process that can capture energy from ...

an-overview-of-alkenone-biomarker-analysis-for-paleothermometry

An Overview of Alkenone Biomarker Analysis for Paleothermometry

Source: Laboratory of Jeff Salacup&#160;- University of Massachusetts Amherst
Throughout this series of videos, natural samples were extracted and ...

an-introduction-to-caenorhabditis-elegans

An Introduction to Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a microscopic, soil-dwelling roundworm that has been powerfully used as a model organism since the early 1970&rsquo;s.  It was ...

An Overview of Epigenetics

Since the early days of genetics research, scientists have noted certain heritable phenotypic differences that are not due to differences in the ...

An Introduction to Cell Death

Necrosis, apoptosis, and autophagic cell death are all manners in which cells can die, and these mechanisms can be induced by different stimuli, such as ...

An Overview of Gene Expression

Gene expression is the complex process where a cell uses its genetic information to make functional products. This process is regulated at multiple ...

An Introduction to Cell Division

Cell division is the process by which a parent cell divides and gives rise to two or more daughter cells. It is a means of reproduction for single-cell ...

An Overview of Genetic Analysis

An organism&#8217;s physical traits, or phenotype, are a product of its genotype, which is the combination of alleles (gene variants) inherited from its ...

an-introduction-to-cell-motility-and-migration

An Introduction to Cell Motility and Migration

Cell motility and migration play important roles in both normal biology and in disease. On one hand, migration allows cells to generate complex tissues ...

An Overview of Genetic Engineering

Genetic engineering &#8211; the process of purposefully altering an organism&#8217;s DNA &#8211; has been used to create powerful research tools and model ...

an-introduction-to-cellular-and-molecular-neuroscience

An Introduction to Cellular and Molecular Neuroscience

Cellular and molecular neuroscience is one of the newest and fastest growing subdisciplines in neuroscience. By investigating the influences of genes, ...

An Overview of Genetics and Disease

Many human diseases are associated with mutations or variations in genetic sequences. Some of these genetic variants are heritable, passed down from ...

an-introduction-to-developmental-genetics

An Introduction to Developmental Genetics

Development is the complex process through which a single-celled embryo transforms into a multicellular organism. Developmental processes are guided by ...

an-overview-of-bgdgt-biomarker-analysis-for-paleoclimatology

An Overview of bGDGT Biomarker Analysis for Paleoclimatology

Annexin V and Propidium Iodide Labeling

Staining with annexin V and propidium iodide (PI) provides researchers with a way to identify different types of cell death&#8212;either necrosis or ...

Co-Immunoprecipitation and Pull-Down Assays

Co-immunoprecipitation (CoIP) and pull-down assays are closely related methods to identify stable protein-protein interactions. These methods are related ...

Bacterial Transformation: Electroporation

The term &#x201C;transformation&#x201D; refers cellular ingestion of foreign DNA.  In nature, transformation can occur in certain types of bacteria.  In ...

Construct and revise an explanation based on evidence for how carbon, hydrogen, and oxygen from sugar molecules may combine with other elements such as nitrogen, sulfur, and phosphorus to form amino acids and other carbon-based molecules.

Protein Purification with SEC and IMAC

Description

Transcript

More videos by Standards