Name: tracking cell chemistry with metabolic labels
Uploaded: 2023-04-30T06:31:10.000Z
Duration: 8 min 28 s
Channel: JoVE

K12 Standards

new-york-state-science-learning-standards

New York State Science Learning Standards

High School

Physical Science

HS. Waves and Electromagnetic Radiation

HS-PS4-5.

Metabolic Labeling

تستخدم الملصقات الأيضية للتحقيق في التحولات والتعديلات الكيميائية الحيوية التي تحدث في الخلية. يتم تحقيق ذلك باستخدام نظائر كيميائية تحاكي بنية الجزيئات الحيوية الطبيعية. تستخدم الخلايا نظائرها في عملياتها الكيميائية الحيوية الذاتية ، وتنتج مركبات مصنفة. يسمح الملصق بدمج علامات الكشف والتقارب ، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك لتوضيح مسارات التمثيل الغذائي باستخدام تقنيات تحليلية كيميائية حيوية أخرى ، مثل SDS-PAGE و NMR. 
يقدم هذا الفيديو مفاهيم وضع العلامات الأيضية ويظهر إجراءين عامين. الأول يستخدم وضع العلامات النظيرية لتوصيف فسفرة البروتين. يغطي الثاني وضع العلامات التفاعلية الضوئية لتوصيف تفاعل البروتين والبروتين داخل كما يتم تقديم ثلاثة تطبيقات لوضع العلامات الأيضية: وضع العلامات على المواد النباتية ، ووضع العلامات على الحمض النووي الريبي لقياس الحركية ووضع العلامات على الجليكان في الأجنة النامية.

وضع العلامات الأيضية

تستخدم الملصقات الأيضية للتحقيق في التحولات والتعديلات الكيميائية الحيوية التي تحدث في الخلية. يتم تحقيق ذلك باستخدام نظائر كيميائية تحاكي بنية الجزيئات الحيوية الطبيعية. تستخدم الخلايا نظائرها في عملياتها الكيميائية الحيوية الذاتية ، وتنتج مركبات مصنفة. يسمح الملصق بدمج علامات الكشف والتقارب ، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك لتوضيح مسارات التمثيل الغذائي باستخدام تقنيات تحليلية كيميائية حيوية أخرى ، مثل SDS-PAGE و NMR. 
يقدم هذا الفيديو مفاهيم وضع العلامات الأيضية ويظهر إجراءين عامين. الأول يستخدم وضع العلامات النظيرية لتوصيف فسفرة البروتين. يغطي الثاني وضع العلامات التفاعلية الضوئية لتوصيف تفاعل البروتين والبروتين داخل كما يتم تقديم ثلاثة تطبيقات لوضع العلامات الأيضية: وضع العلامات على المواد النباتية ، ووضع العلامات على الحمض النووي الريبي لقياس الحركية ووضع العلامات على الجليكان في الأجنة النامية. 

<div class="chapter_text" id="script_0">
يستخدم وضع العلامات الأيضية للتحقيق في آلية الخلية. يتم تحقيق ذلك باستخدام نظائر كيميائية لاستكشاف التحولات والتعديلات الكيميائية الحيوية التي تحدث. سيعرض هذا الفيديو مبادئ وضع العلامات الأيضية ، وإجراءات وضع العلامات النظيرية النموذجية والتفاعلية الضوئية ، وبعض التطبيقات. 
</div>
<div class="chapter_text" id="script_1">
يمكن إجراء وضع العلامات الأيضية باستخدام عدد من الاستراتيجيات. سنصف هنا الملصقات النظيرية والتفاعلية الضوئية والمتعامدة الحيوية. 
يتم إجراء وضع العلامات النظيرية باستخدام نظائر هيكلية متطابقة كيميائيا مع نظيراتها الطبيعية ، ولكن تحتوي على نظائر غير شائعة مدمجة في هيكلها. في هذا التناظرية L-lysine ، يتم استبدال ذرات الكربون والنيتروجين بالكربون 13 والنيتروجين 15. الخلايا المزروعة في وجود نظائر نظائرية ستدمجها في هياكلها الكيميائية الحيوية. يتم جمع المستقلبات من الخلايا وتنقيتها لتحليلها. يتم تحليل العينات ذات النظائر المستقرة باستخدام تقنيات مثل قياس الطيف الكتلي أو التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي. يتم تحليل العينات ذات الملصقات المشعة باستخدام عد التلألؤ السائل وأفلام الأشعة السينية ، والتي سيتم إظهارها في بروتوكول وضع العلامات النظيرية. 
الملصقات التفاعلية الضوئية هي مجموعات وظيفية مدمجة في البروتينات ، والتي تكون مستقرة حتى تتعرض للأشعة فوق البنفسجية. تشكل المجموعة الوظيفية جذريا تفاعليا يرتبط بأقرب بروتين. مثال شائع ، L-photo-leucine ، يحتوي على حلقة ديازيرين ، وهي عبارة عن رابط متشابك تفاعلي ضوئي. على عكس وضع العلامات النظيرية ، هناك بعض الاختلاف الكيميائي بين نظائرها الكيميائية التفاعلية للضوء ونظيراتها الطبيعية. قد تدمج الخلايا بشكل تفضيلي مركبات طبيعية على نظائرها. لذلك ، من المهم إجراء وضع العلامات التفاعلية للصور في وسط خال من المركب الذي يتم تقليده. بمجرد تعرضها للأشعة فوق البنفسجية ، تصبح المجموعات التفاعلية الضوئية في البروتين المسمى غير مستقرة وشديدة التفاعل ، مما يؤدي إلى ارتباطها بالبروتينات المتفاعلة ، مما يؤدي إلى تكوين مركب بروتيني تعمل المجمعات المتشابكة كلقطات يمكن تحليلها بعد ذلك باستخدام SDS-PAGE وطرق قياس الطيف الكتلي. يوفر هذا نظرة ثاقبة حول التفاعلات التي تحدث في مسار التمثيل الغذائي من خلال تحديد أنواع التفاعل وكيفية تفاعلها من خلال تحديد مواقع الربط. 
تستخدم استراتيجيات وضع العلامات المتعامدة الحيوية نظائر ذات مجموعات وظيفية صغيرة ليس لها تفاعل يذكر أو معدوم مع الجزيئات الحيوية الطبيعية. على سبيل المثال ، الأزيدات عبارة عن مجموعات وظيفية صغيرة ، يقال إن تفاعلها متعامد مع التفاعلات الكيميائية الحيوية. في ربط Staudinger ، تهاجم مجموعة الفوسفين مجموعة azido. ينتج عن هذا حالة انتقالية تتفاعل داخل الجزيئية مع إستر قريب ، مما ينتج عنه ترابط مرتبط بالأمين. يمكن ربط المجموعات الوظيفية المتعامدة الحيوية المدمجة في الجزيئات الحيوية بعلامات الكشف مثل المجموعات الوظيفية الفلورية وعلامات التقارب مثل المستضدات. 
الآن بعد أن تمت مناقشة بعض المفاهيم والاستراتيجيات الخاصة بوضع العلامات الأيضية ، دعونا نلقي نظرة على العملية في المختبر. 
</div>
<div class="chapter_text" id="script_2">
تتمثل الخطوة الأولى في تجربة وضع العلامات الأيضية في جمع البروتين محل الاهتمام. للقيام بذلك ، تزرع الخلايا على طبق ، ويتم استخدام طريقة التعبير لتعزيز تخليق البروتين المطلوب. في هذا المثال ، يتم التعبير عن الكينازات المتكررة الغنية بالليوسين ، أو LRRK. يستخدم فوسفات ثنائي الصوديوم ، الذي يحتوي على الفوسفور المشع -32 ، كنظير. يجب اتخاذ التدابير المناسبة للحماية من الإشعاع المؤين. ويشمل ذلك إنشاء منطقة عمل ، وارتداء معدات الحماية المناسبة ، والتحقق من التلوث الإشعاعي. بمجرد اتخاذ تدابير السلامة ، يتم تحضير الوسط الذي يحتوي على نظائر النظائر. تتم إزالة الوسط من الثقافة واستبداله بوسيط يحتوي على نظائرها الكيميائية النظيرية ثم يتم احتضانه. بعد الحضانة ، يتم تحلل الخلايا. يتم جمع المحللة وتنقيتها. 
بعد التنقية ، يتم حل البروتينات باستخدام SDS-PAGE ثم نقلها إلى غشاء PVDF. يتم إجراء التصوير الشعاعي الذاتي عن طريق تعريض الغشاء لفيلم الأشعة السينية وقياسه باستخدام جهاز تصوير الفوسفور. يستخدم النشاف الغربي لقياس مستويات البروتين النسبية في غشاء PVDF. في هذا المثال ، تم قياس مستويات الفسفرة في الكينازات المتكررة الغنية بالليوسين المركبة في خلايا 293T. يوضح مخطط الأشعة الذاتية كمية الفوسفور التي تم دمجها في البروتين. يوضح النشاف الغربي مستويات بروتينات LRRK. يستخدم برنامج تحليل الصور للحصول على بيانات كمية لمستويات فسفرة البروتينات. 
</div>
<div class="chapter_text" id="script_3">
في هذا الإجراء التالي ، يتم عرض الملصقات التفاعلية الضوئية. أولا ، يتم تحضير الخلايا وزراعتها. يضاف التناظري التفاعلي الضوئي إلى الخلايا في مرحلة منتصف السجل ويحتضن. في هذا الإجراء يتم استخدام p-benzoylphenylalanine. يتم جمع العينات على فترات ووضعها على الجليد. ثم يتم عرض العينات للحصول على لقطات من المسارات الكيميائية الحيوية بمرور الوقت. ثم يتم تنقية البروتينات ذات الأهمية وحلها باستخدام SDS-PAGE. 
تم استخدام استراتيجية وضع العلامات التفاعلية الضوئية لتحديد المركبات التي تتفاعل مع البروتين محل الاهتمام. يظهر الكشف المناعي باستخدام النشاف الغربي نطاقات بروتينية تشير إلى وجود بروتينات ذات وزن جزيئي أعلى في العينات المشععة. هذه ناتجة عن الربط المتقاطع بسبب تفاعل البروتين والبروتين الذي يحدث أثناء الأشعة فوق البنفسجية. 
</div>
<div class="chapter_text" id="script_4">
الآن بعد أن راجعنا إجراءات وضع العلامات الأيضية ، دعنا نلقي نظرة على بعض طرق استخدام العملية. 
يمكن توسيع مفاهيم وضع العلامات الأيضية على الكائنات متعددة الخلايا. تزرع النباتات في بيئة محكمة الغلق وغنية بالنظائر المستقرة لإنتاج مواد نباتية مصنفة. يضاف ثاني أكسيد الكربون المحتوي على الكربون 13 إلى العلبة ، بينما يتم استخدام الأسمدة الغنية بالنيتروجين 15. يمكن أن تساعد المواد النباتية المحصودة الناتجة في الإجابة على أسئلة حول تدوير الكربون والنيتروجين من النظام البيئي. 
يتيح وضع العلامات فصل الحمض النووي الريبي المركب حديثا عن الحمض النووي الريبي الأقدم. من خلال تغيير التركيز الأولي للتناظرية ، يمكن تحديد حركية تخليق الحمض النووي الريبي الجديد. تظهر النتائج أن تركيز 4-ثيوريدين يؤثر على مقدار الحمض النووي الريبي الجديد الذي يتم نسخه. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن قياس معدلات دمج الملصق في الحمض النووي الريبي مباشرة باستخدام مقياس الطيف الضوئي. 
باستخدام كيمياء النقر ثنائية التعامد ، يمكن تسمية الجليكان في جنين أسماك الحمار الوحشي. يتم حقن البيض بمركب وضع العلامات الذي ينتج عنه ملصقات الألكين على الجليكانات. ثم يتم ربط الجليكان الموجود في اليرقات بمركب صبغة في مرحلة التطور المطلوبة. ثم يتم تصوير الجليكان في الأجنة. يمكن تحديد الجليكان المنتجة في نقاط زمنية مختلفة عن طريق وضع العلامات باستخدام ألوان مختلفة في مراحل مختلفة من نمو الجنين. 
</div>
<div class="chapter_text" id="script_5">
لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول وضع العلامات الأيضية. وصف هذا الفيديو المفاهيم الكامنة وراء وضع العلامات الأيضية واستراتيجياتها ، وتناول إجراءين عامين ، وغطى بعض استخدامات التقنيات. 
شكرا للمشاهدة! 
</div>

Metabolic labeling is used to probe the biochemical transformations and modifications that occur in a cell. This is accomplished by using chemical analogs ...

يستخدم وضع العلامات الأيضية للتحقيق في آلية الخلية. يتم تحقيق ذلك باستخدام نظائر كيميائية لاستكشاف التحولات والتعديلات الكيميائية الحيوية التي تحدث. سيعرض هذا الفيديو مبادئ وضع العلامات الأيضية ، وإجراءات وضع العلامات النظيرية النموذجية والتفاعلية الضوئية ، وبعض التطبيقات. يمكن إجراء وضع العلامات الأيضية باستخدام عدد من الاستراتيجيات. سنصف هنا الملصقات النظيرية والتفاعلية الضوئية والمتعامدة الحيوية. يتم إجراء وضع العلامات النظيرية باستخدام نظائر هيكلية متطابقة كيميائيا مع نظيراتها الطبيعية ، ولكن تحتوي على نظائر غير شائعة مدمجة في هيكلها. في هذا التناظرية L-lysine ، يتم استبدال ذرات الكربون والنيتروجين بالكربون 13 والنيتروجين 15. الخلايا المزروعة في وجود نظائر نظائرية ستدمجها في هياكلها الكيميائية الحيوية. يتم جمع المستقلبات من الخلايا وتنقيتها لتحليلها. يتم تحليل العينات ذات النظائر المستقرة باستخدام تقنيات مثل قياس الطيف الكتلي أو التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي. يتم تحليل العينات ذات الملصقات المشعة باستخدام عد التلألؤ السائل وأفلام الأشعة السينية ، والتي سيتم إظهارها في بروتوكول وضع العلامات النظيرية. الملصقات التفاعلية الضوئية هي مجموعات وظيفية مدمجة في البروتينات ، والتي تكون مستقرة حتى تتعرض للأشعة فوق البنفسجية. تشكل المجموعة الوظيفية جذريا تفاعليا يرتبط بأقرب بروتين. مثال شائع ، L-photo-leucine ، يحتوي على حلقة ديازيرين ، وهي عبارة عن رابط متشابك تفاعلي ضوئي. على عكس وضع العلامات النظيرية ، هناك بعض الاختلاف الكيميائي بين نظائرها الكيميائية التفاعلية للضوء ونظيراتها الطبيعية. قد تدمج الخلايا بشكل تفضيلي مركبات طبيعية على نظائرها. لذلك ، من المهم إجراء وضع العلامات التفاعلية للصور في وسط خال من المركب الذي يتم تقليده. بمجرد تعرضها للأشعة فوق البنفسجية ، تصبح المجموعات التفاعلية الضوئية في البروتين المسمى غير مستقرة وشديدة التفاعل ، مما يؤدي إلى ارتباطها بالبروتينات المتفاعلة ، مما يؤدي إلى تكوين مركب بروتيني تعمل المجمعات المتشابكة كلقطات يمكن تحليلها بعد ذلك باستخدام SDS-PAGE وطرق قياس الطيف الكتلي. يوفر هذا نظرة ثاقبة حول التفاعلات التي تحدث في مسار التمثيل الغذائي من خلال تحديد أنواع التفاعل وكيفية تفاعلها من خلال تحديد مواقع الربط. تستخدم استراتيجيات وضع العلامات المتعامدة الحيوية نظائر ذات مجموعات وظيفية صغيرة ليس لها تفاعل يذكر أو معدوم مع الجزيئات الحيوية الطبيعية. على سبيل المثال ، الأزيدات عبارة عن مجموعات وظيفية صغيرة ، يقال إن تفاعلها متعامد مع التفاعلات الكيميائية الحيوية. في ربط Staudinger ، تهاجم مجموعة الفوسفين مجموعة azido. ينتج عن هذا حالة انتقالية تتفاعل داخل الجزيئية مع إستر قريب ، مما ينتج عنه ترابط مرتبط بالأمين. يمكن ربط المجموعات الوظيفية المتعامدة الحيوية المدمجة في الجزيئات الحيوية بعلامات الكشف مثل المجموعات الوظيفية الفلورية وعلامات التقارب مثل المستضدات. الآن بعد أن تمت مناقشة بعض المفاهيم والاستراتيجيات الخاصة بوضع العلامات الأيضية ، دعونا نلقي نظرة على العملية في المختبر. تتمثل الخطوة الأولى في تجربة وضع العلامات الأيضية في جمع البروتين محل الاهتمام. للقيام بذلك ، تزرع الخلايا على طبق ، ويتم استخدام طريقة التعبير لتعزيز تخليق البروتين المطلوب. في هذا المثال ، يتم التعبير عن الكينازات المتكررة الغنية بالليوسين ، أو LRRK. يستخدم فوسفات ثنائي الصوديوم ، الذي يحتوي على الفوسفور المشع -32 ، كنظير. يجب اتخاذ التدابير المناسبة للحماية من الإشعاع المؤين. ويشمل ذلك إنشاء منطقة عمل ، وارتداء معدات الحماية المناسبة ، والتحقق من التلوث الإشعاعي. بمجرد اتخاذ تدابير السلامة ، يتم تحضير الوسط الذي يحتوي على نظائر النظائر. تتم إزالة الوسط من الثقافة واستبداله بوسيط يحتوي على نظائرها الكيميائية النظيرية ثم يتم احتضانه. بعد الحضانة ، يتم تحلل الخلايا. يتم جمع المحللة وتنقيتها. بعد التنقية ، يتم حل البروتينات باستخدام SDS-PAGE ثم نقلها إلى غشاء PVDF. يتم إجراء التصوير الشعاعي الذاتي عن طريق تعريض الغشاء لفيلم الأشعة السينية وقياسه باستخدام جهاز تصوير الفوسفور. يستخدم النشاف الغربي لقياس مستويات البروتين النسبية في غشاء PVDF. في هذا المثال ، تم قياس مستويات الفسفرة في الكينازات المتكررة الغنية بالليوسين المركبة في خلايا 293T. يوضح مخطط الأشعة الذاتية كمية الفوسفور التي تم دمجها في البروتين. يوضح النشاف الغربي مستويات بروتينات LRRK. يستخدم برنامج تحليل الصور للحصول على بيانات كمية لمستويات فسفرة البروتينات. في هذا الإجراء التالي ، يتم عرض الملصقات التفاعلية الضوئية. أولا ، يتم تحضير الخلايا وزراعتها. يضاف التناظري التفاعلي الضوئي إلى الخلايا في مرحلة منتصف السجل ويحتضن. في هذا الإجراء يتم استخدام p-benzoylphenylalanine. يتم جمع العينات على فترات ووضعها على الجليد. ثم يتم عرض العينات للحصول على لقطات من المسارات الكيميائية الحيوية بمرور الوقت. ثم يتم تنقية البروتينات ذات الأهمية وحلها باستخدام SDS-PAGE. تم استخدام استراتيجية وضع العلامات التفاعلية الضوئية لتحديد المركبات التي تتفاعل مع البروتين محل الاهتمام. يظهر الكشف المناعي باستخدام النشاف الغربي نطاقات بروتينية تشير إلى وجود بروتينات ذات وزن جزيئي أعلى في العينات المشععة. هذه ناتجة عن الربط المتقاطع بسبب تفاعل البروتين والبروتين الذي يحدث أثناء الأشعة فوق البنفسجية. الآن بعد أن راجعنا إجراءات وضع العلامات الأيضية ، دعنا نلقي نظرة على بعض طرق استخدام العملية. يمكن توسيع مفاهيم وضع العلامات الأيضية على الكائنات متعددة الخلايا. تزرع النباتات في بيئة محكمة الغلق وغنية بالنظائر المستقرة لإنتاج مواد نباتية مصنفة. يضاف ثاني أكسيد الكربون المحتوي على الكربون 13 إلى العلبة ، بينما يتم استخدام الأسمدة الغنية بالنيتروجين 15. يمكن أن تساعد المواد النباتية المحصودة الناتجة في الإجابة على أسئلة حول تدوير الكربون والنيتروجين من النظام البيئي. يتيح وضع العلامات فصل الحمض النووي الريبي المركب حديثا عن الحمض النووي الريبي الأقدم. من خلال تغيير التركيز الأولي للتناظرية ، يمكن تحديد حركية تخليق الحمض النووي الريبي الجديد. تظهر النتائج أن تركيز 4-ثيوريدين يؤثر على مقدار الحمض النووي الريبي الجديد الذي يتم نسخه. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن قياس معدلات دمج الملصق في الحمض النووي الريبي مباشرة باستخدام مقياس الطيف الضوئي. باستخدام كيمياء النقر ثنائية التعامد ، يمكن تسمية الجليكان في جنين أسماك الحمار الوحشي. يتم حقن البيض بمركب وضع العلامات الذي ينتج عنه ملصقات الألكين على الجليكانات. ثم يتم ربط الجليكان الموجود في اليرقات بمركب صبغة في مرحلة التطور المطلوبة. ثم يتم تصوير الجليكان في الأجنة. يمكن تحديد الجليكان المنتجة في نقاط زمنية مختلفة عن طريق وضع العلامات باستخدام ألوان مختلفة في مراحل مختلفة من نمو الجنين. لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول وضع العلامات الأيضية. وصف هذا الفيديو المفاهيم الكامنة وراء وضع العلامات الأيضية واستراتيجياتها ، وتناول إجراءين عامين ، وغطى بعض استخدامات التقنيات. شكرا للمشاهدة!

Education

JoVE Science Education

Chemistry

الكيمياء

Biochemistry

الكيمياء الحيوية

tracking cell chemistry with metabolic labels

Metabolic labeling tracks cell chemistry by using chemical analogs that cells take up and build into biomolecules. These labels help scientists follow biochemical changes and modifications inside cells. The labeled products can then be studied with tools such as SDS-PAGE and NMR to learn more about metabolic pathways.

Several labeling strategies are shown here. Isotopic labeling uses analogs that match the natural molecule but contain uncommon isotopes, such as carbon-13 and nitrogen-15 in an L-lysine analog. Photoreactive labeling uses groups that stay stable until they are exposed to ultraviolet light. Bioorthogonal labeling uses small functional groups, such as azides, that do not normally react with other biomolecules.

Isotopic labels are added to cultured cells, and the cells build them into their proteins and metabolites. The collected samples are purified and then analyzed by mass spectrometry or NMR spectroscopy when stable isotopes are used. When radioactive labels are used, liquid scintillation counting and x-ray film are used for detection. The protocol shown uses radioactive phosphorus-32 to study phosphorylation of leucine-rich repeat kinases, or LRRK, in 293T cells.

Proper safety steps are needed when working with radioactive material. The work area must be set up carefully, protective equipment must be worn, and the samples must be checked for contamination. After incubation with the labeled medium, the cells are lysed, the lysate is collected, and the proteins are purified. The proteins are then separated by SDS-PAGE, transferred to a PVDF membrane, and detected by autoradiography and Western blotting. Image analysis software is used to quantify phosphorylation levels.

Photoreactive labeling is used to capture protein-protein interactions. In this method, p-benzoylphenylalanine is added to cells during mid-log growth, and samples are collected over time and kept on ice. After UV exposure, the photoreactive group becomes highly reactive and cross-links with nearby proteins. The cross-linked complexes are then purified, run on SDS-PAGE, and examined by Western blotting. Higher molecular weight bands in irradiated samples show that cross-linking has occurred.

Bioorthogonal labeling uses reactions that are separate from normal cell chemistry. In the Staudinger ligation, a phosphine reacts with an azido group and forms a labeled product that can carry detection or affinity tags. This approach is useful for adding fluorescent tags or antigen tags to biomolecules without strongly disturbing their natural behavior.

The same labeling ideas can also be applied to plants, RNA, and embryos. Plants grown in a sealed environment can be labeled with carbon-13 carbon dioxide and nitrogen-15 fertilizer to study carbon and nitrogen cycling. New RNA can be separated from older RNA to measure synthesis kinetics, and the amount of 4-thiouridine affects how much new RNA is transcribed. In zebrafish embryos, glycans can be labeled by click chemistry, dyed at different developmental stages, and imaged in different colors to track when they are made.

Tracking Cell Chemistry with Metabolic Labels

tracking-cell-chemistry-with-metabolic-labels

dialysis: diffusion based separation

Dialysis for Buffer Exchange in Biochemistry

Dialysis is a common biochemistry technique for buffer exchange and desalting. It separates molecules by diffusion through a semipermeable membrane, which lets small molecules pass while holding larger biomolecules inside the sample. The membrane is the key part of the setup. Its pores create a molecular weight cutoff, so a membrane such as a 10 kDa membrane usually keeps molecules larger than 10 kilodaltons inside. This cutoff is not exact, because membranes have a range of pore sizes.

enzyme assays and kinetics

Measuring Enzyme Reaction Rates

Enzyme reaction rates can be measured with assays that track how substrate or product levels change over time. Enzymes are proteins, or sometimes RNAs, that speed up chemical reactions by lowering the activation energy needed to start them. They act on a specific substrate and help form a product that supports life processes. Enzymatic reactions are often described in three steps. First, the substrate binds to the enzyme active site and forms an enzyme-substrate complex. That complex can fall...

maldi-tof mass spectrometry

How MALDI-TOF Reads Biomolecules

MALDI-TOF mass spectrometry reads biomolecules by using a laser, a matrix, and a time-of-flight analyzer. MALDI, or matrix-assisted laser desorption ionization, helps fragile molecules keep their structure while they are moved into the mass analyzer. The analyzer then separates compounds based on size and charge. In MALDI, the sample is mixed into a matrix, usually an organic compound with aromatic and conjugated double bonds. A laser pulse strikes the spot, and the matrix absorbs most of the...

tandem mass spectrometry

Tandem Mass Spectrometry for Biomolecule Analysis

Tandem mass spectrometry is used to isolate a biomolecule and break it into smaller pieces so its makeup can be studied. Because biomolecules often have large, complex structures, it can be hard to identify their molecular composition and sequence from a single measurement. By linking mass spectrometers in series, the technique first selects one ion and then analyzes the fragments it produces. The process starts with an ion source that converts the sample into ions. A mass analyzer then...

protein crystallization

Protein Crystals for Structure Analysis

Protein crystals help scientists study protein structure and function. A crystal is a solid lattice made from purified protein molecules. These crystals are useful in structural biology because they reveal details that methods like mass spectrometry and SDS-PAGE cannot show on their own. Protein crystallization is paired with recombinant protein expression and x-ray diffraction to support this work. The process starts with a large amount of very pure protein. Researchers often make that...

chromatography-based biomolecule purification methods

chromatography-based-biomolecule-purification-methods

Protein Purification with SEC and IMAC

Protein purification with size-exclusion chromatography and affinity chromatography helps isolate biomolecules from complex mixtures. These methods are common in biochemistry because purified samples are needed before a biomolecule’s properties and activity can be studied. The video focuses on the principles behind size-exclusion chromatography, affinity chromatography, and immobilized metal affinity chromatography, or IMAC. Size-exclusion chromatography, or SEC, separates molecules by size. A...

two-dimensional gel electrophoresis

Protein Mapping with 2D Gel Electrophoresis

Protein mapping with 2D gel electrophoresis separates complex protein mixtures across two steps. The method combines isoelectric focusing, or IEF, with sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, or SDS-PAGE. Together, these methods can resolve thousands of biomolecules from a single sample by their isoelectric point and molecular weight. The first dimension is IEF. Each protein has an isoelectric point, or pI, which is the pH where its net charge is zero. Proteins are loaded...

metabolic labeling

Metabolic labeling tracks cell chemistry by using chemical analogs that cells take up and build into biomolecules. These labels help scientists follow biochemical changes and modifications inside cells. The labeled products can then be studied with tools such as SDS-PAGE and NMR to learn more about metabolic pathways. Several labeling strategies are shown here. Isotopic labeling uses analogs that match the natural molecule but contain uncommon isotopes, such as carbon-13 and nitrogen-15 in an...

electrophoretic mobility shift assay (emsa)

electrophoretic-mobility-shift-assay-emsa

Detecting Protein-DNA Binding by EMSA

Electrophoretic mobility shift assay, or EMSA, is a biochemical method used to detect binding between proteins and nucleic acids. It is also called a gel shift assay. The test compares how a labeled nucleic acid moves through a gel before and after it binds a protein. EMSA is used to see whether a specific protein binds to a specific nucleic acid. First, the nucleic acid is labeled to make a probe. The transcript describes radioactive phosphorus-32 as a common label. The probe is then mixed...

photometric protein determination

Measuring Protein Concentration with Absorbance

Measuring protein concentration with absorbance is a key step in many biochemical assays. Photometric methods use the fact that samples with more light-absorbing material transmit less light. Because concentration and absorption are directly related, this makes it possible to measure an unknown sample. The core idea comes from the Beer-Lambert Law. This law states that the concentration of a light-absorbing species is proportional to its absorbance. The video also introduces the Bradford assay...

density gradient ultracentrifugation

Sucrose Gradient Separation in an Ultracentrifuge

Sucrose gradient separation in an ultracentrifuge is a lab method for isolating cell parts and biomolecules. It uses differences in density to make particles sink or rise in a liquid. A high-speed ultracentrifuge speeds up this process so components can be separated without destroying them. The basic idea starts with a suspension, which is particles mixed in a liquid solvent. Particles that are denser than the solvent sediment, while less dense particles float. A rotor inside the...

co-immunoprecipitation and pull-down assays

co-immunoprecipitation-and-pull-down-assays

Protein Interaction Capture Methods in Cells

Co-immunoprecipitation and pull-down assays are laboratory methods used to capture stable protein-protein interactions. Protein-protein interactions help control many biological functions, but many of them have not yet been identified. These assays are related to immunoprecipitation, which isolates a target protein from a mixed sample using an antibody. In co-immunoprecipitation, or CoIP, an antibody binds the target protein, and that protein is already attached to another protein that the...

reconstitution of membrane proteins

Membrane Proteins in Liposome Models

Membrane proteins can be moved into liposome models so their function can be studied outside a cell. Reconstitution means restoring an isolated biomolecule to a working form. For membrane proteins, that usually means placing a purified protein into an artificial lipid membrane. Cell membranes are made mainly of phospholipids and membrane proteins. The phospholipids form a bilayer with hydrophilic phosphate heads facing water and hydrophobic fatty acid tails facing inward. Some membrane...

f&#246;rster resonance energy transfer (fret)

FRET as a Molecular Ruler in Cells

Föster resonance energy transfer, or FRET, is a way to study close-range biochemical interactions using light-emitting molecules. A donor fluorophore can pass energy to an acceptor fluorophore when their emission and absorption spectra overlap. This transfer happens only when the pair is very close together, usually within 10 nm. Because FRET depends on distance, it is often called a molecular or spectroscopic ruler. The strength of the signal is measured as FRET efficiency, which describes...

surface plasmon resonance (spr)

SPR Biosensors for Tracking Binding Kinetics

Surface plasmon resonance, or SPR, is a way to track biomolecular binding on a label-free biosensor. It is used to measure molecular affinity, kinetics, specificity, and concentration. The method works with a thin metal layer on a prism, where changes in reflected light reveal interactions in real time. SPR sensors use a thin layer of a noble metal on the face of a prism. Light is reflected from the prism-metal interface into a photodetector. At one specific angle, called the surface plasmon...

biochemistry

This collection presents commonly used purification methods, such as affinity chromatography, as well as analytical methods, like MALDI-TOF. In addition, the videos showcase methods for assessing biomolecule interaction and function, such as co-immunoprecipitation and metabolic labeling.

Learn how metabolic labels help trace protein changes, protein interactions, RNA synthesis, plant growth, and glycan development in cells and embryos.

Tracking Cell Chemistry with Metabolic Labels | JoVE K12

Life Science

matter-and-energy-in-organisms-and-ecosystems

Matter and Energy in Organisms and Ecosystems

HS-LS1-6.

HS-LS2-4.

Overview

Principles of Metabolic Labeling

Isotopic Labeling Procedure

Photoreactive Labeling Procedure

Applications

Summary

Travelling Waves

A wave is a disturbance that propagates from its source, repeating itself periodically, and is typically associated with simple harmonic motion. ...

Wave Parameters

The simplest mechanical waves are associated with simple harmonic motion and repeat themselves for several cycles. These simple harmonic waves can be ...

Equations of Wave Motion

Mathematically, the motion of a wave can be studied using a wavefunction. Consider a string oscillating up and down in simple harmonic motion, having a ...

Graphing the Wave Function

Consider the wave equation for a sinusoidal wave moving in the positive x-direction. The wave equation is a function of both position and time. From the ...

/files/media/science-education/science-education-thumbs/14721.jpg

Velocity and Acceleration of a Wave

A wave propagates through a medium with a constant speed, known as a wave velocity. It is different from the speed of the particles of the medium, which ...

Speed of a Transverse Wave

The speed of a wave depends on the characteristics of the medium. For example, in the case of a guitar, the strings vibrate to produce the sound. The ...

/files/media/science-education/science-education-thumbs/14722.jpg

problem-solving-tuning-of-a-guitar-string

Problem-Solving: Tuning of a Guitar String

In the case of stringed instruments like the guitar, the elastic property that determines the speed of the sound produced is its linear mass density or ...

/files/media/science-education/science-education-thumbs/14744.jpg

Kinetic and Potential Energy of a Wave

All forms of waves carry energy; this is directly visualized in nature. For instance, the waves of earthquakes are so intense that they can shake huge ...

Energy and Power of a Wave

The total energy associated with a wavelength is the sum of the potential energy and the kinetic energy. The average rate of energy transfer associated ...

Interference and Superposition of Waves

When two waves of the same nature occur in the same region simultaneously, they result in interference. Interference of waves implies that the net effect ...

Reflection of Waves

When a wave travels from one medium to another, it gets reflected at the boundary of the second medium. A common example of this is when a person yells at ...

Propagation of Waves

When a wave propagates from one medium to another, part of it may get reflected in the first medium, and part of it may get transmitted to the second ...

Standing Waves

Sometimes waves do not seem to move; rather, they just vibrate in place. Unmoving waves can be seen on the surface of a glass of milk kept in a ...

/files/media/science-education/science-education-thumbs/12783.jpg

Modes of Standing Waves - I

A close look at earthquakes provides evidence for the conditions appropriate for resonance, standing waves, and constructive and destructive interference. ...

/files/media/science-education/science-education-thumbs/12784.jpg

Modes of Standing Waves: II

The starting point for expressing the modes of standing waves is understanding the boundary conditions that the waves must follow. The boundary conditions ...

/files/media/science-education/science-education-thumbs/14723.jpg

Sound Waves

Sound waves can be thought of as fluctuations in the pressure of a medium through which they propagate. Since the pressure also makes the medium&#39;s ...

Sound as Pressure Waves

Sound waves, which are longitudinal waves, can be modeled as the displacement amplitude varying as a function of the spatial and temporal coordinates. As ...

/files/media/science-education/science-education-thumbs/14724.jpg

Perception of Sound Waves

The human ear is not equally sensitive to all frequencies in the audible range. It may perceive sound waves with the same pressure but different ...

Speed of Sound in Solids and Liquids

Most solids and liquids are incompressible&#8212;their densities remain constant throughout. In the presence of an external force, the molecules tend to ...

Speed of Sound in Gases

The speed of sound in a gaseous medium depends on various factors. Since gases constitute molecules that are free to move, they are highly compressible. ...

Shock Waves

While deriving the Doppler formula for the observed frequency of a sound wave, it is assumed that the speed of sound in the medium is greater than the ...

Echo

The human ear cannot distinguish between two sources of sound if they happen to reach within a specific time interval, typically 0.1 seconds apart. More ...

/files/media/science-education/science-education-thumbs/14729.jpg

Use mathematical representations to support a claim regarding relationships among the period, frequency, wavelength, and speed of waves traveling and transferring energy (amplitude, frequency) in various media.

HS-PS4-1.

Using GIS to Investigate Urban Forestry

Source: Laboratories of Margaret Workman and Kimberly Frye - Depaul University
Urban forests broadly include urban parks, street trees, landscaped ...

Evaluate questions about the advantages of using a digital transmission and storage of information.

HS-PS4-2.

concept-of-resonance-and-its-characteristics

Concept of Resonance and its Characteristics

If a driven oscillator needs to resonate at a specific frequency, then very light damping is required. An example of light damping includes playing piano ...

/files/media/science-education/science-education-thumbs/12772.jpg

Sound Waves: Resonance

Resonance is produced depending on the boundary conditions imposed on a wave. Resonance can be produced in a string under tension with symmetrical ...

Sound Waves: Interference

Sound waves can be modeled either as longitudinal waves, wherein the molecules of the medium oscillate around an equilibrium position, or as pressure ...

Interference: Path Lengths

Consider two sources of sound, that may or may not be in phase, emitting waves at a single frequency, and consider the frequencies to be the same.
Two ...

/files/media/science-education/science-education-thumbs/14727.jpg

The Wave Nature of Light

The nature of light has been a subject of inquiry since antiquity. In the seventeenth century, Isaac Newton performed experiments with lenses and prisms ...

The Electromagnetic Spectrum

The electromagnetic spectrum consists of all the types of electromagnetic radiation arranged according to their frequency and wavelength. Each of the ...

The Quantum-Mechanical Model of an Atom

Shortly after de Broglie published his ideas that the electron in a hydrogen atom could be better thought of as being a circular standing wave instead of ...

Quantum Numbers

It is said that the energy of an electron in an atom is quantized; that is, it can be equal only to certain specific values and can jump from one energy ...

Interference and Diffraction

Source: Yong P. Chen, PhD, Department of Physics &#38; Astronomy, College of Science, Purdue University, West Lafayette, IN
Interference and diffraction ...

Photoelectric Effect

Source: Yong P. Chen, PhD, Department of Physics &#38;&#38; Astronomy, College of Science, Purdue University, West Lafayette, IN
Photoelectric effect ...

Reflection and Refraction

Source: Derek Wilson,&#160;Asantha Cooray, PhD, Department of Physics &#38; Astronomy, School of Physical Sciences, University of California, Irvine, CA
...

Evaluate the claims, evidence, and reasoning behind the idea that electromagnetic radiation can be described either by a wave model or a particle model (quantum theory), and that for some situations one model is more useful than the other.

HS-PS4-3.

Electric Charge in a Magnetic Field

Source: Andrew Duffy, PhD, Department of Physics, Boston University, Boston, MA
This experiment duplicates J.J. Thomson's famous experiment at the end of ...

Electromagnetic Fields

Electric fields generated by static charges, often referred to as electrostatic fields, are characteristically different from electric fields created by ...

Electromagnetic Waves

James Clerk Maxwell formulated a single theory combining all the electric and magnetic effects scientists knew during that time, calling the phenomena his ...

Electromagnetic waves are categorized according to their wavelengths and frequencies, giving the electromagnetic spectrum. These waves are classified as ...

Plane Electromagnetic Waves I

The existence of combined electric and magnetic fields that propagate through space as electromagnetic (EM) waves is the most significant prediction of ...

Plane Electromagnetic Waves II

Consider a plane wavefront traveling in position x-direction with a constant speed. This wavefront can be utilized to obtain the relationship between ...

propagation-speed-of-electromagnetic-waves

Propagation Speed of Electromagnetic Waves

Electromagnetic waves are consistent with Ampere&#39;s law. Assuming there is no conduction current Ampere&#39;s law is given as:


Consider a plane ...

Electromagnetic Waves in Matter

Electromagnetic waves can travel in the vacuum as well as in matter. For example light, which is an electromagnetic wave, can travel through air, water, ...

Energy Carried By Electromagnetic Waves

Anyone who has used a microwave oven knows there is energy in electromagnetic waves. Sometimes, this energy is obvious, such as in the summer sun&#39;s ...

Intensity Of Electromagnetic Waves

The energy transport per unit area per unit time, or the Poynting vector, gives the energy flux of an electromagnetic wave at any specific time. For a ...

Momentum And Radiation Pressure

An object absorbing an electromagnetic wave would experience a force in the direction of propagation of the wave. This force occurs because ...

Cardiac Magnetic Resonance Imaging

Source: Frederick W. Damen and Craig J. Goergen, Weldon School of Biomedical Engineering, Purdue University, West Lafayette, Indiana
In this video, high ...

an-introduction-to-drosophila-melanogaster

An Introduction to Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster, also known as the fruit fly, is a powerful model organism widely used in biological research that has made significant ...

an-introduction-to-the-zebrafish-danio-rerio

An Introduction to the Zebrafish: Danio rerio

Zebrafish (Danio rerio) are small freshwater fish that are used as model organisms for biomedical research. The many strengths of these fish include their ...

Evaluate the validity and reliability of claims in published materials of the effects that different frequencies of electromagnetic radiation have when absorbed by matter.

HS-PS4-4.

Tracking Cell Chemistry with Metabolic Labels

Description

Transcript

Tags

More videos by Standards