Name: protein interaction capture methods in cells
Uploaded: 2023-04-30T06:31:42.000Z
Duration: 8 min 8 s
Channel: JoVE

K12 Standards

new-york-state-science-learning-standards

New York State Science Learning Standards

High School

Physical Science

HS. Chemical Reactions

HS-PS1-5.

co-immunoprecipitation-and-pull-down-assays

Co-Immunoprecipitation and Pull-Down Assays

يعد الترسيب المناعي المشترك (CoIP) والمقايسات المنسدلة طرقا مرتبطة ارتباطا وثيقا لتحديد التفاعلات المستقرة بين البروتين والبروتين. ترتبط هذه الطرق بالترسيب المناعي ، وهي طريقة لفصل البروتين المستهدف المرتبط بجسم مضاد عن البروتينات غير المرتبطة. في CoIP ، يرتبط البروتين المرتبط بالأجسام المضادة بنفسه ببروتين آخر لا يرتبط بالجسم المضاد ، ويتبع ذلك عملية فصل تحافظ على مركب البروتين والبروتين. يتمثل الاختلاف في المقايسات المنسدلة في أن بروتينات الطعم الموسومة بالتقارب تحل محل الأجسام المضادة ، ويستخدم كروماتوغرافيا التقارب لعزل مجمعات البروتين والبروتين. 
يشرح هذا الفيديو CoIP والمقايسات المنسدلة وتنفيذها في المختبر. يتم تغطية بروتوكول خطوة بخطوة لكل تقنية ، بما في ذلك الكواشف والأجهزة والأدوات المستخدمة لتنقية وتحليل البروتينات المرتبطة. بالإضافة إلى ذلك ، يصف قسم التطبيقات في هذا الفيديو إجراء لدراسة كيفية تثبيط بروتينات الفيروس المخاطي للبروتين النووي للأنفلونزا ، والتحقيق في دور أيونات الكالسيوم في الكالمودولين عبر مقايسة منسدلة ، ومقايسة منسدلة معدلة لتوصيف تفاعلات البروتين العابرة.

الترسيب المناعي المشترك وفحوصات السحب

يعد الترسيب المناعي المشترك (CoIP) والمقايسات المنسدلة طرقا مرتبطة ارتباطا وثيقا لتحديد التفاعلات المستقرة بين البروتين والبروتين. ترتبط هذه الطرق بالترسيب المناعي ، وهي طريقة لفصل البروتين المستهدف المرتبط بجسم مضاد عن البروتينات غير المرتبطة. في CoIP ، يرتبط البروتين المرتبط بالأجسام المضادة بنفسه ببروتين آخر لا يرتبط بالجسم المضاد ، ويتبع ذلك عملية فصل تحافظ على مركب البروتين والبروتين. يتمثل الاختلاف في المقايسات المنسدلة في أن بروتينات الطعم الموسومة بالتقارب تحل محل الأجسام المضادة ، ويستخدم كروماتوغرافيا التقارب لعزل مجمعات البروتين والبروتين. 
يشرح هذا الفيديو CoIP والمقايسات المنسدلة وتنفيذها في المختبر. يتم تغطية بروتوكول خطوة بخطوة لكل تقنية ، بما في ذلك الكواشف والأجهزة والأدوات المستخدمة لتنقية وتحليل البروتينات المرتبطة. بالإضافة إلى ذلك ، يصف قسم التطبيقات في هذا الفيديو إجراء لدراسة كيفية تثبيط بروتينات الفيروس المخاطي للبروتين النووي للأنفلونزا ، والتحقيق في دور أيونات الكالسيوم في الكالمودولين عبر مقايسة منسدلة ، ومقايسة منسدلة معدلة لتوصيف تفاعلات البروتين العابرة. 
<div class="chapter_text" id="script_0">
تلعب تفاعلات البروتين والبروتين دورا مهما في مجموعة متنوعة من الوظائف البيولوجية. لم يتم بعد تحديد غالبية تفاعلات البروتين والبروتين وآثارها البيولوجية. يعد الترسيب المناعي المشترك ، أو CoIP ، والمقايسات المنسدلة طريقتين مرتبطتين ارتباطا وثيقا لتحديد التفاعلات المستقرة بين البروتين والبروتين. سيغطي هذا الفيديو مبادئ المقايسين وإجراءاتهما المختبرية العامة وتطبيقات هذه التقنيات. 
</div>
<div class="chapter_text" id="script_1">
فحوصات CoIP و Pull-Down هي متغيرات من الترسيب المناعي ، وهي طريقة لعزل أنواع البروتين بشكل انتقائي عن محلول معقد. في تجربة الترسيب المناعي ، يسمح لجسم مضاد خاص بالبروتين المستهدف بتكوين مركب مناعي مع هذا الهدف في العينة. ثم يتم التقاط المركب على دعامة صلبة ، عادة ما يكون البروتين A مرتبطا بحبة السيفاروز. تتم إزالة أي بروتينات لم يتم التقاطها عن طريق خطوات الطرد المركزي. ثم يتم إطلاق البروتين من الجسم المضاد والدعم الصلب عن طريق الغليان في تقليل المخزن المؤقت لتحميل العينة SDS-PAGE. 
يتم إجراء الترسيب المناعي المشترك بنفس الطريقة ، باستثناء أن مجمعات البروتين السليمة يتم التقاطها على الدعامة الصلبة. يرتبط الجسم المضاد بالبروتين المستهدف ، والذي بدوره يرتبط ببروتين آخر لا يستهدفه الجسم المضاد. كما هو الحال في الترسيب المناعي ، يتم إطلاق مركب البروتين من الجسم المضاد والدعم الصلب عن طريق الغليان في تقليل المخزن المؤقت لتحميل عينة SDS-PAGE. 
تشبه المقايسات المنسدلة الترسيب المناعي المشترك ، وتختلف فقط في استخدام بروتين "الطعم" ، على عكس الجسم المضاد. من خلال تقنيات البيولوجيا الجزيئية ، يتم تصميم بروتين الطعم هذا بعلامة تقارب ، مثل سلسلة من بقايا الهيستيدين. يتم وصف علامات التقارب هذه في "فواصل الجزيئات الحيوية القائمة على الكروماتوغرافيا". ثم يتم التقاط البروتين على رابط تقارب ثابت خاص بالعلامة. ثم يتم تحضين البروتين الملتقط بعينة تحتوي على بروتينات تشكل مجمعات مع "الطعم". يتم إطلاق مركب البروتين من دعم التقارب عن طريق الغسيل بمحلول يحتوي على مادة تحليلية تنافسية خاصة بالعلامة الموجودة على بروتين "الطعم". تعتبر المقايسات المنسدلة مفيدة لتأكيد تفاعلات البروتين التي تنبأ بها الترسيب المناعي المشترك ، ولاكتشاف تفاعلات البروتين غير المعروفة. 
الآن بعد أن تمت مناقشة مبادئ الترسيب المناعي المشترك والمقايسات المنسدلة ، دعونا نلقي نظرة على إجراءاتهم المختبرية. 
</div>
<div class="chapter_text" id="script_2">
أولا ، دعنا نناقش الترسيب المناعي المشترك. إلى سلسلة من أنابيب الطرد الدقيق ، يضاف ما يلي: PBS buffer ، ومحلول 50٪ من البروتين A-sepharose ، وهو مركب بروتين راتنجي يرتبط بالجسم المضاد. يتم تدوير أنابيب الطرد الدقيق لضمان التوزيع السليم ، ثم يتم غسل الراتنج بمخزن مؤقت إضافي PBS. يضاف محلل الخلية ، الذي يحتوي على البروتين المطلوب ، و 2 ميكروغرام من الجسم المضاد إلى أنابيب الطرد الدقيق ، ويتم تدوير الخليط لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية. يتم تكوير الخرزات عن طريق الطرد المركزي ، ويتم التخلص من المادة الطافية ، وإعادة غسل الخرزات ثلاث مرات باستخدام المخزن المؤقت لإزالة البروتين غير المرتبط. الخرزات التي تحتوي على مركب بروتين الجسم المضاد تعمل على تقليل المخزن المؤقت لتحميل عينات SDS-PAGE ، لإزالة المركب من الجسم المضاد ولتحليله بواسطة SDS-PAGE والنشاف المناعي. 
</div>
<div class="chapter_text" id="script_3">
سنناقش الآن إجراء المقايسات المنسدلة: يتم التعبير عن بروتين "الطعم" في بلازميد مع علامة التقارب المناسبة. بعد الوصول إلى نمو الطور اللوغاريتمي ، يتم تحلل الخلايا ، ثم طردها المركزي. يتم سحب حبات الستربتافيدين السيفاروز المعلقة ، والتي تلتقط بروتين "الطعم" الموسوم بالبيوتين ، في أنبوب ميكروفوج. ثم يتم طرد الخرزات وإزالة المادة الطافية بعناية عن طريق الشفط. ثم يتم غسل الخرزات بمحلول عازل ، وطرد مركزي ، وإزالة المادة الطافية. 
يتم حصاد الخلايا التي تحتوي على بروتين "الفريسة" المفترض ، والذي له تقارب مع بروتين "الطعم" ، عن طريق الطرد المركزي. ثم يضاف الطافي إلى أنبوب الطرد الدقيق الذي يحتوي على الراتنج ، ويتم تحضينه عند 4 درجات مئوية لمدة 3 ساعات على شاكر. ثم يتم الطرد المركزي للراتنج وإزالة المادة الطافية وغسل الراتنج لإزالة البروتين غير المرتبط. يضاف المخزن المؤقت إلى الراتنج ، ويتم تحضين الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على شاكر. ثم يتم الطرد المركزي للراتنج ، ويتم تحليل المادة الطافية التي تحتوي على المركب المطلوب عن طريق النشاف المناعي. 
</div>
<div class="chapter_text" id="script_4">
الآن بعد أن راجعنا الإجراءات ، دعونا نلقي نظرة على بعض التطبيقات المفيدة لفحوصات الترسيب المناعي المشترك والمقايسات المنسدلة. 
يمكن أن يكون الترسيب المناعي المشترك مفيدا في فهم أفضل لآلية عمل الإنزيمات. تمنع بروتينات مقاومة الفيروسات المخاطية ، أو Mx ، مجموعة واسعة من الفيروسات ، بما في ذلك الأنفلونزا A ، التي لا تكون آليتها مفهومة جيدا. تم استخدام الترسيب المناعي المشترك لدراسة التفاعل بين بروتين الفأر Mx1 والبروتين النووي للأنفلونزا. 
أثبتت المقايسات المنسدلة فائدتها في دراسة تأثيرات الرسل الثاني ، وهي بروتينات تنقل إشارة من البيئة الخلوية. إنها أحد مكونات مسار الإشارات حيث تتفاعل بروتينات متعددة استجابة للإشارات البيئية. تعمل أيونات الكالسيوم كرسل ثانوي عن طريق الارتباط بالكالمودولين ، والذي بدوره يرتبط بمجموعة متنوعة من البروتينات ، ويتوسط في العديد من أنواع الاستجابات البيولوجية. بدون الكالسيوم، لا يمكن للبروتين أن يرتبط بكالمودولين. تم إجراء اختبار منسدل لاختبار قدرة البروتينات على الارتباط بالكالمودولين في وجود أو عدم وجود أيونات الكالسيوم. 
تستخدم فحوصات الترسيب المناعي المشترك والمقايسات المنسدلة بشكل عام لتحليل تفاعلات البروتين المستقرة أو القوية ، ولكن ليس التفاعلات العابرة. أدى التطور الأخير في المقايسات المنسدلة ، HaloTag ، إلى تبسيط دراسة تفاعلات البروتين العابرة. HaloTag عبارة عن علامة اندماج بروتين مشفرة وراثيا ، مدمجة في البروتين محل الاهتمام ، وقادرة على التفاعل كيميائيا مع دعم صلب من الهالوألكان. إذا كان التحليل الوظيفي مطلوبا ، فيمكن بعد ذلك عزل مركب البروتين ، مطروحا منه العلامة ، بالكامل عن طريق احتضان بروتياز فيروس حفر التبغ. 
</div>
<div class="chapter_text" id="script_5">
لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول الترسيب المناعي المشترك والمقايسات المنسدلة. وصف هذا الفيديو مبادئ الطريقتين ، الإجراءات المختبرية العامة ، وبعض تطبيقاتها. 
شكرا للمشاهدة! 
</div>

Co-immunoprecipitation (CoIP) and pull-down assays are closely related methods to identify stable protein-protein interactions. These methods are related ...

تلعب تفاعلات البروتين والبروتين دورا مهما في مجموعة متنوعة من الوظائف البيولوجية. لم يتم بعد تحديد غالبية تفاعلات البروتين والبروتين وآثارها البيولوجية. يعد الترسيب المناعي المشترك ، أو CoIP ، والمقايسات المنسدلة طريقتين مرتبطتين ارتباطا وثيقا لتحديد التفاعلات المستقرة بين البروتين والبروتين. سيغطي هذا الفيديو مبادئ المقايسين وإجراءاتهما المختبرية العامة وتطبيقات هذه التقنيات. فحوصات CoIP و Pull-Down هي متغيرات من الترسيب المناعي ، وهي طريقة لعزل أنواع البروتين بشكل انتقائي عن محلول معقد. في تجربة الترسيب المناعي ، يسمح لجسم مضاد خاص بالبروتين المستهدف بتكوين مركب مناعي مع هذا الهدف في العينة. ثم يتم التقاط المركب على دعامة صلبة ، عادة ما يكون البروتين A مرتبطا بحبة السيفاروز. تتم إزالة أي بروتينات لم يتم التقاطها عن طريق خطوات الطرد المركزي. ثم يتم إطلاق البروتين من الجسم المضاد والدعم الصلب عن طريق الغليان في تقليل المخزن المؤقت لتحميل العينة SDS-PAGE. يتم إجراء الترسيب المناعي المشترك بنفس الطريقة ، باستثناء أن مجمعات البروتين السليمة يتم التقاطها على الدعامة الصلبة. يرتبط الجسم المضاد بالبروتين المستهدف ، والذي بدوره يرتبط ببروتين آخر لا يستهدفه الجسم المضاد. كما هو الحال في الترسيب المناعي ، يتم إطلاق مركب البروتين من الجسم المضاد والدعم الصلب عن طريق الغليان في تقليل المخزن المؤقت لتحميل عينة SDS-PAGE. تشبه المقايسات المنسدلة الترسيب المناعي المشترك ، وتختلف فقط في استخدام بروتين "الطعم" ، على عكس الجسم المضاد. من خلال تقنيات البيولوجيا الجزيئية ، يتم تصميم بروتين الطعم هذا بعلامة تقارب ، مثل سلسلة من بقايا الهيستيدين. يتم وصف علامات التقارب هذه في "فواصل الجزيئات الحيوية القائمة على الكروماتوغرافيا". ثم يتم التقاط البروتين على رابط تقارب ثابت خاص بالعلامة. ثم يتم تحضين البروتين الملتقط بعينة تحتوي على بروتينات تشكل مجمعات مع "الطعم". يتم إطلاق مركب البروتين من دعم التقارب عن طريق الغسيل بمحلول يحتوي على مادة تحليلية تنافسية خاصة بالعلامة الموجودة على بروتين "الطعم". تعتبر المقايسات المنسدلة مفيدة لتأكيد تفاعلات البروتين التي تنبأ بها الترسيب المناعي المشترك ، ولاكتشاف تفاعلات البروتين غير المعروفة. الآن بعد أن تمت مناقشة مبادئ الترسيب المناعي المشترك والمقايسات المنسدلة ، دعونا نلقي نظرة على إجراءاتهم المختبرية. أولا ، دعنا نناقش الترسيب المناعي المشترك. إلى سلسلة من أنابيب الطرد الدقيق ، يضاف ما يلي: PBS buffer ، ومحلول 50٪ من البروتين A-sepharose ، وهو مركب بروتين راتنجي يرتبط بالجسم المضاد. يتم تدوير أنابيب الطرد الدقيق لضمان التوزيع السليم ، ثم يتم غسل الراتنج بمخزن مؤقت إضافي PBS. يضاف محلل الخلية ، الذي يحتوي على البروتين المطلوب ، و 2 غرام من الجسم المضاد إلى أنابيب الطرد الدقيق ، ويتم تدوير الخليط لمدة ساعة واحدة عند 4 درجة مئوية. يتم تكوير الخرزات عن طريق الطرد المركزي ، ويتم التخلص من المادة الطافية ، وإعادة غسل الخرزات ثلاث مرات باستخدام المخزن المؤقت لإزالة البروتين غير المرتبط. الخرزات التي تحتوي على مركب بروتين الجسم المضاد تعمل على تقليل المخزن المؤقت لتحميل عينات SDS-PAGE ، لإزالة المركب من الجسم المضاد ولتحليله بواسطة SDS-PAGE والنشاف المناعي. سنناقش الآن إجراء المقايسات المنسدلة: يتم التعبير عن بروتين "الطعم" في بلازميد مع علامة التقارب المناسبة. بعد الوصول إلى نمو الطور اللوغاريتمي ، يتم تحلل الخلايا ، ثم طردها المركزي. يتم سحب حبات الستربتافيدين السيفاروز المعلقة ، والتي تلتقط بروتين "الطعم" الموسوم بالبيوتين ، في أنبوب ميكروفوج. ثم يتم طرد الخرزات وإزالة المادة الطافية بعناية عن طريق الشفط. ثم يتم غسل الخرزات بمحلول عازل ، وطرد مركزي ، وإزالة المادة الطافية. يتم حصاد الخلايا التي تحتوي على بروتين "الفريسة" المفترض ، والذي له تقارب مع بروتين "الطعم" ، عن طريق الطرد المركزي. ثم يضاف المادة الطافية إلى أنبوب الطرد الدقيق الذي يحتوي على الراتنج ، ويتم تحضينها عند 4؟ C لمدة 3 ساعات على شاكر. ثم يتم الطرد المركزي للراتنج وإزالة المادة الطافية وغسل الراتنج لإزالة البروتين غير المرتبط. يضاف المخزن المؤقت إلى الراتنج ، ويتم تحضين الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على شاكر. ثم يتم الطرد المركزي للراتنج ، ويتم تحليل المادة الطافية التي تحتوي على المركب المطلوب عن طريق النشاف المناعي. الآن بعد أن راجعنا الإجراءات ، دعونا نلقي نظرة على بعض التطبيقات المفيدة لفحوصات الترسيب المناعي المشترك والمقايسات المنسدلة. يمكن أن يكون الترسيب المناعي المشترك مفيدا في فهم أفضل لآلية عمل الإنزيمات. تمنع بروتينات مقاومة الفيروسات المخاطية ، أو Mx ، مجموعة واسعة من الفيروسات ، بما في ذلك الأنفلونزا A ، التي لا تكون آليتها مفهومة جيدا. تم استخدام الترسيب المناعي المشترك لدراسة التفاعل بين بروتين الفأر Mx1 والبروتين النووي للأنفلونزا. أثبتت المقايسات المنسدلة فائدتها في دراسة تأثيرات الرسل الثاني ، وهي بروتينات تنقل إشارة من البيئة الخلوية. إنها أحد مكونات مسار الإشارات حيث تتفاعل بروتينات متعددة استجابة للإشارات البيئية. تعمل أيونات الكالسيوم كرسل ثانوي عن طريق الارتباط بالكالمودولين ، والذي بدوره يرتبط بمجموعة متنوعة من البروتينات ، ويتوسط في العديد من أنواع الاستجابات البيولوجية. بدون الكالسيوم، لا يمكن للبروتين أن يرتبط بكالمودولين. تم إجراء اختبار منسدل لاختبار قدرة البروتينات على الارتباط بالكالمودولين في وجود أو عدم وجود أيونات الكالسيوم. تستخدم فحوصات الترسيب المناعي المشترك والمقايسات المنسدلة بشكل عام لتحليل تفاعلات البروتين المستقرة أو القوية ، ولكن ليس التفاعلات العابرة. أدى التطور الأخير في المقايسات المنسدلة ، HaloTag ، إلى تبسيط دراسة تفاعلات البروتين العابرة. HaloTag عبارة عن علامة اندماج بروتين مشفرة وراثيا ، مدمجة في البروتين محل الاهتمام ، وقادرة على التفاعل كيميائيا مع دعم صلب من الهالوألكان. إذا كان التحليل الوظيفي مطلوبا ، فيمكن بعد ذلك عزل مركب البروتين ، مطروحا منه العلامة ، بالكامل عن طريق احتضان بروتياز فيروس حفر التبغ. لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول الترسيب المناعي المشترك والمقايسات المنسدلة. وصف هذا الفيديو مبادئ الطريقتين ، الإجراءات المختبرية العامة ، وبعض تطبيقاتها. شكرا للمشاهدة!

Education

JoVE Science Education

Chemistry

الكيمياء

Biochemistry

الكيمياء الحيوية

protein interaction capture methods in cells

Co-immunoprecipitation and pull-down assays are laboratory methods used to capture stable protein-protein interactions. Protein-protein interactions help control many biological functions, but many of them have not yet been identified. These assays are related to immunoprecipitation, which isolates a target protein from a mixed sample using an antibody.

In co-immunoprecipitation, or CoIP, an antibody binds the target protein, and that protein is already attached to another protein that the antibody does not recognize. The intact protein complex is collected on a solid support, such as protein A on sepharose beads, so the interaction is preserved during separation. In pull-down assays, the bait protein is tagged instead of using an antibody. The tagged bait is captured by affinity chromatography and used to isolate the proteins that bind to it.

The CoIP procedure begins with PBS buffer and protein A-sepharose in microfuge tubes. The tubes are rotated, washed, and then mixed with cell lysate and about 2 micrograms of antibody. After 1 hour at 4 degrees Celsius, the beads are centrifuged, washed three times, and placed in reducing SDS-PAGE sample-loading buffer. The released proteins are then analyzed by SDS-PAGE and immunoblotting.

The pull-down procedure uses a bait protein expressed with an affinity tag, such as a series of histidine residues or a biotin tag. After the cells reach log-phase growth, they are lysed and centrifuged. Streptavidin-sepharose beads can capture the biotin-tagged bait, and the beads are then washed before the putative prey protein is added. The mixture is incubated at 4 degrees Celsius for 3 hours on a shaker, washed again, and eluted with buffer. The final complex is analyzed by immunoblotting.

These methods are useful for confirming predicted protein interactions and for finding unknown ones. CoIP has been used to study how mouse Mx1 protein interacts with influenza nucleoprotein, which helps explain the action of myxovirus resistance proteins against influenza A. Pull-down assays have also been used to test how calcium ions affect calmodulin binding, since calmodulin binds many proteins only when calcium is present. For transient protein interactions, a modified pull-down approach using HaloTag can help, and tobacco etch virus protease can remove the tag if functional analysis is needed.

Protein Interaction Capture Methods in Cells

protein-interaction-capture-methods-in-cells

dialysis: diffusion based separation

Dialysis for Buffer Exchange in Biochemistry

Dialysis is a common biochemistry technique for buffer exchange and desalting. It separates molecules by diffusion through a semipermeable membrane, which lets small molecules pass while holding larger biomolecules inside the sample. The membrane is the key part of the setup. Its pores create a molecular weight cutoff, so a membrane such as a 10 kDa membrane usually keeps molecules larger than 10 kilodaltons inside. This cutoff is not exact, because membranes have a range of pore sizes.

enzyme assays and kinetics

Measuring Enzyme Reaction Rates

Enzyme reaction rates can be measured with assays that track how substrate or product levels change over time. Enzymes are proteins, or sometimes RNAs, that speed up chemical reactions by lowering the activation energy needed to start them. They act on a specific substrate and help form a product that supports life processes. Enzymatic reactions are often described in three steps. First, the substrate binds to the enzyme active site and forms an enzyme-substrate complex. That complex can fall...

maldi-tof mass spectrometry

How MALDI-TOF Reads Biomolecules

MALDI-TOF mass spectrometry reads biomolecules by using a laser, a matrix, and a time-of-flight analyzer. MALDI, or matrix-assisted laser desorption ionization, helps fragile molecules keep their structure while they are moved into the mass analyzer. The analyzer then separates compounds based on size and charge. In MALDI, the sample is mixed into a matrix, usually an organic compound with aromatic and conjugated double bonds. A laser pulse strikes the spot, and the matrix absorbs most of the...

tandem mass spectrometry

Tandem Mass Spectrometry for Biomolecule Analysis

Tandem mass spectrometry is used to isolate a biomolecule and break it into smaller pieces so its makeup can be studied. Because biomolecules often have large, complex structures, it can be hard to identify their molecular composition and sequence from a single measurement. By linking mass spectrometers in series, the technique first selects one ion and then analyzes the fragments it produces. The process starts with an ion source that converts the sample into ions. A mass analyzer then...

protein crystallization

Protein Crystals for Structure Analysis

Protein crystals help scientists study protein structure and function. A crystal is a solid lattice made from purified protein molecules. These crystals are useful in structural biology because they reveal details that methods like mass spectrometry and SDS-PAGE cannot show on their own. Protein crystallization is paired with recombinant protein expression and x-ray diffraction to support this work. The process starts with a large amount of very pure protein. Researchers often make that...

chromatography-based biomolecule purification methods

chromatography-based-biomolecule-purification-methods

Protein Purification with SEC and IMAC

Protein purification with size-exclusion chromatography and affinity chromatography helps isolate biomolecules from complex mixtures. These methods are common in biochemistry because purified samples are needed before a biomolecule’s properties and activity can be studied. The video focuses on the principles behind size-exclusion chromatography, affinity chromatography, and immobilized metal affinity chromatography, or IMAC. Size-exclusion chromatography, or SEC, separates molecules by size. A...

two-dimensional gel electrophoresis

Protein Mapping with 2D Gel Electrophoresis

Protein mapping with 2D gel electrophoresis separates complex protein mixtures across two steps. The method combines isoelectric focusing, or IEF, with sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, or SDS-PAGE. Together, these methods can resolve thousands of biomolecules from a single sample by their isoelectric point and molecular weight. The first dimension is IEF. Each protein has an isoelectric point, or pI, which is the pH where its net charge is zero. Proteins are loaded...

metabolic labeling

Tracking Cell Chemistry with Metabolic Labels

Metabolic labeling tracks cell chemistry by using chemical analogs that cells take up and build into biomolecules. These labels help scientists follow biochemical changes and modifications inside cells. The labeled products can then be studied with tools such as SDS-PAGE and NMR to learn more about metabolic pathways. Several labeling strategies are shown here. Isotopic labeling uses analogs that match the natural molecule but contain uncommon isotopes, such as carbon-13 and nitrogen-15 in an...

electrophoretic mobility shift assay (emsa)

electrophoretic-mobility-shift-assay-emsa

Detecting Protein-DNA Binding by EMSA

Electrophoretic mobility shift assay, or EMSA, is a biochemical method used to detect binding between proteins and nucleic acids. It is also called a gel shift assay. The test compares how a labeled nucleic acid moves through a gel before and after it binds a protein. EMSA is used to see whether a specific protein binds to a specific nucleic acid. First, the nucleic acid is labeled to make a probe. The transcript describes radioactive phosphorus-32 as a common label. The probe is then mixed...

photometric protein determination

Measuring Protein Concentration with Absorbance

Measuring protein concentration with absorbance is a key step in many biochemical assays. Photometric methods use the fact that samples with more light-absorbing material transmit less light. Because concentration and absorption are directly related, this makes it possible to measure an unknown sample. The core idea comes from the Beer-Lambert Law. This law states that the concentration of a light-absorbing species is proportional to its absorbance. The video also introduces the Bradford assay...

density gradient ultracentrifugation

Sucrose Gradient Separation in an Ultracentrifuge

Sucrose gradient separation in an ultracentrifuge is a lab method for isolating cell parts and biomolecules. It uses differences in density to make particles sink or rise in a liquid. A high-speed ultracentrifuge speeds up this process so components can be separated without destroying them. The basic idea starts with a suspension, which is particles mixed in a liquid solvent. Particles that are denser than the solvent sediment, while less dense particles float. A rotor inside the...

co-immunoprecipitation and pull-down assays

Co-immunoprecipitation and pull-down assays are laboratory methods used to capture stable protein-protein interactions. Protein-protein interactions help control many biological functions, but many of them have not yet been identified. These assays are related to immunoprecipitation, which isolates a target protein from a mixed sample using an antibody. In co-immunoprecipitation, or CoIP, an antibody binds the target protein, and that protein is already attached to another protein that the...

reconstitution of membrane proteins

Membrane Proteins in Liposome Models

Membrane proteins can be moved into liposome models so their function can be studied outside a cell. Reconstitution means restoring an isolated biomolecule to a working form. For membrane proteins, that usually means placing a purified protein into an artificial lipid membrane. Cell membranes are made mainly of phospholipids and membrane proteins. The phospholipids form a bilayer with hydrophilic phosphate heads facing water and hydrophobic fatty acid tails facing inward. Some membrane...

f&#246;rster resonance energy transfer (fret)

FRET as a Molecular Ruler in Cells

Föster resonance energy transfer, or FRET, is a way to study close-range biochemical interactions using light-emitting molecules. A donor fluorophore can pass energy to an acceptor fluorophore when their emission and absorption spectra overlap. This transfer happens only when the pair is very close together, usually within 10 nm. Because FRET depends on distance, it is often called a molecular or spectroscopic ruler. The strength of the signal is measured as FRET efficiency, which describes...

surface plasmon resonance (spr)

SPR Biosensors for Tracking Binding Kinetics

Surface plasmon resonance, or SPR, is a way to track biomolecular binding on a label-free biosensor. It is used to measure molecular affinity, kinetics, specificity, and concentration. The method works with a thin metal layer on a prism, where changes in reflected light reveal interactions in real time. SPR sensors use a thin layer of a noble metal on the face of a prism. Light is reflected from the prism-metal interface into a photodetector. At one specific angle, called the surface plasmon...

biochemistry

This collection presents commonly used purification methods, such as affinity chromatography, as well as analytical methods, like MALDI-TOF. In addition, the videos showcase methods for assessing biomolecule interaction and function, such as co-immunoprecipitation and metabolic labeling.

Learn how CoIP and pull-down assays capture protein-protein interactions, from bead-based lab steps to examples with influenza proteins and calmodulin.

Protein Interaction Capture Methods in Cells | JoVE K12

Life Science

Structure and Function

HS-LS1-2.

matter-and-energy-in-organisms-and-ecosystems

Matter and Energy in Organisms and Ecosystems

HS-LS1-6.

Overview

Principles of Co-Immunoprecipitation and Pull-Down Assays

Protocol for Co-Immunoprecipitation

Protocol for Pull-Down Assays

Applications

Summary

The Periodic Table

As early chemists discovered more elements, they realized that various elements could be grouped by their similar chemical behaviors. One such grouping ...

Alkali Metals

Group 1 elements are soft and shiny metallic solids. They are malleable, ductile, and good conductors of heat and electricity. The melting points of the ...

Halogens

Group 17 elements, known as halogens, are nonmetals. At room temperature, fluorine and chlorine are gases, bromine is a liquid, and iodine a solid. ...

Noble Gases


The elements in group 18 are noble gases (helium, neon, argon, krypton, xenon, and radon). They earned the name &ldquo;noble&rdquo; because they were ...

Classifying Matter by State

Chemistry is the study of matter and the changes it undergoes. Matter is anything that has mass and occupies space. Matter is all around us; the air, ...

Classifying Matter by Composition

Matter: Pure Substances and Mixtures
According to its composition, the matter can be classified into two broad categories &mdash; pure substances and ...

physical-and-chemical-properties-of-matter

Physical and Chemical Properties of Matter

The characteristics that enable us to distinguish one substance from another are called properties.

Physical Properties of Matter

A physical property is ...

Types of Chemical Bonds

Chemical bonding theories were pioneered by American chemist Gilbert&#xA0;N. Lewis. He developed a model called the Lewis model to explain the type and ...

Lewis Symbols and the Octet Rule

Chemical bonds are complex interactions between two or more atoms or ions, which reduce the potential energy of the molecule. Gilbert N. Lewis developed a ...

Ionic Bonding and Electron Transfer

Ions are atoms or molecules bearing an electrical charge. A cation (a positive ion) forms when a neutral atom loses one or more electrons from its valence ...

The Born-Haber Cycle

Lattice Energy&#xA0;

An ionic compound is stable because of the electrostatic attraction between its positive and negative ions. The lattice energy of a ...

trends-in-lattice-energy-ion-size-and-charge

Trends in Lattice Energy: Ion Size and Charge

An ionic compound is stable because of the electrostatic attraction between its positive and negative ions. The lattice energy of a compound is a measure ...

Covalent Bonding and Lewis Structures

Compared to ionic bonds, which results from the transfer of electrons between metallic and nonmetallic atoms, covalent bonds result from the mutual ...

Electronegativity

Whether a bond is nonpolar or polar covalent is determined by a property of the bonding atoms called electronegativity.&#xA0;

Electronegativity values of ...

Ionization Energy

The amount of energy required to remove the most loosely bound electron from a gaseous atom in its ground state is called its first ionization energy ...

bond-polarity-dipole-moment-and-percent-ionic-character

Bond Polarity, Dipole Moment, and Percent Ionic Character

Bond Polarity

The absolute value of the difference in electronegativity (&Delta;EN) of two bonded atoms provides a rough measure of the polarity to be ...

Electron Affinity

The electron affinity (EA) is the energy change for adding an electron to a gaseous atom to form an anion (negative ion).



This process can be either ...

lewis-structures-of-molecular-compounds-and-polyatomic-ions

Lewis Structures of Molecular Compounds and Polyatomic Ions

To draw Lewis structures for complicated molecules and molecular ions, it is helpful to follow a step-by-step procedure as outlined:


	Determine the ...

assembly-of-a-reflux-system-for-heated-chemical-reactions

Assembly of a Reflux System for Heated Chemical Reactions

Source: Laboratory of Dr. Philip Miller &#8212; Imperial College London
Many chemical experiments require elevated temperatures before any reaction is ...

Resonance

The Lewis structure of a nitrite anion (NO2&minus;) may actually be drawn in two different ways, distinguished by the locations of the N-O and N=O ...

conducting-reactions-below-room-temperature

Conducting Reactions Below Room Temperature

Source: Laboratory of Dr. Dana Lashley - College of William and Mary
Demonstration by: Matt Smith
When new bonds are formed in the course of a chemical ...

Formal Charges

In some cases, there are seemingly more than one valid Lewis structures for molecules and polyatomic ions. The concept of formal charges can be used to ...

Coordination Chemistry Complexes

Source: Laboratory of Dr. Neal Abrams &#8212; SUNY College of Environmental Science and Forestry
Transition metals are found everywhere from vitamin ...

Exceptions to the Octet Rule

Many covalent molecules have central atoms that do not have eight electrons in their Lewis structures. These molecules fall into three categories:


	...

determining-rate-laws-and-the-order-of-reaction

Determining Rate Laws and the Order of Reaction

Source: Laboratory of Dr. Neal Abrams &#8212; SUNY College of Environmental Science and Forestry
All chemical reactions have a specific rate defining the ...

Bond Energies and Bond Lengths

Stable molecules exist because covalent bonds hold the atoms together. The strength of a covalent bond is measured by the energy required to break it, ...

Determining the Empirical Formula

Source: Laboratory of Dr. Neal Abrams - SUNY College of Environmental Science and Forestry
Determining the chemical formula of a compound is at the heart ...

Bonding in Metals

Metallic bonds are formed between two metal atoms. A simplified model to describe metallic bonding has been developed by Paul Dr&#xFC;de called the ...

determining-the-solubility-rules-of-ionic-compounds

Determining the Solubility Rules of Ionic Compounds

Source: Laboratory of Dr. Neal Abrams &#8212; SUNY College of Environmental Science and Forestry
An ionic compound&#39;s solubility can be determined via ...

atomic-radii-and-effective-nuclear-charge

Atomic Radii and Effective Nuclear Charge

The elements in groups of the periodic table exhibit similar chemical behavior. This similarity occurs because the members of a group have the same number ...

Introduction to Catalysis

Source: Laboratory of Dr. Ryan Richards &#8212; Colorado School of Mines
Catalysis is among the most important fields of modern technology and presently ...

Ionic Radii

Ionic radius is the measure used to describe the size of an ion. A cation always has fewer electrons and the same number of protons as the parent atom; it ...

Introduction to Titration

Source: Laboratory of Dr. Yee Nee Tan &#8212; Agency for Science, Technology, and Research
Titration is a common technique used to quantitatively ...

Le Ch&#226;telier's Principle

Source: Laboratory of Dr. Lynne O&#39;Connell &#8212; Boston College
When the conditions of a system at equilibrium are altered, the system responds in ...

preparing-anhydrous-reagents-and-equipment

Preparing Anhydrous Reagents and Equipment

Source: Laboratory of Dr. Dana Lashley - College of William and Mary
Demonstrated by: Timothy Beck and Lucas Arney
Many reactions in organic chemistry are ...

Proton Exchange Membrane Fuel Cells

Source: Laboratories of Margaret Workman and Kimberly Frye - Depaul University
The United States consumes a large amount of energy &#8211; the current ...

Solutions and Concentrations

Source: Laboratory of Dr. Michael Evans &#8212; Georgia Institute of Technology
A solution is a homogeneous mixture containing some components in small ...

spectrophotometric-determination-of-an-equilibrium-constant

Spectrophotometric Determination of an Equilibrium Constant

Source: Laboratory of Dr. Michael Evans &#8212; Georgia Institute of Technology
The equilibrium constant, K, for a chemical system is the ratio of product ...

using-differential-scanning-calorimetry-to-measure-changes-in-enthalpy

Using Differential Scanning Calorimetry to Measure Changes in Enthalpy

Source: Laboratory of Dr. Terry Tritt &#8212; Clemson University
Differential Scanning Calorimetry (DSC) is a method of thermodynamic analysis based on ...

Schlenk Lines Transfer of Solvents

Source: Hsin-Chun Chiu and Tyler J. Morin, laboratory of Dr. Ian Tonks&#8212;University of Minnesota Twin Cities
Schlenk lines and high vacuum lines are ...

Construct and revise an explanation for the outcome of a simple chemical reaction based on the outermost electron states of atoms, trends in the periodic table, and knowledge of the patterns of chemical properties.

HS-PS1-2.

Chemical Equations

Chemical equations represent the identities and relative quantities of substances involved in a chemical reaction. The substances undergoing reaction are ...

Chemical Reactions in Aqueous Solutions

Chemical substances interact in many different ways. Certain chemical reactions exhibit common patterns of reactivity. Due to the vast number of chemical ...

Precipitation Reactions

In a precipitation reaction, aqueous solutions of soluble salts react to give an insoluble ionic compound &#x2013; the precipitate. The reaction occurs ...

Oxidation-Reduction Reactions

Oxidation&ndash;Reduction Reactions

Earth&rsquo;s atmosphere contains about 20% molecular oxygen, O2, a chemically reactive gas that plays an essential ...

Oxidation Numbers

In redox reactions, the transfer of electrons occurs between reacting species. Electron transfer is described by a hypothetical number called the ...

Acids, Bases and Neutralization Reactions

An acid-base reaction is one in which a hydrogen ion, H+, is transferred from one chemical species to another. Such reactions are of central importance to ...

Synthesis and Decomposition Reactions

Synthesis and decomposition are two types of redox reactions. Synthesis means to make something, whereas decomposition means to break something. The ...

Develop a model to illustrate that the release or absorption of energy from a chemical reaction system depends upon the changes in total bond energy.

HS-PS1-4.

Reaction Rate

The rate of reaction is the change in the amount of a reactant or product per unit time. Reaction rates are therefore determined by measuring the time ...

Measuring Reaction Rates

Polarimetry finds application in chemical kinetics to measure the concentration and reaction kinetics of optically active substances during a chemical ...

Concentration and Rate Law

The rate of a reaction is affected by the concentrations of reactants. Rate laws (differential rate laws) or rate equations are mathematical expressions ...

Apply scientific principles and evidence to explain how the rate of a physical or chemical change is affected when conditions are varied.

Protein Interaction Capture Methods in Cells

Description

Transcript

Tags

More videos by Standards