تحليل عزل الحمض النووي وتحليل إنزيم التقييد
- عزل الحمض النووي
- ملاحظة: في هذه التجربة ، ستقوم بعزل الحمض النووي في ظل شرطين تجريبيين: أحدهما باستخدام مخزن مؤقت يحتوي على المنظف SDS والآخر بدون منظف. الفرضيات: قد تكون الفرضية البديلة لهذه التجربة هي أن العينة المحضرة بدون SDS ، وهو منظف أنيوني قوي يكسر أغشية الخلايا ، ستنتج حموضا نويا أقل من العينة المحضرة باستخدام SDS. قد تكون الفرضية الصفرية لهذه التجربة هي أن كلتا العينتين ستحصلان على كمية متساوية من الحمض النووي.
- للبدء في جمع عينة من الأنسجة لعزل الحمض النووي. هنا سوف تستخدم خلايا الخد الخاصة بك. استخدم عصا المصاصة لكشط الأجزاء الداخلية من خديك لمدة 30 ثانية تقريبا.
- ضع قمعا في أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
- ثم خذ 10 مل من محلول ملحي 1٪ المقدم لك في كوب مكتوب عليه وحركه في فمك دون ابتلاع.
- استمر في المضمضة لمدة 90 ثانية ثم بصق المحلول الملحي الذي يحتوي على خلايا خدك في القمع لتتجمع في الأنبوب المخروطي.
- بعد ذلك ، قم بتسمية أنبوبين فارغين للطرد المركزي بالأحرف الأولى من اسمك.
- قم بتسمية أحد الأنابيب على أنه + SDS والآخر على أنه -SDS للتمييز بين العلاجين.
- ثم أضف 1.5 إلى 2 مل من المحلول الملحي الذي يحتوي على خلايا الخد إلى كل أنبوب.
- قم بتدوير الأنابيب في جهاز طرد مركزي دقيق لمدة 30 ثانية.
- قم بإزالة الأنابيب من جهاز الطرد المركزي الدقيق واسكب المادة الطافية بعناية دون إزعاج الخلايا المجمعة في الجزء السفلي من كل أنبوب.
- املأ الأنابيب بمزيد من المحلول الملحي الذي يحتوي على خلايا الخد وكرر الطرد المركزي.
- كرر هذه العملية مع الحرص على توزيع الخلايا بالتساوي بين أنابيب + SDS و -SDS حتى يتم جمع جميع خلايا الخد.
- بعد ذلك ، أضف 1 مل من المخزن المؤقت للتحلل الذي يحتوي على SDS إلى الأنبوب المميز على أنه + SDS ، ثم أعد تعليق حبيبات الخلية عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل.
- ثم أضف 1 مل من المخزن المؤقت للتحلل بدون SDS إلى الأنبوب المميز ب -SDS وأعد تعليق حبيبات الخلية عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل.
- بعد ذلك ، أضف 10 ميكرولتر من البروتيناز K إلى كل أنبوب ثم ضع الأنابيب بعناية في حمام مائي 56 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- بعد 10 دقائق ، قم بإزالة الأنابيب بعناية من الحمام المائي وأضف 100 ميكرولتر من 2.5 م كلوريد الصوديوم إلى كل أنبوب.
- أغلق الأنابيب بإحكام واقلبها عدة مرات للخلط.
- بعد ذلك ، قم بتسمية أنبوب مخروطي سعة 15 مل على أنه + SDS وآخر ب -SDS.
- صب محتويات كل أنبوب طرد مركزي دقيق في الأنبوب المخروطي المقابل 15 مل.
- احصل على كمية واحدة سعة 10 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ من الفريزر.
- أمسك أحد الأنابيب المخروطية بزاوية وقم بتوزيع 1 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ ببطء في الأنبوب لتشكيل طبقة فوق السائل الموجود بالفعل في الأنبوب.
- كرر هذه العملية للأنبوب المخروطي الثاني.
- انظر الآن إلى كلا الأنبوبين الخاص بك. يجب أن يكون هناك راسب خيطي موجود في واجهة الإيثانول والطبقة المائية تحته. تحتوي هذه المادة الخيطية على الحمض النووي المعزول. التقط صورا للحمض النووي في الأنبوب وقم بعمل ملاحظات وصفية ورسومات واضحة لملاحظاتك في دفتر ملاحظاتك.
- باستخدام قضيب تحريك زجاجي ، التقط الحمض النووي من أنبوب + SDS وفحصه. كرر هذا لأنبوب -SDS ، وسجل ملاحظاتك مرة أخرى. لاحظ ما إذا كان أحد الأنابيب يبدو أنه يحتوي على رواسب أكثر من الآخر ، ولماذا قد يكون هذا.
- أخيرا ، تخلص من جميع النفايات السائلة في حاوية النفايات المناسبة وأعد جميع الأدوات إلى مواقعها المناسبة في المختبر.
- إنزيم التقييد الملخص الافتراضي
- لدراسة كيفية عمل إنزيمات التقييد، انتقل أولا إلى موقع New England Biolabs على الويب: https://www.neb.com/
- تسمح الموارد المتاحة في هذا الموقع للباحثين بإجراء تجارب افتراضية قبل إجرائها في المختبر. انقر فوق "الأدوات والموارد" للعثور على أداة NEBcutter وافتح البرنامج.
- على يمين مربع البحث ، ابحث عن القائمة التي تقول "فيروس + عاثية". من تلك القائمة حدد Lambda. هذا هو اسم الحمض النووي الذي ستهضمه. حدد الخيار الخطي حيث تقول الأداة "التسلسل هو" وخيار "إنزيمات NEB" حيث تقول الأداة ، "الإنزيمات المراد استخدامها". ثم انقر فوق إرسال.
- ستعرض الصفحة التالية خريطة تقييد كاملة للحمض النووي لامدا. يمكن استخدام خريطة التقييد هذه للتنبؤ بما سيحدث إذا تم استخدام إنزيمات معينة. بعد ذلك ، انقر فوق "ملخص مخصص" تحت عنوان "الخيارات الرئيسية".
- ابحث عن إنزيم StuI ولاحظ أنه يعمل على النحو الأمثل في المخزن المؤقت 2.1 أو CS المؤقت. حدد إنزيم StuI وانقر فوق الملخص.
- في النافذة التالية ، انقر فوق "عرض الجل" أسفل عنوان "الخيارات الرئيسية". حدد خيار تشغيل هلام ظاهري 1٪ باستخدام ملخص pBR322-BstN1.
- بعد ظهور النتائج ، التقط لقطة شاشة والصقها في مستند فارغ.
- بعد ذلك ، انتقل مرة أخرى إلى الصفحة الرئيسية لأداة NEBcutter وحدد "ملخص مخصص جديد".
- هذه المرة ابحث عن إنزيم BsrGI ولاحظ أنه يعمل على النحو الأمثل في المخزن المؤقت 2.1 أو المخزن المؤقت 3.1. حدد الإنزيم وانقر فوق الملخص.
- ضمن رأس الخيارات الرئيسية ، انقر فوق "عرض الجل" وحدد الخيارات لتشغيل هلام افتراضي بنسبة 1٪ باستخدام ملخص pBR322-BstN1.
- التقط لقطة شاشة للنتائج واحفظها في مستند نصي.
- أخيرا ، كرر هذه الخطوات باستخدام كل من StuI و BsrGI معا في ملخص واحد.
- مرة أخرى ، التقط لقطة شاشة واحفظ الجل الناتج.
- تنميط الحمض النووي
- قبل البدء في هضم إنزيم التقييد ، ضع أولا حصصك من الحمض النووي لامدا ، و NEB buffer 2.1 ، وإنزيم StuI ، وإنزيم BsrGI في دلو ثلج ، وخذها إلى منطقة عملك.
- قم بتسمية الأنبوب باسم StuI - سيحتوي هذا على ملخص StuI.
- قم بتسمية الأنبوب باسم BsrGI لاحتواء ملخص BsrGI.
- بعد ذلك ، قم بتسمية أنبوب S + B ، لاحتواء الهضم مع كلا الإنزيمين.
- استخدم الماصات الدقيقة المناسبة لإعداد التفاعلات المدرجة في الجدول 1: انقر هنا لتنزيل الجدول 1
- أولا، قم بإدخال 40 ميكرولتر من الماء في كل أنبوب.
- بعد ذلك، باستخدام طرف ماصة جديد في كل مرة، قم بتوزيع 5 ميكرولتر من المخزن المؤقت 2.1 في كل أنبوب والماصة لأعلى ولأسفل للخلط.
- بعد ذلك ، أضف 4 ميكرولتر من حمض نووي لامدا إلى كل أنبوب ، ثم قم بإدخال 0.5 ميكرولتر من كل إنزيم في الأنابيب المناسبة.
- أخيرا ، أضف كمية كافية من الماء إلى كل أنبوب ليصل الحجم الإجمالي إلى 50 ميكرولتر.
- بعد ذلك ، قم باحتضان الأنابيب عند 37 درجة مئوية لمدة 15-60 دقيقة في حمام مائي ، وأعد المخازن المؤقتة والإنزيمات إلى الفريزر.
- لتحضير جل الاغاروز لتشغيل الهضم ، في قارورة سعة 250 مل ، اخلطي 1 جم من مسحوق الاغاروز مع 100 مل من محلول TAE.
- قم بتسخين المحلول في الميكروويف لمدة 90 ثانية تقريبا بكامل طاقته ، مع الحرص على منع المحلول من الغليان.
- بعد ذلك ، قم بإزالة المحلول بحذر من الميكروويف باستخدام قفاز أو وسادة حرارية وضعه ليبرد لمدة 15 دقيقة تقريبا.
- بينما يبرد محلول الاغاروز ، قم بإعداد صينية صب.
- عندما يبرد محلول الاغاروز ، أضف 5 ميكرولتر من صبغة الجل الآمنة 10,000X SYBR إلى المحلول.
- أضف المشط المستخدم في صنع آبار الجل إلى صينية الصب لجهاز الرحلان الكهربائي للهلام.
- صب محلول هلام الاغاروز في صينية الصب واتركه يتصلب.
- بمجرد أن يصبح الجل صلبا ، اسحب المشط لأعلى بشكل مستقيم لإزالته من الجل ، ثم قم بإزالة السدود من صينية الصب إذا كان ذلك مناسبا.
- ضع الجل في غرفة الرحلان الكهربائي مع وضع الآبار بالقرب من القطب السالب أو الأسود واملأ الغرفة بمخزن مؤقت 1x TAE لتغطية الجل بالكامل.
- أخرج عيناتك من الحمام المائي.
- ثم أضف 8.3 ميكرولتر من صبغة التحميل 6X إلى كل عينة.
- قم بتوزيع 10 ميكرولتر من هضم pBR322-BstN1 الذي يحتوي على شظايا الحمض النووي ذات الحجم المعروف في البئر الأول.
- ثم قم بتحميل 25 ميكرولتر من عينة StuI في البئر الثاني.
- ضع 25 ميكرولتر من عينة BsRGI في البئر الثالث.
- قم بتحميل 25 ميكرولتر من العينة S + B في البئر الرابع.
- لتشغيل الجل ، قم بتوصيل الأسلاك في غرفة الرحلان الكهربائي ثم في مصدر الطاقة. يجب أن يكون الرصاص الموجب الأحمر في النهاية بعيدا عن الآبار ويجب أن يكون الرصاص السالب الأسود الأقرب إلى الآبار. وذلك لأن العينات ستعمل من سالبة إلى موجبة.
- قم بتشغيل مصدر الطاقة واضبط صندوق الجل على العمل عند 170 فولت لمدة 60 دقيقة تقريبا.
- بعد اكتمال التشغيل ، قم بإيقاف تشغيل صندوق الجل وافصل الأقطاب الكهربائية عن الخزان.
- ثم قم بإزالة الجل من غرفة الرحلان الكهربائي وراقبه باستخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية. تنبيه: احم العينين من الأشعة فوق البنفسجية عن طريق ارتداء نظارات واقية أو استخدام الدرع المرفق.
- أخيرا ، استخدم كاميرا الهاتف الخلوي لالتقاط صورة للهلام من أعلى سطح الهلام مباشرة وبالتوازي معه.
- النتائج
- قارن الجل الذي قمت بتشغيله في المختبر بملخصك الأنزيمي الافتراضي باستخدام StuI.
- نتج عن الملخص الافتراضي مع StuI سبع نطاقات. احسب العصابات الموجودة في ممر StuI للهلام الخاص بك ولاحظ ما إذا كان هذا يتطابق مع الملخص الافتراضي أو يبدو أنه يظهر نمطا مشابها. ملاحظة: غالبا ما تكون العصابات الصغيرة على المواد الهلامية للرحلان الكهربائي غير مرئية.
- انظر الآن إلى نتائج ملخص BsrGI الخاص بك. نتج عن الملخص الافتراضي مع BsrGI ستة نطاقات. عد العصابات في حارة BsrGI. مرة أخرى ، لاحظ ما إذا كان الملخص الافتراضي والملخص المختبري أظهرا نفس النمط أو نمطا مشابها.
- أخيرا ، انظر إلى الملخص الافتراضي مع StuI و BsrGI. نتج عن الملخص الافتراضي مع كلا الإنزيمين 12 نطاقا. احسب العصابات في الممر المقابل للهلام الخاص بك ، وفكر فيما إذا كان نمط ربط الحمض النووي يبدو مشابها للملخص الافتراضي.
Q1: Why is SDS used in the DNA isolation lysis buffer?
SDS is a strong anionic detergent that breaks apart cell membranes, allowing cells to lyse and release their DNA. The experiment compares DNA yield from samples prepared with and without SDS to demonstrate how detergent enhances cell membrane disruption and DNA recovery from cheek cells.
Q2: What is the purpose of proteinase K in DNA isolation?
Proteinase K is an enzyme that digests proteins associated with DNA, including histones and other cellular proteins. Adding proteinase K and incubating samples at 56°C for 10 minutes helps purify the DNA by removing protein contaminants that would otherwise interfere with downstream analysis.
Q3: How does ethanol precipitation isolate DNA from solution?
Ethanol is a nonpolar solvent that causes DNA to become insoluble and precipitate out of the aqueous solution. When 100% ethanol is carefully layered over the cell lysate, stringy DNA precipitate forms at the interface between the ethanol and aqueous layers, allowing visual isolation and collection of the DNA.
Q4: What does a restriction enzyme digest reveal about DNA structure?
Restriction enzymes cut DNA at specific recognition sequences, producing fragments of predictable sizes. By comparing virtual digests to actual gel results, students can verify enzyme specificity and understand how restriction enzyme analysis identifies DNA sequences and creates unique banding patterns for DNA profiling.
Q5: Why are different buffers required for different restriction enzymes?
Restriction enzymes have optimal pH and salt conditions for catalytic activity. StuI works optimally in buffer 2.1 or CS buffer, while BsrGI performs best in buffer 2.1 or buffer 3.1. Using the correct buffer ensures maximum enzyme efficiency and accurate DNA digestion results during restriction enzyme analysis.
Q6: How does gel electrophoresis separate DNA fragments by size?
DNA fragments migrate through an agarose gel matrix when an electric current is applied, with smaller fragments moving faster toward the positive electrode than larger ones. After staining with SYBR Safe dye and UV visualization, distinct bands appear representing DNA fragments of different sizes, allowing comparison between single and double enzyme digests.
Q7: What does combining two restriction enzymes in a single digest demonstrate?
Using both StuI and BsrGI together produces more DNA fragments than either enzyme alone, demonstrating additive cutting at different recognition sites. The virtual digest with both enzymes yields 12 bands compared to 7 for StuI and 6 for BsrGI, illustrating how multiple restriction sites create unique DNA profiles for identification purposes.