What materials do you need to set up a bacterial transformation lab?

Each workstation requires an ice bucket, tube rack, two sterile 1.5 mL tubes, two 1 mL aliquots of SOC media, competent E. coli cells, a plasmid tube, LB agar plates, and LB agar ampicillin plates. You'll also need appropriate pipettes, a water bath set to 42°C, and a temperature-controlled shaker at 37°C for the bacterial transformation using plasmids procedure.

Why do competent E. coli cells need to be kept on ice during bacterial transformation?

Competent cells must remain on ice to maintain their ability to take up plasmid DNA. Cold temperatures preserve cell membrane permeability and prevent premature DNA uptake. Once thawed, the cells are placed in the ice bucket until they're ready for the heat shock step at 42°C.

What is the purpose of SOC media in bacterial transformation?

SOC media provides nutrients that allow transformed bacteria to recover and express antibiotic resistance genes after the heat shock. The two 1 mL aliquots are used to culture the cells at 37°C in the temperature-controlled shaker, enabling them to survive selection on ampicillin plates.

How do LB agar and LB agar ampicillin plates differ in bacterial transformation?

LB agar plates support growth of all bacteria, serving as a control to verify cell viability and transformation efficiency. LB agar ampicillin plates contain antibiotic that kills non-transformed cells, allowing only bacteria that successfully incorporated the plasmid to survive and form colonies on selective media.

What temperature conditions are critical for successful bacterial transformation?

Two temperatures are essential: 42°C for the heat shock step, which facilitates plasmid DNA entry into competent cells, and 37°C for the temperature-controlled shaker during recovery in SOC media. These precise temperatures ensure optimal transformation efficiency, cell survival, and gene expression.

Why is the plasmid tube stored in an ice bucket before transformation?

The plasmid tube is kept in the ice bucket to prevent DNA degradation and maintain its integrity before introduction into competent cells. Cold temperatures preserve plasmid stability and ensure the DNA remains viable for successful uptake during the transformation process.

التحول البكتيري

المفاهيم تحضير المدرّس بروتوكول الطالب

0 مشاهدات04:33 د

في أوائل القرن العشرين ، كان عالم بكتيريا بريطاني يدعى فريدريك جريفيث يعمل مع البكتيريا المسببة للالتهاب الرئوي المكورات العقدية الرئوية . أجرى تجربة بسيطة باستخدام سلالتين مختلفتين. تعرف سلالة واحدة باسم سلالة S بسبب كبسولة واقية تجعل المستعمرات أو الكتل التي تشكلها تبدو ناعمة ، كما تجعلها خبيثة أو ضارة. والثاني كان سلالة R ، وهي نسخة من البكتيريا التي تفتقر إلى الكبسولة الواقية ، مما يمنح المستعمرات مظهرا خشنا ويجعلها غير خبيثة.

أولا ، أخذ جريفيث بعضا من بكتيريا السلالة S وقام بتسخينها ، مما أدى إلى إنتاج نسخة مقتولة بالحرارة من سلالة S. ثم جمع بعض الفئران وقسمها إلى أربع مجموعات. قام بحقن المجموعة الأولى بسلالة S الخبيثة ، والثانية بسلالة R غير الخبيثة. قام بجرعات المجموعة الثالثة بسلالة S المقتولة بالحرارة ، وأخيرا ، تم الجمع بين سلالة S المقتولة بالحرارة وسلالة R معا ، وحقن هذا المزيج في المجموعة الرابعة. كما هو متوقع ، ماتت الفئران في المجموعة الأولى ، وعاشت الفئران في المجموعة الثانية والثالثة. لكن لدهشة جريفيث ، ماتت الفئران في المجموعة الأخيرة أيضا.

عندما نشر دراسته في عام 1928 ، أطلق على هذا التحول الغامض للعملية ، حيث تكهن بوجود مبدأ تحويل أساسي ، مما سمح للسلالة غير الخبيثة سابقا بأن تصبح قاتلة. في وقت لاحق ، في عام 1943 ، أفاد أفيرت وماكلويد ومكارتي أن هذا المبدأ المحول كان على الأرجح حمض الديسوكسي ريبونوكلييك ، أو الحمض النووي ، الذي نعرف الآن أنه مادة الوراثة. ما حدث في تجربة جريفيث بشكل أساسي هو أنه عندما تم دمج البكتيريا ، تسرب بعض الحمض النووي من سلالة S المقتولة بالحرارة إلى خلايا سلالة R ، مما أدى إلى تحويل هذه البكتيريا غير الخبيثة ونقل المعلومات لصنع الكبسولة الواقية ، وتحويل سلالة R إلى سلالة خبيثة ، قادرة الآن على قتل في المجموعة الرابعة.

تقدم سريعا إلى اليوم ، طور العلماء طريقة أبسط بكثير لدراسة التحول البكتيري ، باستخدام بكتيريا الإشريكية القولونية وحلقات دائرية صغيرة من الحمض النووي تسمى البلازميدات. عادة ما يشتمل البلازميد المستخدم في تجارب التحويل على جين لوظيفة خاصة ، مثل مقاومة المضادات الحيوية. الإشريكية القولونية هي موضوع ممتاز للتحول لأنها يمكن أن تعرض خاصية تسمى الكفاءة ، وهي القدرة على امتصاص الحمض النووي من البيئة. بشكل أساسي ، هذا يعني أنه في ظل ظروف بيئية معينة ، مثل مادة كيميائية أو صدمة كهربائية أو حرارية ، يمكن أن يصبح جدار الخلية ل بكتريا قولونية قابلا للاختراق مؤقتا ويسمح بامتصاص الحمض النووي من البيئة. بمجرد أن يكون البلازميد داخل الإشريكية القولونية ، يمكن أن يتسكع في سيتوبلازم الخلية المضيفة الجديدة ويمكن تكراره والتعبير عنه عبر عبر الأجيال جنبا إلى جنب مع الجينوم ، أو قد يدمج نفسه بالكامل في جينوم المضيف. إذا فقدت البكتيريا البلازميد في أي وقت ، فستفقد الخلية أيضا مقاومتها للمضادات الحيوية ، وبالتالي يزرع العلماء البكتيريا في وسط يحتوي على المضاد الحيوي للتأكد من أن الناجين الوحيدين هم أولئك الذين يحتوون على البلازميد المهم.

في هذا المختبر ، سوف تتعلم كيفية تحويل خلايا بكتيريا قولونية باستخدام بلازميد يحتوي على جين مقاوم للمضادات الحيوية ، أثناء ممارسة التقنيات الميكروبيولوجية المعقمة.