Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
المصدر: سماء كريم من جامعة جونز هوبكنز ، دكتوراه في الطب ، الولايات المتحدة الأمريكية
في الجزء الأول من هذه التجربة ، ستقوم بإعداد محلول فوسفات الصوديوم مخزن عند درجة الحموضة 7.0. فوسفات أحادي الصوديوم هو حمض ضعيف مع القاعدة المترافقة ، فوسفات ثنائي الصوديوم. عادة ما يكون لمحاليل الفوسفات أحادية الصوديوم غير المعدلة درجة حموضة تتراوح بين 4 و 6.
تكونالمخازن المؤقتة أكثر فاعلية بالقرب من pKa ، والتي تتراوح من 6.8 إلى 7.2 للفوسفات أحادي الصوديوم. لذلك ، ستستخدم هيدروكسيد الصوديوم لدفع التوازن نحو القاعدة المترافقة دون تغيير التركيب الكلي لتوازن المخزن المؤقت.
يمكن استخدام المخازن المؤقتة لتقييم المركبات عند قيم الأس الهيدروجيني المحددة. في هذا القسم ، ستسجل طيف امتصاص المؤشر الأحمر المحايد في مخازن مؤقتة مختلفة. الشكل البروتوني للأحمر المحايد أحمر ، والشكل منزوع البروتون هو الأصفر البرتقالي ، مما يعني أنها تمتص الضوء الأخضر والأزرق البنفسجي ، على التوالي. وبالتالي ، فإن الأشكال الحمضية والأساسية لها أطوال موجية لامتصاص مميزة. يغير ارتباط البروتين خصائص اللون الأحمر المحايد ، مما يغير كل من امتصاصه و pKa.
بعد قياس طيف امتصاص اللون الأحمر المحايد الحر عند عدة قيم الأس الهيدروجيني ، ستضيف بروتين مرتبط بالريبوفلافين ، أو RP ، إلى المحاليل وقياس الامتصاص مرة أخرى. ترتبط شدة الامتصاص بالتركيز ، لذلك ستستخدم الأطياف لتحديد pKa للأحمر المحايد الحر والمرتبط بعد المختبر.
الآن ، دعونا نحلل بيانات الامتصاص لتحديد pKa للأحمر المحايد.
في الجزء الأول من هذه التجربة ، ستقوم بإعداد محلول فوسفات الصوديوم مخزن عند درجة الحموضة 7.0. فوسفات أحادي الصوديوم هو حمض ضعيف مع فوسفات ثنائي الصوديوم المترافق القاعدة. عادة ما يكون لمحاليل الفوسفات أحادية الصوديوم غير المعدلة درجة حموضة تتراوح من 4 إلى 6.
تكون المخازن المؤقتة أكثر فاعلية بالقرب من pKa ، والتي تتراوح من 6.8 إلى 7.2 للفوسفات أحادي الصوديوم. لذلك ، ستستخدم هيدروكسيد الصوديوم لدفع التوازن نحو القاعدة المترافقة دون تغيير التركيب الكلي لتوازن المخزن المؤقت. قبل البدء في المختبر ، احسب كتلة الفوسفات أحادي الصوديوم التي ستحتاجها لصنع 200 مل من محلول 50 ملليمول.
يستخدم هذا القسم من المختبر هيدروكسيد الصوديوم ، وهو مادة أكالة وسامة. توخي الحذر عند صب ونقل هيدروكسيد الصوديوم. الآن ، دعنا نبدأ.
أولا ، ارتد معطف المختبر ونظارات السلامة المقاومة للرذاذ وقفازات النتريل. بعد ذلك ، املأ زجاجة غسيل بلاستيكية سعة 250 مل بالماء منزوع الأيونات. قم بتسمية كوبين سعة 100 مل للنفايات المائية المحايدة والأساسية ، على التوالي.
بعد ذلك ، قم بمعايرة مقياس الأس الهيدروجيني باستخدام المخازن المؤقتة المتوفرة. قم بتخزين المسبار في محلول التخزين الخاص به عند الانتهاء. الآن ، أحضر دورق سعة 400 مل إلى منطقة الميزان التحليلي للحصول على فوسفات أحادي الصوديوم الذي ستحتاجه.
قم بتركيب قطعة من ورق الوزن واستخدم ملعقة نظيفة لقياس الكمية المطلوبة من فوسفات أحادي الصوديوم وفقا لحساباتك. يمتص فوسفات أحادي الصوديوم الرطوبة من الهواء ، لذا اعمل بسرعة للحصول على قياس دقيق ، وأغلق الحاوية بإحكام عند الانتهاء منها. سجل الكمية الدقيقة من فوسفات أحادي الصوديوم التي تقيسها في دفتر المختبر الخاص بك.
ثم ضع الفوسفات أحادي الصوديوم في الدورق ونظف الملعقة بمنديل معملي. تخلص من ورق الوزن ومسح المختبر قبل العودة إلى غطاء الدخان. الآن ، استخدم أسطوانة متدرجة لقياس 175 مل من الماء منزوع الأيونات.
صب الماء في دورق الفوسفات أحادي الصوديوم وأضف شريط تحريك مغناطيسي. قلب المحلول على طبق تحريك حتى يذوب الملح تماما ويبدو المحلول متجانسا. يستغرق هذا عادة من دقيقتين إلى ثلاث دقائق.
ثم قم بقياس 15 مل من الماء منزوع الأيونات باستخدام أسطوانة متدرجة. صب الماء منزوع الأيونات في الدورق واستمر في تقليب المحلول حتى يبدو متجانسا مرة أخرى ، والذي يستغرق عادة من دقيقة إلى دقيقتين. ثم قم بإيقاف تشغيل محرك التقليب.
اشطف مسبار الأس الهيدروجيني بالماء منزوع الأيونات ، ثم ثبته في المحلول باستخدام المستشعر فوق قضيب التقليب. الآن ، أحضر أسطوانة متدرجة سعة 10 ملليلتر وزجاج ساعة إلى غطاء التوزيع ، وقم بقياس 10 مل من 1 هيدروكسيد الصوديوم المولي. قم بتغطية هيدروكسيد الصوديوم بزجاج الساعة ، وأحضره بحذر إلى غطاء الدخان.
لاحظ الحجم الدقيق في الأسطوانة المتدرجة. ثم استأنف تقليب محلول الفوسفات أحادي الصوديوم. أثناء مراقبة قراءة الأس الهيدروجيني ، استخدم ماصة يمكن التخلص منها لإضافة هيدروكسيد الصوديوم ببطء إلى محلول التحريك بطريقة قطرية.
بمجرد أن يصل الرقم الهيدروجيني المؤقت إلى 7.0، أعد أي هيدروكسيد صوديوم لا يزال في الماصة إلى الأسطوانة المتدرجة. بعد ذلك، احسب حجم هيدروكسيد الصوديوم الذي أضفته من الحجمين الأولي والأخير في الأسطوانة المتدرجة. اطرح هذا الحجم من 10 ملليلتر لتحديد كمية الماء منزوع الأيونات التي يجب إضافتها إلى المخزن المؤقت للوصول إلى حجم المحلول الإجمالي البالغ 200 ملليلتر.
قم بقياس الماء منزوع الأيونات الذي تحتاجه باستخدام أسطوانة أخرى متدرجة سعة 10 ملليلتر وأضفها إلى محلول التحريك لإنهاء صنع المخزن المؤقت. اشطف مستشعر الأس الهيدروجيني بالماء منزوع الأيونات ، وقم بتغطيته بالغطاء المملوء بمحلول التخزين ، وافصل المسبار أو إيقاف تشغيله. بعد ذلك ، قم بتسمية زجاجة البولي إيثيلين سعة 250 مليلتر على أنها 50 مللي مولار من الفوسفات أحادي الصوديوم ، الرقم الهيدروجيني 7.0 'استخدم الملقط لاسترداد قضيب التحريك المغناطيسي من المحلول.
ثم ضع قمعا في فم الزجاجة واسكب المحلول العازل في الزجاجة. قم بإزالة القمع وقم بتغطية الزجاجة بإحكام. أنت الآن جاهز للانتقال إلى قسم التحليل الطيفي للامتصاص.
يمكن استخدام المخازن المؤقتة لتقييم المركبات عند قيم الأس الهيدروجيني المحددة. في هذا القسم ، ستسجل طيف امتصاص المؤشر الأحمر المحايد في مخازن مؤقتة مختلفة. الشكل البروتوني للأحمر المحايد أحمر ، والشكل منزوع البروتون هو الأصفر البرتقالي ، مما يعني أنها تمتص الضوء الأخضر والأزرق البنفسجي ، على التوالي.
وبالتالي ، فإن الأشكال الحمضية والأساسية لها أطوال موجية لامتصاص مميزة. يغير ارتباط البروتين خصائص اللون الأحمر المحايد ، مما يغير كل من امتصاصه و pKa. بعد قياس طيف امتصاص اللون الأحمر المحايد الحر عند عدة قيم الأس الهيدروجيني ، ستضيف بروتين مرتبط بالريبوفلافين ، أو RP ، إلى المحاليل وقياس الامتصاص مرة أخرى.
ترتبط شدة الامتصاص بالتركيز ، لذلك ستستخدم الأطياف لتحديد pKa للأحمر المحايد الحر والمرتبط بعد المختبر. قبل البدء في هذا القسم ، ارسم جدولا في دفتر المختبر الخاص بك ، مع سرد رقم الكوفيت ، ودرجة الحموضة العازلة ، والامتصاص في lambda max للحصول على اللون الأحمر المحايد البروتوني المجاني ، والامتصاص عند lambda max للأحمر المحايد البروتوني المرتبط. قم بترقيم الكوفيتات من 1 إلى 10 وقم بإدراج قيم الأس الهيدروجيني التسع للمخزن المؤقت التي ستستخدمها.
ستكون الكوفيت العاشرة عبارة عن ماء منزوع الأيونات. أمسك الكوفيت دائما من الجوانب المزخرفة وامسح الجوانب الشفافة قبل وضع الكوفيت في مقياس الطيف الضوئي مباشرة. تذكر محاذاة الجوانب الشفافة مع شعاع الضوء في مقياس الطيف الضوئي.
الآن ، دعنا نبدأ. احصل على عشرة أغطية وأغطية سعة 1.5 ملليلتر ، وقم بتسمية الأغطية من 1 إلى 10 لتتناسب مع الجدول الموجود في دفتر ملاحظات المختبر. قم بتسمية دورق سعة 25 مل على أنه DIH2O'واملأه بالماء منزوع الأيونات.
بعد ذلك ، قم بالتخلص من النفايات المائية المحايدة في البالوعة ، وأعد تسمية الدورق على أنه نفايات عازلة مائية ، كما قم بتسمية دورق سعة 400 مل لأطراف الماصة الدقيقة المستخدمة. بعد ذلك ، قم بتوصيل طرف بماصة دقيقة سعة 1 مليلتر ، واستخدمه لتوزيع 1000 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات في كوفيت 10. سيكون هذا هو المذيب الفارغ.
الآن ، أخرج الطرف ، واضبط الماصة الدقيقة على توزيع 925 ميكرولتر ، وقم بإرفاق طرف جديد. ضع 925 ميكرولترا من المخزن المؤقت لفوسفات أحادي الصوديوم 7.0 في الكوفيت خمسة. أخرج الطرف وقم بتغطية الكوفيت.
بعد ذلك ، أحضر الكوفيتات الفارغة المتبقية إلى الطاولة العازلة. مسترشدا بالجدول الموجود في دفتر المختبر الخاص بك، قم بتوزيع 925 ميكرولترا من كل مخزن مؤقت في الكوفيت المناسب باستخدام الماصات الدقيقة المصنفة. احرص على عدم استخدام نفس طرف الماصة للمخازن المؤقتة المختلفة.
بمجرد الانتهاء ، أعد المخازن المؤقتة إلى طاولة العمل الخاصة بك. هناك، اضبط ماصة دقيقة سعة 200 ميكرولتر لتوزيع 75 ميكرولتر وإرفاق طرف بالماصة الدقيقة. الآن ، احصل على قارورة أو أنبوب من محلول أحمر محايد ، والذي يمكن مشاركته مع مجموعة طلابية أخرى.
قم بتوزيع 75 ميكرولترا من اللون الأحمر المحايد في كل من الكوفيتات العازلة التسعة. استبدل طرف الماصة إذا لامس عازلة. أخرج طرف الماصة وقم بتغطية الكوفيت عند الانتهاء.
الآن ، اقلب كل كوفيت عدة مرات لخلط المحاليل جيدا. بمجرد مزج اللون الأحمر المحايد مع كل مخزن مؤقت ، التقط صورة أو اكتب ألوان المحاليل. بعد ذلك ، قم بتشغيل مقياس الطيف الضوئي المحمول باليد وانتظر حتى يسخن مصدر الضوء.
بمجرد أن يصبح جاهزا ، قم بإنشاء تجربة جديدة لقياس الامتصاص مقابل الطول الموجي للأحمر المحايد الحر. ثم أدخل كوفيت الماء منزوع الأيونات. احصل على طيف من الماء منزوع الأيونات ، واضبطه كخلفية مذيبة أو فارغة.
بعد ذلك ، قم بإزالة الفراغ من مقياس الطيف الضوئي وأدخل كوفيت الأحمر المحايد في أدنى مخزن مؤقت للأس الهيدروجيني ، والذي سيكون له أعلى تركيز من اللون الأحمر المحايد البروتوني. احصل على طيف ، والذي يجب أن يظهر ذروة واحدة قوية. حدد الطول الموجي المقابل لأعلى نقطة في هذه الذروة ، أو الحد الأقصى.
سجل هذا الطول الموجي في دفتر المختبر الخاص بك بتنسيق lambda max للحصول على اللون الأحمر المحايد الحر البروتوني. احفظ البيانات وقم بإزالة الكوفيت. سجل الامتصاص في دفتر ملاحظاتك ثم اجمع أطياف الكوفيت من 2 إلى 9 باستخدام نفس الإجراء.
يجب أن تتقاطع الأطياف كلها عند نقطة واحدة تسمى النقطة متساوية التساوي. سجل الطول الموجي لهذه النقطة في دفتر ملاحظات المختبر الخاص بك. إذا لم يعبر الطيف عند هذه النقطة ، فقم بإفراغ الكوفيت وتنظيفه ، وقم بإعداد عينة جديدة ، وحاول مرة أخرى.
بمجرد الانتهاء من جمع الأطياف لجميع الكوفيتات ال 9 ، احفظ البيانات وقم بتصديرها. بعد ذلك ، قم بإنشاء تجربة جديدة لقياس الامتصاص مقابل الطول الموجي للأحمر المحايد المقيد. قم بتركيب طرف جديد على الماصة الدقيقة سعة 200 ميكرولتر واحصل على حاوية مشتركة من البروتين المرتبط بالريبوفلافين.
أضف 75 ميكرولترا من محلول البروتين المرتبط بالريبوفلافين إلى كل كوفيت ، بما في ذلك الفراغ. أخرج الطرف ، وثبتي أغطية الكوفيت ، واقلب الكوفيت عدة مرات لخلط المحاليل. الآن ، أدخل الكوفيت 10 في مقياس الطيف الضوئي واضبطه على أنه مذيب فارغ.
بعد ذلك ، احصل على طيف من أدنى عينة من الأس الهيدروجيني وحدد الطول الموجي المقابل للحد الأقصى للذروة الأكثر كثافة. قم بتسجيله في دفتر ملاحظات المختبر الخاص بك باعتباره لامدا ماكس من اللون الأحمر المحايد المرتبط بالبروتون. بعد ذلك ، احصل على أطياف الكوفيت من 2 إلى 9 بنفس الطريقة التي فعلت بها للعينات الحمراء المحايدة المجانية.
سجل الشدة في lambda max للأحمر المحايد المرتبط بالبروتون في طاولتك ، جنبا إلى جنب مع الطول الموجي عند نقطة متساوي النظام. عند الانتهاء ، احفظ بياناتك ، وقم بتصديرها لتحليلها لاحقا ، وأغلق مقياس الطيف الضوئي. ضع الماصات الدقيقة وصناديق الأطراف ومقياس الأس الهيدروجيني ومقياس الطيف الضوئي جانبا.
تخلص من أطراف الماصة المستخدمة في حاوية نفايات معتمدة أو سلة مهملات. الآن ، أفرغ الكوفيت في دورق النفايات العازلة المائية واشطف الكوفيت في الدورق بالماء منزوع الأيونات. في غطاء الدخان ، أفرغ هيدروكسيد الصوديوم الزائد في النفايات الأساسية واشطف الأسطوانة المتدرجة بالماء.
اغسل النفايات المائية الأساسية في البالوعة بماء الصنبور الغزير ، جنبا إلى جنب مع النفايات المائية الأخرى. اغسل الأواني الزجاجية وأغطية الكوفيت وشريط التقليب وفقا للإجراءات القياسية في المختبر. أخيرا ، نظف أسطح عملك بمنشفة ورقية مبللة وتخلص من المناشف الورقية المستعملة ومناديل المختبر في سلة مهملات المختبر.
الآن ، دعونا نحلل بيانات الامتصاص لتحديد pKa للأحمر المحايد. أولا ، ارسم كلتا المجموعتين من بيانات الشدة مع شدة الامتصاص عند lambda max على المحور y ، ودرجة الحموضة على المحور x ، مع ربط النقاط بخطوط ناعمة. بعد ذلك ، لكل سلسلة بيانات ، احسب الفرق بين شدة امتصاص البداية والنهاية.
استخدم ذلك لحساب الامتصاص في منتصف الطريق بين امتصاص البداية والنهاية لكل سلسلة ، أو نقاط منتصف الامتصاص. الآن ، أوجد مكان حدوث نقطة المنتصف في كل خط ، وحدد قيمة الأس الهيدروجيني عند هذه النقطة. قيم الأس الهيدروجيني هذه هي pKa للأحمر المحايد الحر والمرتبط.
هنا ، نرى زيادة في pKa بحوالي 1 بين الأحمر المحايد الحر والمرتبط ، مما يشير إلى أن الأحمر المحايد البروتوني المرتبط هو حمض أضعف من الأحمر المحايد البروتوني الحر بترتيب من حيث الحجم.
