What is the purpose of the sand layer in column chromatography?

The sand layer, placed 0.5 cm above the cotton plug, prevents silica gel from passing through the plug into your collected fractions. This protective barrier ensures that only the separated dyes are collected in pure fractions, maintaining the integrity of your samples throughout the separation process.

Why does column chromatography use two different eluents for separating food dyes?

Using ethanol first elutes erioglaucine, which has lower affinity for silica gel, while water elutes tartrazine more effectively due to its higher polarity. This two-solvent approach saves time and minimizes solvent waste while maintaining fraction purity, compared to using a single eluent throughout the entire separation.

How do you prepare the silica gel slurry for column chromatography?

Weigh 5 grams of silica gel powder and mix it with 18 mL of 95% ethanol in a beaker. Stir with a glass rod until the texture is consistent and resembles batter with no dry patches or clumps. The slurry should flow easily to avoid clogging the funnel or trapping air bubbles in the column.

What flow rate should you maintain when eluting dyes through the column?

Adjust the stopcock so the solvent level decreases approximately 1 mL every 15 to 20 seconds. Maintain at least 1 cm of solvent above the silica gel at all times by periodically refilling the column. This controlled solvent flow rate ensures proper separation and prevents band broadening during the elution process.

How do you apply the green food dye to the silica gel column?

Use a clean pipette to gently apply 5 to 7 drops of the dye solution evenly across the top of the silica gel. If necessary, add a few drops of ethanol to keep the silica gel covered. Allow the dye to soak in before beginning the elution process with your chosen eluent.

What do the different colors of fractions tell you about dye affinity for silica gel?

The blue erioglaucine elutes with ethanol, indicating lower affinity for silica gel, while yellow tartrazine requires water, indicating higher affinity. This separation demonstrates that tartrazine binds more strongly to silica gel than erioglaucine does, which is why different solvents are needed to elute each dye effectively.

Why is it important to avoid stopping the column chromatography for extended periods?

Stopping for more than 1 minute at a time causes compound bands to start broadening, which reduces separation quality and makes it harder to collect pure fractions. Continuous flow maintains sharp band definition and ensures efficient separation of the dyes throughout the elution process.

كروماتوغرافيا العمود

المفاهيم تحضير المدرّس بروتوكول الطالب

0 مشاهدات03:07 د

كروماتوغرافيا العمود هي تقنية تستخدم عمودا معبأا لفصل المركبات بناء على تفاعلاتها مع الطور الثابت ، والتي عادة ما تكون على شكل حبات مجهرية. تمتلئ الفراغات بين الخرزات بالمذيبات. يسمح فتح العمود للمذيب بالتدفق عبر المرحلة الثابتة. عندما يتم تطبيق خليط على الجزء العلوي من العمود المعبأ متبوعا بمزيد من المذيب ، ينتقل الخليط إلى المرحلة المتحركة ويتدفق عبر المرحلة الثابتة.

يتفاعل كل مكون من مكونات الخليط مع المرحلة الثابتة بطريقة مختلفة. بعض المكونات لها تفاعلات ضعيفة مع المرحلة الثابتة وبالتالي تتحرك بسرعة عبر العمود ، بينما يكون للآخرين تفاعلات قوية مع المرحلة الثابتة وبالتالي تتحرك بشكل أبطأ. هذا يفصل المركبات المختلفة إلى نطاقات يتم جمعها في أجزاء صغيرة. هذا يتيح تنقية كل مركب.

إذن ، ما نوع الخصائص التي يمكن استخدامها لفصل الخلائط؟ واحدة من أكثر الخصائص استخداما هي القطبية. لهذا الغرض ، غالبا ما يستخدم هلام السيليكا ، وهو شكل من أشكال ثاني أكسيد السيليكون ، كمرحلة ثابتة. يتفاعل هلام السيليكا مع المركبات عن طريق تفاعلات ثنائي القطب ثنائي القطب والترابط الهيدروجيني من خلال مجموعات -OH التي تتشكل على سطحه. وبالتالي ، ستتفاعل المركبات القطبية بقوة مع المرحلة الثابتة ، بينما تتفاعل المركبات غير القطبية بشكل ضعيف.

تشمل الخصائص الأخرى التي يمكن استغلالها للفصل الحجم والشحنة وكراهية الماء. الطريقة الشائعة لتحميل المرحلة الثابتة في العمود هي ملاط الطور الثابت والمذيب. بعد ذلك ، يتم تعبئة المرحلة الثابتة عن طريق تدفق المزيد من المذيبات عبر العمود لضغط الملاط. من الضروري أن تكون المرحلة الثابتة معبأة بشكل موحد بدون فقاعات هواء أو قنوات فارغة أو بقع جافة. يمكن أن تعطل هذه التدفق وتسبب اختلاط العصابات.

عند اختيار عمود ، يعتمد القطر على حجم العينة المراد فصلها. يجب أن تغطي العينة الجزء العلوي من العمود بطبقة رقيقة ومتساوية. تؤدي طبقة العينة السميكة إلى نطاقات أوسع. يعتمد طول العمود على مدى جودة انفصال المركبات في المرحلة الثابتة. تتطلب المركبات ذات الصلات المتشابهة للمرحلة الثابتة عمودا طويلا للفصل المناسب. ومع ذلك ، يمكن فصل مزيج من المركبات ذات الصلات المختلفة جدا للمرحلة الثابتة على عمود أقصر.

في هذا المختبر ، سوف تستكشف كروماتوغرافيا العمود عن طريق تعبئة عمود هلام السيليكا وإعداده أولا. بعد ذلك ، ستستخدم العمود الخاص بك لفصل المكونات الملونة في صبغة الطعام الخضراء.

Print Procedure Steps

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: لارا الحريري وأحمد باسابرين من جامعة ماساتشوستس أمهيرست ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية

Column Chromatography of Food Dye
في هذه التجربة ، ستستخدم كروماتوغرافيا العمود لفصل ألوان الطعام الخضراء إلى أصباغ زرقاء وصفراء مكونة لها ، تسمى إريوجلوسين وتارترازين. أولا ، ستستخدم 95٪ من الإيثانول لتصفية الصبغة مع تقارب أضعف مع هلام السيليكا. بعد ذلك ، ستغسل الصبغة الثانية من العمود بالماء. لاستعادة الأصباغ المنقاة ، ستجمع كل شريط من الصبغة أثناء مغادرته العمود. تسمى هذه الأحجام المجمعة الكسور.
- للبدء ، ارتد معطف المختبر ونظارات السلامة وزوجا من قفازات النتريل.
- أحضر عمودا أو سحاحا إلى منطقة الإمداد المركزية. احصل على قطعة من القطن أو الصوف الزجاجي واضغط عليها في الجزء العلوي من العمود. استخدم سلكا أو قضيبا طويلا غير حاد لدفعه لأسفل لتوصيل العمود فوق محبس مباشرة. ملاحظه: يجب أن يكون القطن مستقرا ، لكن لا تعبئته بكثافة كبيرة ، لأن المذيب يحتاج إلى المرور عبره بسهولة. تأكد من أن محبس التثبيت يمكن أن يدور بحرية دون الإمساك بالقابس.
- قم بتوصيل مشبك السحاحة بحامل المختبر وقم بتثبيت العمود في وضع مستقيم مع حوالي 4 بوصات من المساحة تحته. تأكد من إغلاق المحبس.
- قم بتسمية دورق سعة 100 مل على أنه "نفايات" وضعه أسفل العمود.
- بعد ذلك ، قم بقياس 1 غرام من الرمل في قارب وزن قطران وأعده إلى المقعد.
- ثم ضع علامة على العمود بحوالي 0.5 سم فوق الجزء العلوي من السدادة القطنية.
- ضع قمعا صغيرا في الجزء العلوي من العمود واسكب كمية كافية من الرمل عبر القمع بحيث تكون هناك طبقة بعمق 0.5 سم فوق القابس. سيمنع ذلك هلام السيليكا من المرور عبر القابس إلى كسوراك.
- قم بإزالة مسار التحويل واضغط برفق على العمود لتوزيع الرمال بالتساوي.
- الآن ، قم بإعداد المواد المزيئة الخاصة بك. قم بتسمية دورق سعة 50 مل وأسطوانة متدرجة سعة 50 مل على أنها "ماء".
- قم بقياس 50 مل من الماء منزوع الأيونات باستخدام الأسطوانة المتدرجة واسكبها في الدورق
- بعد ذلك ، قم بتسمية دورق آخر سعة 50 مل وأسطوانة متدرجة سعة 50 مل على أنها "إيثانول". قم بقياس 50 مل من 95٪ من الإيثانول واسكبه في هذا الدورق
- الآن، احصل على 4 أو 5 ماصات باستور نظيفة وبصلة ماصة. ماصة برفق 7-8 مل من الإيثانول على طول الجدران الداخلية للعمود. ستتيح لك هذه الطبقة من المذيبات صب ملاط هلام السيليكا هذا في العمود دون إزعاج الرمال.
- افتح محبس واستنزف ~ 1 مل من الإيثانول في دورق النفايات لطرد الهواء من محبس والتأكد من أن المذيب يتدفق بسهولة عبر القابس. تأكد من عدم وجود بقع جافة في الرمل والقابس واضغط برفق على جانب العمود لإزالة فقاعات الهواء المحبوسة.
- بعد ذلك ، ضع قمعا نظيفا في الجزء العلوي من العمود وقم بتسمية دورق ثالث سعة 50 مل "ملاط هلام السيليكا في الإيثانول".
- قم بوزن 5 جم من مسحوق هلام السيليكا بعناية واسكبه في الدورق المسمى.
- بعد ذلك ، أحضر هلام السيليكا ، وقضيب زجاجي ، وأسطوانة الإيثانول المتدرجة إلى غطاء توزيع الإيثانول.
- قم بقياس 18 مل من 95٪ من الإيثانول واسكبه في الدورق قلب الخليط بقضيب الزجاج حتى يصبح القوام متناسقا ولا تبقى بقع جافة أو كتل من المسحوق. هذا عادة ما يستغرق ~ 1 دقيقة. ملاحظة: يجب أن يكون الملاط سميكا ، مثل الخليط ، ولكن يجب أن يظل يتدفق بسهولة. إذا كان الملاط شديد الصلابة ، فقد يسد القمع أو يحبس فقاعات الهواء في العمود.
- بمجرد تعليق المسحوق تماما في الإيثانول ، أحضره إلى مقعدك. حرك الملاط حتى يصبح قوامه متسقا مرة أخرى واسكبه على الفور في العمود.
- اضغط برفق على جوانب العمود حيث يستقر هلام السيليكا للتخلص من فقاعات الهواء.
- اشطف الدورق ب 1 أو 2 مل من الإيثانول ، واسكب الشطف في العمود. ثم قم بإزالة القمع وضعه جانبا.
- الماصة الإيثانول على طول الجزء الداخلي من العمود لغسل الجسيمات العالقة بالجدران. بعد ذلك ، قم بتصريف المذيب حتى يصبح الغضروف المفصلي بالكاد فوق الجزء العلوي من هلام السيليكا.
- الآن ، استخدم أسطوانة متدرجة سعة 5 أو 10 مل للحصول على حوالي 0.8 مل من محلول صبغة الطعام الأخضر.
- استخدم ماصة نظيفة لوضع 5 إلى 7 قطرات من محلول الصبغة برفق بالتساوي عبر الجزء العلوي من هلام السيليكا. إذا لزم الأمر ، أضف بضع قطرات من الإيثانول للحفاظ على هلام السيليكا مغطى.
- أثناء انتظارك حتى تمتص الصبغة ، قم بتسمية كوبين نظيفين سعة 50 مل على أنهما "جزء الإيثانول" و "جزء الماء". استبدل دورق النفايات الموجود أسفل العمود بدورق جزء الإيثانول.
- بعد ذلك ، املأ العمود بالإيثانول ، وسحب أول مل على طول الجدران الداخلية لتجنب إزعاج هلام السيليكا.
- ثم افتح محبس جزئيا واضبطه حتى ينخفض مستوى المذيب ~ 1 مل كل 15-20 ثانية.
- أعد ملء العمود بشكل دوري للحفاظ على تدفق الإيثانول. تأكد من وجود 1 سم على الأقل من المذيب فوق هلام السيليكا في جميع الأوقات.
- راقب النطاقين الأصفر والأزرق عند انفصالهما. ملاحظه: إذا كنت بحاجة إلى الابتعاد ، فأغلق محبس حتى لا يجف العمود أثناء غيابك. تجنب التوقف لأكثر من 1 دقيقة في المرة الواحدة لأن النطاقات المركبة ستبدأ في التوسع. عادة ما يستغرق الأمر حوالي 20-35 دقيقة حتى تغادر الصبغة الأسرع الحركة العمود.
- بمجرد جمع كل الصبغة سريعة الحركة في دورق جزء الإيثانول ، أغلق المحبس ، واترك جزء الإيثانول جانبا ، ثم ضع دورق النفايات أسفل العمود.
- قم بتصريف المذيب حتى يصبح الغضروف المفصلي فوق الجزء العلوي من هلام السيليكا. ثم استبدل دورق النفايات بدورق جزء الماء.
- استخدم ماصة نظيفة لملء الجزء العلوي من العمود بالماء منزوع الأيونات. بعد ذلك ، افتح محبس ما يكفي للسماح للماء بالتدفق عبر العمود بمعدل حوالي 1 مل كل 15-20 ثانية.
- أعد ملء العمود بالماء حسب الحاجة حتى يغادر النطاق الثاني من اللون العمود تماما. يستغرق هذا عادة من 15 إلى 25 دقيقة أخرى. ثم أغلق محبس المحطة واستبدل دورق جزء الماء بدورق النفايات.
- الآن ، قم بتصريف العمود تماما واترك المحبس مفتوحا.
- سجل ألوان كسور الإيثانول والماء في دفتر ملاحظات المختبر.
  الجدول 1: كروماتوغرافيا العمود لصبغة الطعام
  لون الحجم (مل) جزء الإيثانول جزء الماء انقر هنا لتنزيل الجدول 1
- صب الكسور في الأسطوانات المتدرجة المقابلة سعة 50 مل وسجل حجم كل كسر. ثم أغلق محبس وقم بإحضار العمود إلى غطاء الدخان.
- قم بتثبيت العمود في وضع مستقيم في الغطاء حتى يجف هلام السيليكا. سيخبرك مدرسك إما بكيفية تنظيف العمود أو الاعتناء به بعد المختبر.
- الآن ، قم بغسل الكسور المجمعة وبقايا الإيثانول والماء ومحلول الصبغة في البالوعة ونظف باقي الأواني الزجاجية كالمعتاد.
- تخلص من ماصات باستور المستخدمة في النفايات الزجاجية. تخلص من المناشف الورقية المستعملة وقارب الوزن في سلة مهملات المختبر ونظف سطح الطاولة قبل المغادرة.
Results
في هذه التجربة ، رأيت أن الإيثانول يتخلص من الإيريوجلوسين الأزرق في الوقت المناسب ، لكنه لم يكن مادة فعالة للتارترازين الأصفر. يظهر الكروماتوغرافيا الورقية للصبغة الخضراء نتائج مماثلة. وبالتالي ، نستنتج أن erioglaucine لديه تقارب أقل مع هلام السيليكا من التارترازين.

الآن ، ضع في اعتبارك مزايا استخدام مذيبين لتصفية الصبغة بشكل منفصل. الماء أكثر قطبية من الإيثانول ، لذلك نفترض أنه سيتخلص من كلتا الصبغتين بشكل أسرع من الإيثانول وحده. على الرغم من أنك كنت ستستخدم مذيبا أقل بشكل عام إذا كنت قد استخدمت الماء فقط ، إلا أن الفصل كان أسوأ ، مما يجعل من الصعب جمع الكسور النقية.

بدلا من ذلك ، كان من الممكن أن تستمر في استخدام الإيثانول بعد جمع الإيريوجلوسين ، لكن الأمر كان سيستغرق وقتا طويلا والكثير من الإيثانول لتصفية التارترازين بهذه الطريقة. أدى تحويل مادة الإزالة إلى الماء بعد تخفيف الإيريوجلوسين إلى توفير الوقت وتقليل نفايات المذيبات دون التضحية بالنقاء.

كروماتوغرافيا العمود

الجدول 1: كروماتوغرافيا العمود لصبغة الطعام