مقالة منهجية

Microinjection من مرنا والعقاقير [أليغنوكليوتيد] Morpholino اسماك الزرد في الأجنة.

DOI:

10.3791/1113

⸱

مايو 7, 2009

 , 
1Department of Genetics, Yale University School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microinjection طريقة راسخة وفعالة لإدخال المؤثرات الأجنبية في الأجنة المخصبة الزرد. هنا ، علينا أن نظهر تقنية microinjection قوية لأداء overexpression مرنا ، والدراسات morpholino ضربة قاضية قليل النوكليوتيد الجينات في الزرد.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أداة أساسية للتحقيق في دور الجينات خلال التنمية هو القدرة على تنفيذ ضربة قاضية الجينات ، overexpression والدراسات misexpression. في الزرد (

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجزء 1 : إعداد micropipettes وألواح غرفة microinjection

  1. افتعال micropipettes عن طريق التسخين وسحب الأنابيب الزجاجية البورسليكات الشعرية (البنك الآلات الدقيقة ، وشركة ، 1B100 - 4) في جهاز مجتذب micropipette (سوتر الآلات ، وشركة يلهب / براون P - 97). مخزن في طبق بتري على أعلى كمية صغيرة من الطين أو شريط لاصق.
  2. صب agarose 1.5 ٪ (الاميركي Bioanlytical ، شركة ، AB00972 - 00500) في لوحات 1X المتوسطة E3 مصبوب مع اسفين على شكل أحواض من شأنها أن تكون بمثابة طريقة سهلة لعقد أجنة خلال حقن (كما هو موضح في كتاب 'اسماك الزرد") 1. دعونا لوحات أجار الغرفة ترسيخ قبل استخدام وتخزين عند 4 درجة مئوية.

الجزء 2 : إعداد RNA

نهج واحد قوي للدراسات وظائف الجينات والحمض النووي الريبي لmicroinject في المختبر توج كتب في الأجنة الزرد. توج الجيش الملكي النيبالي سلوك مشابه إلى mRNAs حقيقية النواة الموجودة في الجسم الحي بسبب وجود تمثيلي CAP. الزرد الباحثين الاستفادة بشكل روتيني لهذا الأسلوب أو overexpress misexpress الجين اهتمامهم. في هذه التظاهرة ، فإننا سوف microinject مستخرج EGFP الموسومة واستخدام كامل يعيش الجنين GFP - التعبير بوصفها قراءات مرئية عن طريق الحقن ناجحة.

  1. إجراء في المختبر CAP رد فعل على النص نسخ الحمض النووي الريبي اهتمامك. في المختبر ، ونحن ادخال بشكل روتيني [كدنا] من الاهتمام الى ناقلات + pCS2 وإجراء كرد فعل التوليف المختبر كميات كبيرة من الحمض النووي الريبي توج باستخدام mMachine mMessage SP6 مجموعة (Ambion ، شركة ، AM1340).
  2. تنقية عينة الحمض النووي الريبي التي تعمل من خلال مجموعة صغيرة RNeasy (Qiagen ، شركة ، 74104) أو الفينول : استخراج الكلوروفورم والأيزوبروبانول هطول الأمطار.
  3. تحديد دقيق للتركيز على إعداد الجيش الملكي النيبالي وتخزينها في -80 درجة مئوية لتصبح جاهزة للاستخدام.
  4. في يوم من الحقن ، وأذاب عينة الحمض النووي الريبي ، وتدور الدوامة طفيفة أسفل لفترة وجيزة.
  5. يعد حل تعمل مع الماء المعقم وتركيز النهائي من 0.025 -- 0.050 ٪ أحمر الفينول (سيغما الدريخ شركة P0290). أحمر الفينول بمثابة علامة مرئية لحقن المحلول في جنين. في هذه المقالة ، سوف نستعد حلا مرنا من 100 عامل EGFP نانوغرام / UL مع أحمر الفينول 0.050 ٪.
  6. إبقاء عينة تعمل على الجليد وعودة السهم إلى رنا -80 درجة مئوية.
  7. انتقل إلى الجزء 4 عندما تصبح جاهزة لحقن هذه العينة.

الجزء 3 : إعداد morpholino

وتستخدم على نطاق واسع Morpholino [أليغنوكليوتيد] العقاقير لتعديل التعبير الجيني عن طريق منع ترجمة البروتين المستهدف أو عن طريق تعديل قبل مرنا الربط 2،3. Morpholinos في الزرد بمثابة أداة الوراثة العكسية القوية التي هدمت وظيفة الجين. في هذه المقالة ، فإننا سوف microinject a morpholino جزئية تستهدف موقع من بدء متعدية pkd2 (5' - AGGACGAACGCGACTGGAGCTCATC - 3 '). على أساس العمل المحددة مسبقا ، ونحن نتوقع من حقن الأجنة لتقليد phenotypically pkd2 4 الأسماك متحولة.

  1. نأذن بشكل روتيني من 300 nmol بنسبة ضئيلة morpholino مصممة خصيصا لجينة من الاهتمام من أدوات الجينات ، LLC (Philomath ، OR).
  2. إضافة الماء المعقم UL 100 لجعل مخزون 3 ملم الحل. قسامة الحل وتخزينها في -20 درجة مئوية لتصبح جاهزة للاستخدام.
  3. في يوم من الحقن ، والحرارة الحل morpholino عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. المفاجئة باردة على الجليد على الفور وتدور لفترة وجيزة. يبدل طبيعة هذه الخطوة أي الهياكل الثانوية في جزئية ويضمن solubilized تماما الحل.
  4. يعد حل العامل تمييع الحل morpholino في الماء المعقم وتركيز النهائي من 0.025 -- 0.050 ٪ أحمر الفينول. في هذه المظاهرة ، سنكون إعداد حل عمل 0.50 ملي pkd2 morpholino مع أحمر الفينول 0.050 ٪.
  5. مواصلة العمل على حل درجة حرارة الغرفة.
  6. انتقل إلى الجزء 4 عندما تصبح جاهزة لحقن هذه العينة.----

الجزء 4 : تعبئة micropipette مع الحل الخاص العاملة

  1. قطع رأس القاصية من micropipette بالملقط أو razorblade الجراحية لإنشاء الافتتاح ان يكون مرئيا فقط تحت المجهر تشريح (نيكون الآلات ، وشركة ، SM2645) في التكبير 50X.
  2. 2 UL مكان من الحل الخاص بك يعمل انخفاض في الصعود إلى ساترة.
  3. نعلق الجزء الخلفي من micropipette إلى حقنة 5 مل مزودة أنابيب على إبرة تحت الجلد ويغرق قليلا الطرف البعيد من micropipette إلى إسقاط الخاص من محلول العمل. الحرص على عدم كسر غيض من micropipette.
  4. سيفون الحل من خلال العمل في نهاية البعيدة للmicropipette عن طريق سحب المكبس من المحاقن.

الجزء 5 : معايرة حجم الحقن micropipette

  1. وضع قطرة من الزيت المعدني (الاميركي Bioanalytical ، شركة ، AB00921 - 00025) على شريحة ميكرون (فايشير ، 12 SM1 - 561).
  2. بدوره على السلطة والعرض الجوي للضغط نابض الدقيقة حاقن جهاز (وورلد شركة آلات دقيقة ، PV830).
  3. إرفاق micropipette لصاحب micropipette جهاز حاقن الجزئي. حاقن هو الضغط الجزئي للتنظيم وتنشيط الإفرازات عن طريق الضغط على دواسة القدم.
  4. تشريح تحت المجهر ، واختبار حجم الحقن باستخدام محقنة الدقيقة لوضع قطرة من حل العمل الخاص بك على النفط ميكرون. قياس قطرها من الانخفاض حيث يعوم كمجال على أعلى من النفط.
  5. ضبط مدة وضغط الحقن لمعايرة الصوت الخاص بعناية من الحقن. هذه الخطوة يساعد في استنساخ التجربة microinjection. في هذه المظاهرة ، وسيتم ذلك عن microinjections مع قطره قطرة 0.15 ملم (حوالي 1.76 NL في الحجم).
  6. مرة واحدة وقد تم معايرة حجم الحقن الخاص ، واستخدام "عقد" مفتاح على حاقن الدقيقة لمنع الردم وتسريب micropipette.

الجزء 6 : إعداد الأجنة المخصبة الزرد لmicroinjection

  1. والزرد لم عشوائيا في الساعات القليلة الأولى من صباح كل يوم. جمع الأجنة في مرحلة 1 - الخلية ووضعها في 1X المتوسطة E3.
  2. باستخدام الماصة نقل 3 مل (بيكتون ديكنسون لابوار ، 357524) ، وترتيب الأجنة على طول أحواض اسفين على شكل لوحات في غرفة microinjection.
  3. إزالة المتوسطة بحيث تكون مغمورة ضحلة الأجنة وغمرت لا. هذه الخطوة يساعد في تسوية الأجنة إلى أسفل هبوطا ، وكذلك في الاختراق من قبل المشيماء micropipette.

الجزء 7 : Microinjection خلال المشيماء

  1. التلاعب في الأجنة مع micropipette بحيث السيتوبلازم الجنين مرحلة 1 - الخلية مرئية تحت المجهر تشريح. الحرص على عدم كسر غيض من micropipette.
  2. اختراق المشيماء ثم صفار ومع micropipette من أجل حقن في الجنين. في هذه التظاهرة ، فإننا سوف تكون الأولى في microinjecting صفار مباشرة تحت الخلية ، والسماح لتدفق حشوية ونشرها لتحقيق الحل العاملين في الخلية. هذا التدفق غير مرئية بسبب أحمر الفينول وأضاف أن الحل العمل.
  3. وسوف نظهر أيضا الحقن المباشر في السيتوبلازم الخلية. microinjection مباشرة في الخلية هو أكثر قوة ولكن وقتا طويلا في اتجاه الجنين السليم وتقنية microinjection هو مطلوب. كما غشاء الخلية هو أكثر صرامة من الغشاء المحي ، غالبا ما يكون أسرع لدخول micropipette صفار من خلال التوصل إلى السيتوبلازم الخلية. قد توجيه القطب الحيواني نحو قاع الحوض ، والعمل مع المعونة أيدي ثابتة في هذا الأسلوب من الحقن.
  4. بعد microinjection ، وضع الأجنة في طبق بيتري مع E3 المتوسطة واحتضان لهم في التطور الطبيعي ل28.5 درجة مئوية.
  5. خلال الساعات القليلة المقبلة والأيام من تطور الجنين ، مراقبة الجنين عن الظواهر اهتمامك.

الجزء 8 : نتائج الممثل

EGFP مرنا overexpression : التحقق من نجاح microinjection ، وسوف نقوم بمراقبة التعبير عن GFP في الأجنة النامية في مرحلة بداية درع (~ 6 HPF) في الجسم الحي بواسطة المجهر مضان كامل الجنين (لايكا مايكروسيستمز GMBH ، MZFLIII). التعبير عن بناء أكثر قوية خلال الأحداث المبكرة من التطور الجنيني ، وسوف يقلل كثيرا خلال التنمية كما توج حقن الحمض النووي الريبي هو المتدهورة بشكل تدريجي ويعتمد على استقرار البروتين المعبر عنها.

pkd2 متعدية حجب morpholino : بناء على النتائج المنشورة سابقا ، فإننا نتوقع أن morphants pkd2 لتقليد محور الجسم الظهري انحناء كما وجدت في pkd2 الزرد متحولة والخراجات الكلى حاضرا في حوالي 2 -- 3 4 DPF.

figure-protocol-1
الشكل 1 : نتائج من الممثل microinjection من EGFP مرنا وpkd2 morpholino أغسطس (أ) كانت microinjected TAB الأجنة في مرحلة 1 - زنزانة مع 0.17 نانوغرام من EGFP مرنا وتصور في 1 DPF في التعبير عن GFP الجسم الحي. (ب ، ج) وmicroinjected TAB الأجنة في مرحلة 1 - NL زنزانة مع 1،7 ~ من morpholino متعدية pkd2 حظر عند 0.50 ملم وسجل للانحناء الجسم الظهري في 4 DPF.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microinjection في الأجنة الزرد هي تقنية راسخة وقوية لاستكشاف دور جين خاص في مجال التنمية. وتشمل التطبيقات overexpression ، misexpression ، وضربة قاضية لفحوصات الجينات اهتمامك ، فضلا عن تحليل روكبي بين جينات متعددة. وقد Microinjection في الزرد المستخدمة على نطاق واسع لتوليد حيوانات معدلة وراثيا ، ورسم الخرائط مصير الخلايا في الأجنة المبكرة الأريمة 5،6،7،8،9. بالإضافة إلى ذلك ، تطبيق هذه التقنية هي بمثابة خطوة رئيسية في توليد الجرثومية خط الوهم بالطرق زرع الخلية 10.<...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة ومؤسسة PKD لZS. وأجريت التجارب على الحيوانات فقط وفقا لمركز يال الثروة الحيوانية (YARC) والمؤسسية رعاية الحيوان واستخدام المبادئ التوجيهية للجنة (IACUC).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

يتم سرد كافة المواد الأخرى في البروتوكول.

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th, University of Oregon. (2000).
  2. Nasevicius, A., Ekker, S. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat Genet. 26, 216-220 (2000).
  3. Draper, B., Morcos, P., Kimmel, C. Inhibition of zebrafish fgf8 pre-mRNA splicing with morpholino oligos: a quantifiable method for gene knockdown. Genesis. 30, 154-156 (2001).
  4. Sun, Z., et al. A genetic screen in zebrafish identifies cilia genes as a principal cause of cystic kidney. Development. 131, 4085-4093 (2004).
  5. Stuart, G., McMurray, J., Westerfield, M. Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos. Development. 103, 403-412 (1988).
  6. Stuart, G., Vielkind, J., McMurray, J., Westerfield, M. Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression. Development. 109, 577-584 (1990).
  7. Culp, P., Nüsslein-Volhard, C., Hopkins, N. High-frequency germ-line transmission of plasmid DNA sequences injected into fertilized zebrafish eggs. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7953-7957 (1991).
  8. Strehlow, D., Heinrich, G., Gilbert, W. The fates of the blastomeres of the 16-cell zebrafish embryo. Development. 120, 1791-1798 (1994).
  9. Helde, K., Wilson, E., Cretekos, C., Grunwald, D. Contribution of early cells to the fate map of the zebrafish gastrula. Science. 265, 517-520 (1994).
  10. Lin, S., Long, W., Chen, J., Hopkins, N. Production of germ-line chimeras in zebrafish by cell transplants from genetically pigmented to albino embryos. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 4519-4523 (1992).
  11. Long, Q., et al. GATA-1 expression pattern can be recapitulated in living transgenic zebrafish using GFP reporter gene. Development. 124, 4105-4111 (1997).
  12. Murphey, R., Zon, L. Small molecule screening in the zebrafish. Methods. 39, 255-261 (2006).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

mRNA EGFP

مقالات ذات صلة