تحقيق الجودة العالية وكمية مناسبة من الجزر الإنسان هي واحدة من أبرز الشروط لنجاح زرع جزيرة. في هذا الفيديو ، ونحن تصف خطوة بخطوة لإجراءات العزل جزيرة البنكرياس الإنسان (الجزء الأول : الهضم ، وجمع من نسيج البنكرياس) باستخدام طريقة تعديل الآلي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الإنسان عزل جزيرة البنكرياس : الجزء الأول : الهضم ومجموعة من الأنسجة البنكرياس
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
إدارة مرض السكري نوع 1 هو مرهقة ، سواء على الفرد والمجتمع ، وتكلف أكثر من 100 مليار دولار سنويا. على الرغم من الاستخدام الواسع النطاق للرصد الغلوكوز والانسولين صياغات جديدة ، وتطوير العديد من الأفراد لا تزال مضاعفات ثانوية مدمرة. ويمكن زرع البنكرياس جزيرة بالقرب من استعادة السيطرة على مستويات الجلوكوز الطبيعي في مرضى السكري
البروتوكول
1. مرفق الإعداد
- الإنسان عزلة الجزيرة هو إجراء الوقت الحساسة التي تنطوي على العمل الجماعي ، وبالتالي ، هناك حاجة إلى أربعة أشخاص لإجراء هذا الإجراء. ويقوم الفريق بقيادة الجراح الذي يشرح وcannulates البنكرياس.
- عزلة الجزيرة تبدأ في اللحظة التي يدخل فريق جزيرة العزلة UIC المرفق. أعضاء فريق التأكد من أن جميع الأجهزة اللازمة ، مثل أجهزة الطرد المركزي ، ويتم التحقق قيد التشغيل. أيضا التأكد من أنهم لتعقيم جميع اغطية والسطوح.
- سوف شخصين إعداد جدول إقناء ؛ إدخال القنية ، وآلة للتبذير ، والدوائر الهضم ، وحدة التروية ، كوبي آلة التنقية ، والجداول الجراحية.
- في نفس الوقت ، سوف اثنين من أعضاء الفريق الآخر إعداد وسائل الاعلام ان هناك حاجة خلال العزلة.
- المقبل ، وتعد أنابيب البكتريولوجيا (الزجاجات والأنابيب وشكل وكيس) ، وأنابيب أخذ العينات (ما قبل مليئة يغسل) ، وأنابيب وألواح التقييم.
- إعداد أنبوب تنقية النحو التالي : 1 أنبوب فارغة وضعت في 150 مل ، وأنابيب مملوءة 2-12 200 مل من وسائل الاعلام M199 تستكمل مع الإنسان (محلول الغسيل) الألبومين وضعت في 230 مل ، وأخيرا أنبوب واحد مل 50 المخروطية مليئة 50 مل من محلول الغسيل. بمجرد إعداد هذه الخطوات هي كاملة ونحن على استعداد لبدء إعداد وperfusing البنكرياس.
2. إعداد البنكرياس ونضح
- لبدء الإعداد ونضح من البنكرياس ، وهو عامل من يزيل الجهاز باستخدام تقنية التغليف المعقم. وسوف يقوم الجراح نقل البنكرياس إلى طاولة التطهير.
- وسوف يقوم الجراح ملء أحد حقنة 60 مل مع الحل البنكرياس الحفاظ الأصلي وتسليمه لأحد المشغلين ، الذي سيتم استخدامه لملء الزجاجات المعدة "المشتريات" الجراثيم.
- بعد الفحص البصري لتحديد ما إذا كان الجهاز هو مناسب لعزل الجزيرة (في حالة تلف البنكرياس خلال الشراء أو غير طبيعية تشريحيا ، قد لا يمكن استخدامه لعزل الجزيرة) ، سوف الجراح يطلب من عامل لإعداد كولاجيناز. نتذكر أن ذلك الوقت إعادة تعليق يتراوح بين الماركات المختلفة ، والكثير الانزيم.
- عندما الجراح مستعد ، وجلب الحلول التطهير (Betadine ، Fungizone / سيفازولين وHBSS) الى طاولة المفاوضات من أجل إزالة التلوث ، ومنهم في حاويات مناسبة. الجراح ينفذ التطهير البنكرياس الغسيل لمدة دقيقة والبنكرياس في كل من الحل إزالة التلوث. ثم يوضع البنكرياس في جرة صغيرة معقمة الذي توزن به. بعد إدخال وزن في السجل الدفعي ، ويوضع البنكرياس في عموم إقناء ؛ إدخال القنية مع بعض الحلول للحفظ.
- وكشف الجراح وجزئيا شق القناة الرئيسية ويقني ؛ يدخل القنية كل شوط من البنكرياس مع قنية. وسيتم تأمين قنية بواسطة خياطة. ليروي البنكرياس ، حرك لأول مرة إلى وحدة ونضح من أجل حل الانزيم في الحوض. إجمالي الوقت نضح حوالي 10 دقيقة ، بمعدل 80 ملم زئبقي لمدة 5 دقائق ، ثم عند 180 مم زئبق لمدة 5 دقائق. منتفخة البنكرياس بعد نضح.
- نقل البنكرياس perfused لعموم إقناء ؛ إدخال القنية ، حيث يتم قطع الأنسجة الدهنية من البنكرياس بعناية. ثم قص البنكرياس في 10-12 القطع ونقلها إلى غرفة Ricordi للهضم.
3. البنكرياس الهضم
- لبدء خطوة عملية الهضم ، ونقل البنكرياس إلى الدائرة Ricordi فارغة ، إضافة واحد مل فيال 2.5 من Pulmozyme ، وطرح على الشاشة (تجنب جزءا كبيرا من كتلة النسيج غرفة) ، على مقربة من القاعة ، وتملأ النظام.
- بدء ضخ المحلول لمدة 5 دقائق. صخرة بلطف الغرفة لتفريق بالتساوي حل الدافئة طوال الوقت. بعد خمس دقائق ، ويهز بلطف الغرفة للمرحلة الهضم برمتها. المحافظة على درجة حرارة 37 ˚ C.
- موسيقى الروك في غرفة بلطف حتى تصل درجة الحرارة الى 37 درجة مئوية ، ثم يهز الغرفة. أخذ عينة كل دقيقتين وكشف إذا تم العثور على الجزر حرة تحت نطاقها. تسجيل معلومات التقييم جزيرة في الجدول الهضم من المحضر دفعة واحدة. تواصل رصد نسبة الجزر حتى هناك 50 ٪ منهم من التعويم ومعزولة في الحل.
4. جمع الأنسجة
- مرة واحدة تم العثور على 50 ٪ من الجزر الحرة في العينات ، وتوقف عملية الهضم وذلك بإضافة الباردة حل تخفيف RPMI في الدائرة. ويتم جمع الأنسجة في أنابيب مخروطية 500 مل قبل مليئة الزلال 30 مل الإنسان. حالما يتم نسج أنابيب شفط قبالة طاف بيليه وتغسل بمحلول الغسيل الباردة. تدور الأنابيب المخروطية في 1100 دورة في الدقيقة (التناوب في الدقيقة) لمدة 1 دقيقة ، 4 ˚ جيم
- الجمع بين جميع أنابيب جمع العالقة مع أنسجة البنكرياس هضمها في المخروطية واحد 500 مل. عندما أنبوب مليء الأنسجة غسلها ، وتدور وتكرار عملية الغسيل حتى تم غسلها جميع أنسجة عدة مرات. تدور هذه الأنابيب ونقل الأنسجة في أنبوب واحد 250 مل المخروطية. جعل حجم ما يصل الى 250 مل معM199 حل الغسيل تستكمل مع HA والاستعداد لأخذ العينات.
- أخذ عينة 1 مل مع ماصة وإضافة إلى أنبوب 15 مل المخروطية قبل مليئة 9 مل من محلول الغسيل. ثم مزيج من قلب بلطف أنبوب مخروطي 15 مل و من هذا ، من أصل عينة 1ml مباشرة في صحن شبكة العد. عدد الخلايا ، وحساب عدد الخلايا باستخدام عامل إضعاف 2500 (10x250).
- تدور في أنبوب 250 مل المخروطية وإضافة 150 مل من UW (جامعة ويسكونسن) التي تستخدم عادة الحل للحفاظ على الجهاز. عند إضافة UW ، مزيج تعليق الخلية بدقة باستخدام ماصة. سجل والتواصل للمشغل لتنقية وقت البدء في UW. ترك الأنبوب (ق) على الجليد ودوامة أحيانا. الآن يمكن تنقيته من جزر أخرى.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وهناك مجموعة متنوعة من العوامل التي تؤثر على نتائج العزلة 9،10. فيما بينها ، والهضم للانسجة البنكرياس يلعب دورا بارزا. بناء على منطقتنا الإنسان جزيرة تجربة العزلة ، لخص لنا النقاط التالية الحاسمة ، التي يمكن أن تؤثر المحتمل أن تسفر جزيرة والجودة.
- الوقت الهضم يختلف عندما تستخدم أنواع مختلفة من الانزيمات.
- حالما 40-50 ٪ من الجزر الصغيرة تفصل ت...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
شكر وتقدير
بدعم من التمويل من جامعة إلينوي في شيكاغو ، وكذلك جزيرة الخلية مركز موارد منحة المعاهد الوطنية للصحة (RFA - RR 05-003) ، ومؤسسة كريستوفر ، ومؤسسة Efroymson ، ومؤسسة Tellabs.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات | |
|---|---|---|---|---|
| آلة صنع الثلج المجروش | معدة | Taylor Company | K4036546 | صنع ثلج معقم |
| جهاز طرد مركزي | معدة | Beckman Coulter Inc. | 424803 | |
| مجهر مقلوب MZ6 TLBD4.1 | معدة | Leica Microsystems | 4103 | |
| أطباق زراعة خلوية ذات شبكة 2 mm | معدة | Nalge Nunc international | 174926 | عد الجزر |
| حمام مائي رقمي EX7 | معدة | NesLab | 105361058 | |
| ميزان حرارة | معدة | IBI:IR | 60444 | |
| ميزان MonoBloc AB 104-S | معدة | Mettler Toledo | 1119430864 | قياس وزن البنكرياس |
| وحدة التحكم في سرعة MasterFlex II | معدة | Cole-Parmer | J00006445 | ضبط سرعة التدفق أثناء الهضم |
| جهاز الرؤية الرقمية DS L1 | معدة | Nikon Instruments | 217267 | |
| وحدة تروية | معدة | تصنيع خاص | n/a | |
| مبرد لوحدة التروية | معدة | Fisher Scientific | 3013P | |
| غرفة ريكوردي (Ricordi Chamber) | معدة | University of Miami | n/a | |
| محلول تخفيف RPMI | كاشف | Mediatech, Inc. | 99783024 | |
| محلول جامعة ويسكونسن (UW) | كاشف | DURAMED | 1000-46-06 | |
| محلول ملحي منظم لهانك ’s (HBSS) | كاشف | Mediatech, Inc. | 99-597-CM | |
| ألبومين بشري 25% | كاشف | GRIFOLS | NDC 61953-0002-2 | |
| وسط M199 (محلول غسيل) | كاشف | Mediatech, Inc. | 99-784-CM | |
| كولاجينيز NB1 درجة GMP | كاشف | SERVA Electrophoresis | N0002937 | |
| بروتياز متعادل NB1 درجة GMP | كاشف | SERVA Electrophoresis | N0002936 | |
| بيتادين | كاشف | Cardinal Health | 29906-004 | |
| سيفازولين | كاشف | West-Ward Pharmaceutical | NDC 0143-9924-90 | |
| ديثيزون | كاشف | Sigma-Aldrich | D5130 |
المراجع
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
- Nano, R., et al. Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function. Diabetologia. 48, 906-912 (2005).
- Barbaro, B., et al. Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient. Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).
- Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance. Transplantation. 59, 689-694 (1995).
- Fridell, J. A., et al. Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation. Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).
- Potdar, S., et al. Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation. Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).
- Salehi, P., et al. Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution. Transplantation. 82, 983-985 (2006).
- Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. Automated islet isolation from human pancreas. Diabetes. 38, Suppl 1 140-142 (1989).
- Hanley, S. C., Paraskevas, S., Rosenberg, L. Donor and isolation variables predicting human islet isolation success. Transplantation. 85, 950-955 (2008).
- Toso, C., et al. Factors affecting human islet of Langerhans isolation yields. Transplant Proc. 34, 826-827 (2002).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
