يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الوقس عدوى الفيروس والتحليل الزمني في التعبير الجيني الفيروسات : الجزء 1

9.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/1168

⸱

أبريل 8, 2009

 ,  , 
1Whitehead Institute for Biomedical Research, MIT - Massachusetts Institute of Technology

في هذه المقالة

ملخص

بروتوكول للعدوى الوقس من خلايا هيلا وتحليل المضيف والفيروسية التعبير الجيني. جزء 1 من 3.

البروتوكول

الجزء 1 : إعداد العدوى

  1. تنمو خلايا هيلا في قوارير وانتظر حتى الخلايا ما يقرب من 80 ٪ متموجة.
  2. يعد يكفي الفيروسية متوسطة النمو للتجربة : DMEM منتظمة مع FBS 2 ٪ وليس المضادات الحيوية المضافة.
  3. لا يمكن أن يؤديها للعدوى مع الأسهم إما الخام من فيروس الوقس مع عيار المعروفة ، أو السكروز النقي مع الفيروس المعروف عيار إذا كنت قلقا بشأن التعبير الجيني المضيف.
  4. إذا كنت تستخدم الفيروسات السكروز النقي ، انتقل مباشرة إلى الجزء 2.
  5. إذا كنت تستخدم فيروس الوقس الخام المخزون ، قبل العدوى ، an قسامة يصوتن للفيروس في sonicator الكأس مع حمام من الثلج في معظمها ، والقليل من الماء.
    • يصوتن في حوالي 30W لمدة 20 ثانية.
    • دوامة أنبوب وكرر صوتنة 3 مرات ، إضافة المزيد من الجليد عند الحاجة للحفاظ على الكأس مملوءة الجليد ومبردة.
    • في دوامة بين كل خطوة صوتنة.
    • انتقل إلى الجزء 2.
  6. بدلا من ذلك ، إذا كنت لا تملك sonicator الكأس ، مزيج حجم مساو للمخزون الخام وفيروس التربسين 0.25mg/mL.
    • دوامة بقوة.
    • احتضان الفيروس الأسهم / التربسين المزيج في بالحمام المائي 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    • الدوامة على فترات 5-10 دقائق.
    • انتقل إلى الجزء 2.

الجزء 2 : اصابة الخلايا

  1. حساب كمية من الجسيمات الفيروسية اللازمة لتصيب المونولاير على تعدد المطلوب من العدوى (وزارة الداخلية). عادة ، يتم استخدام أعلى مستوى وزارة الداخلية (بين 5 و 10) لtimecourses العدوى.
  2. إضافة المبلغ المطلوب من فيروس السكروز النقي أو فيروس trypsinized الخام إلى 37 درجة مئوية وسائط النمو الفيروسي وتخلط جيدا. يجب استخدام وسائل الإعلام بما يكفي لتغطية الجزء السفلي فقط من القارورة. على سبيل المثال ، 10 مل من وسائل الاعلام عن قارورة T - 175.
  3. إزالة وسائل الاعلام من الخلايا وشطف مع درجة حرارة الغرفة في برنامج تلفزيوني.
  4. إضافة للفيروس / وسائط النمو الفيروسي إلى كل القارورة.
    • دوامة بلطف ، لوحات مغطاة واحتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 5 ٪ لمدة 1 ساعة.
    • الإمالة ودوامة لوحات كل 15 دقيقة لانتشار الفيروس بشكل موحد والحفاظ على الخلايا رطبة.
    • لنقطة 0hr/Mock الوقت ، إضافة سائط النمو الفيروسي فقط ، مع عدم وجود الفيروس المضافة.
  5. بعد حضانة 1 ساعة ، وإزالة وسائل الإعلام التي تحتوي على الفيروس ، وشطف ثلاث مرات مع درجة حرارة الغرفة في برنامج تلفزيوني.
  6. إضافة أكبر قدر ممكن من النمو الفيروسي المتوسطة إلى كل القارورة. على سبيل المثال ، 30 مل من وسائل الاعلام عن قارورة T - 175. بدء العد ل ك 0 نقطة زمنية ساعة.

الجزء 3 : حصاد الخلايا

  1. فحص الخلايا تحت المجهر ونلاحظ أي تأثير الاعتلال الخلوي (CPE).
  2. إزالة وسائل الإعلام وشطف الخلايا مع 30 مل من درجة حرارة الغرفة في برنامج تلفزيوني.
  3. إضافة 15 مل من التربسين إلى الخلايا واحتضان ل5min - 2 في 37 درجة مئوية.
  4. الاختيار تحت المجهر لخلايا المفرزة والاستفادة من القارورة بلطف لإزاحة الخلايا.
  5. نقل الخلايا مع ماصة معقمة a المصلية في أنبوب مخروطي 50 مل.
  6. غسل القارورة مع حجم مساو من وسائل الاعلام نمو الخلايا ، وإضافة وسائل الإعلام إلى الخلايا trypsinized في أنبوب مخروطي الشكل.
  7. أجهزة الطرد المركزي في الخلايا ز × 300 لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  8. إزالة التربسين / وسائل الإعلام من بيليه الخلية.
  9. Resuspend الكرية خلية في أي كاشف TRIzol العازلة أو تحلل من العزلة التي تريدها مجموعة الحمض النووي الريبي.
  10. إذا كنت تستخدم TRIzol ، تقسيم العينة إلى 1 aliquots مل في 1.5mL أنابيب إيبندورف وصفت والتجميد في -80 درجة مئوية.
  11. أكرر للجميع النقاط الزمنية ، والحصاد one القارورة في نقطة زمنية.

الجزء 4 : استخراج عينات الحمض النووي الريبي في TRIzol

  1. عند هذه النقطة ، ينبغي معلق في العينات الخاصة بك كاشف TRIzol وعلى استعداد لمعالجتها.
  2. إضافة 200μL للفصل BCP المرحلة الكاشف لكل مليلتر 1 من TRIzol في كل أنبوب. قد تحتاج لنقل عينة لأكبر أنبوب إذا كنت تبدأ مع كمية كبيرة من TRIzol.
  3. دوامة أو تهزه بقوة ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-3 دقائق.
  4. العينة في جهاز الطرد المركزي 12000 XG لمدة 15 دقيقة.
  5. نقل المرحلة المائية لأنبوب جديد. المرحلة المائية هي طبقة واضحة بشأن القمة. يجب أن تكون استعادة 600μL تقريبا لكل من 1mL TRIzol كنت بدأت مع.
  6. القيام استخراج second الفينول / كلوروفورم ، وهذه المرة باستخدام 500μL من كلوروفورم في TRIzol 1 مل ، بدلا من BCP.
  7. دوامة أو تهزه بقوة ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-3 دقائق.
  8. العينة في جهاز الطرد المركزي 12000 XG لمدة 15 دقيقة.
  9. نقل المرحلة المائية لأنبوب جديد. المرحلة المائية هي طبقة واضحة بشأن القمة.
  10. إضافة 20μg من الأكريلاميد خطية إلى كل عينة. والأكريلاميد خطية بمثابة الناقل ويساعد على ترسيب الحمض النووي الريبي.
  11. إضافة 500 & ميCRO ؛ لتر من الأيزوبروبانول في 1 مل من TRIzol كنت بدأت مع كل عينة وتخلط جيدا.
  12. احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
  13. أجهزة الطرد المركزي في microcentrifuge في أقصى سرعة لمدة 10-15 دقيقة.
  14. سيكون بيليه RNA تكون مرئية في الجزء السفلي من الأنبوب. بعناية فائقة ، وإزالة طاف من الأنبوب ، إما مع الشافطة فراغ ، أو يدويا بواسطة pipettor. لا تخل بيليه.
  15. غسل بيليه مع 1 مل من الايثانول 70 ٪.
    • إضافة 1 مل من الإيثانول بنسبة 70 ٪ لبيليه.
    • الطرد المركزي في سرعة قصوى 14000 ز لمدة 5-7 دقائق.
    • بعناية فائقة ، وإزالة الإيثانول من الأنبوب ، إما مع الشافطة فراغ ، أو يدويا بواسطة pipettor. تأكد من أن بيليه مرئيا في الجزء السفلي من الأنبوب.
    • تجاهل طاف.
  16. كرر الخطوة يغسل. بعد تجاهل طاف ، حيث بيليه هو علامة على الأنبوب.
  17. بيليه الهواء الجاف لمدة لا تزيد مدة 5 دقائق. لا overdry ، أو RNA سيكون من الصعب إعادة!
  18. إذا كنت ترغب في متابعة العلاج الدناز اختياري لإزالة أي الحمض النووي المتبقي من العينة ، وresuspend بيليه في 17μL nuclease خالية من المياه. خلاف ذلك ، وresuspend بيليه في 20μL nuclease خالية من المياه والاستمرار في الخطوة 22.
  19. (اختياري الدناز العلاج) عن طريق مجموعة Qiagen الدناز ريبونوكلياز خالية ، إضافة 2μL RDD العازلة وإعادة 1μL ريبونوكلياز خالية الدناز الأول لهذا الحمض النووي الريبي معلق. المزيج بلطف.
  20. (اختياري الدناز العلاج) احتضان عند 37 درجة مئوية ل30 دقيقة.
  21. (اختياري الدناز العلاج) إضافة 2μL من EDTA 2.5 ملم واحتضان عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لإبطال نشاط الدناز. لا تتجاوز درجة الحرارة أو تعطيل الوقت وأوقات أطول / ارتفاع درجات الحرارة يمكن أن يسبب تدهور الحمض النووي الريبي.
  22. فحص الحمض النووي الريبي التي تركز معمل.
  23. تخزين عينة الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية.
  24. (QC الاختياري) للتحقق من الجودة باستخدام الحمض النووي الريبي BioAnalyzer اجيلنت ، أو عن طريق تشغيل العينة على تغيير طبيعة جل والتحقق من قراءات OD. (260nm ونسبة 260/280)

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

خطوات حاسمة

الجزء 1 & 2

هناك العديد من الخطوات الحاسمة لوضع عدوى الوقس متزامن ، الأول صوتنة حذرا يجري (أو trypzinizing) من الفيروس ، من أجل تفصيل جزيئات الفيروس. الوقس معرضة بشكل كبير للتجميع ، والتعطيل من جسيمات الفيروس أمرا هاما لضمان العدوى حتى من الخلايا. من أجل تحقيق العدوى المتزامنة ، ينبغي استخدام وزارة الداخلية العالية (أكبر من 2) للتأكد ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

شكر وتقدير

معهد وايتهيد زملاء صناديق

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
كاشف TRIzolكاشفInvitrogen15596-026ستعمل الكواشف المماثلة، مثل TriPure من Roche، أيضاً.
كاشف BCP لفصل الأطواركاشفMolecular Research CenterBP151
مجموعة DNase الخالية من RNaseكاشفQiagen79254تعتبر المعالجة بـ DNase خطوة اختيارية.

المراجع

  1. KH, R. ubins, LE, H. ensley, GW, B. ell, Wang, C., EJ, L. efkowitz, PO, B. rown, DA, R. elman Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes. PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).
  2. Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).
  3. Satheshkumar, P. S., Moss, B. Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).
  4. Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).
  5. Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells. J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).
  6. Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells. J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).
  7. Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells. J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).
  8. Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., JM, G. atell, Gallart, T., Esteban, M. Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC. 81 (16), 8707-8721 (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

RNA HeLa
الوقس عدوى الفيروس والتحليل الزمني في التعبير الجيني الفيروسات : الجزء 1
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.