بعد تشكيل الأنبوب العصبي ، ويضيق الظهارة العصبية والطيات في حين أن أنبوب يملأ مع السائل النخاعي الجنينية (eCSF) لتشكيل البطينين المخ الجنينية. قمنا بتطوير هذه التقنية حقن البطين لتصور أفضل السوائل تملأ الفضاء على النقيض من الشكل ظهاري في جنين حي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
مطلوب السليم تشكيل بطين الدماغ أثناء التطور الجنيني للدماغ وظيفة المخ المعتادة. البطينات الدماغية هي تجاويف الحفظ للغاية داخل المخ التي تمتلئ السائل النخاعي. في الزرد ، وبعد تشكيل الأنبوب العصبي ، والظهارة العصبية يخضع لسلسلة من التشنج والطيات في حين يملأ بسائل مما أدى إلى تشكيل بطين الدماغ. نحن في حاجة من أجل فهم عملية تشكيل البطين ، والتغيرات التي تحدث في شكل الظهارية العصبية في نفس الوقت ، وسيلة لتصور الفضاء البطين بالمقارنة مع أنسجة المخ. ومع ذلك ، فإن طبيعة الأجنة الزرد الشفافية يجعل من الصعب التفريق بين الأنسجة من الفضاء البطين. ولذلك ، قمنا بتطوير تقنية الحقن بطين الدماغ حيث يتم ملء الفراغ البطين مع صبغة الفلورسنت والتقط بواسطة المجهر وbrightfield الفلورسنت. ثم تتم معالجة brightfield والصور الفلورسنت وفرضه في Photoshop. هذا الأسلوب يسمح للتصور من الفضاء البطين مع صبغة الفلورسنت ، وبالمقارنة مع شكل الظهارة العصبية في صورة brightfield. ويمكن استخدام حقن الدماغ الزرد في البطين من 18 ساعة من خلال التسميد آخر مراحل اليرقات في وقت مبكر. وقد استخدمنا هذه التقنية على نطاق واسع في دراساتنا تشكيل بطين الدماغ والتشكل ، وكذلك في وصف المسوخ التشكل الدماغ (1-3).
البروتوكول
بروتوكول
الجزء 1 : الاستعداد للmicroinjection
- التحضير للحقن عن طريق سحب الإبر الشعرية باستخدام إبرة سوتر مجتذب الآلات.
- شغل الإبرة مع صبغة الفلورسنت (مثل تكساس وديكستران الأحمر).
- جبل الإبرة في جهاز micromanipulator وmicroinjection.
- قطع الإبرة إلى الحجم المناسب في زاوية لإنشاء تلميح مشطوف.
- قياس حجم انخفاض والتحقق من أنه من بين 2nl - 1 في حقن في قطاع النفط.
الجزء 2 : تحضير الأجنة
- حقن الأجنة 30 دقيقة في وقت سابق من مرحلة الفائدة. على سبيل المثال ، لدراسة البطينين في 24 التسميد آخر ساعة (HPF) ، حقن أجنة في 23.5 HPF. مرحلة الأجنة وفقا لكيميل وآخرون. (4).
- تحت stereomicroscope ، إزالة بعناية المشيماء من أجنة باستخدام ملقط.
- باستخدام طبق من البلاستيك مغطاة agarose 1 ٪ ، كزة ثقوب في agarose مع البلاستيك 100-200 غيض ماصة ميكرولتر. إزالة بعناية شمعات agarose من الثقوب باستخدام ملقط.
- نقل الأجنة في وسائل الإعلام في جنين طبق agarose مع الثقوب.
- إضافة tricaine (مصنوعة وفقا لWesterfield (5)) إلى وسائل الإعلام لتخدير الجنين ومنع الحركة خلال التجربة.
- المكان برفق ذيل الجنين إلى أسفل في حفرة ، وتوجيهه بحيث أجهزة الحقن في الجانب الخلفي من الجنين.
الجزء 3 : عن طريق الحقن في المخ بطين
- لحقن الدماغ البطين ، وترتيب الإعداد المجهرية بحيث طرف الإبرة في نفس الحقل للعرض والجنين على الطاقة العالية.
- وضعت بعناية الإبرة من خلال roofplate رقيقة من الدماغ المؤخر الخلفي عادل لhingepoint r0/r1 دون أن تصيب أنسجة الدماغ أدناه.
- حقن الصبغة فقط ما يكفي لملء تماما البطينين. قد يستغرق عدة حقن لملء الفضاء البطين ، اعتمادا على مرحلة من مراحل الجنين.
الجزء 4 : التصوير
- استخدام قطعة نظيفة من 1 ٪ agarose المغلفة الطبق ، كزة ثغرات جديدة في الطبق ، وإزالة شمعات ، وإضافة إلى تخدير tricaine الأجنة ومنع الحركة.
- وضع ذيل الجنين البطين حقن في حفرة وموقف للحصول على صورة الظهرية.
- التقاط صورة باستخدام الضوء المرسل.
- انها حيوية للغاية لعدم نقل الجنين أو المجهر.
- تغيير الإعدادات في المجهر والتقاط صورة مع ضوء الفلورسنت.
- إعادة الجنين لالتقاط صور مع كل الاطراف ضوء المنقولة وضوء الفلورسنت.
- حفظ الصور كملفات TIFF لمعالجة الصور في Photoshop.
الجزء 5 : معالجة الصور
- لمعالجة الصور في فوتوشوب ، مفتوحة على ضوء الصور المنقولة وضوء الفلورسنت من الجنين نفسه في اتخاذ نفس الموقف. تأكد من كافة الإعدادات هي نفسها عن كل صورة.
- اسحب صورتك الفلورسنت على ضوء الصورة المنقولة وخط لهم بالضبط.
- مع صورة الفلورسنت المحدد ، حدد "صورة" ، "تسويات" ، ثم "استبدال اللون" ، وتغيير خلفية سوداء إلى بيضاء.
- في إطار "استبدال اللون" ضبط "ضبابي" عامل إلى اليمين حتى الصور الفلورسنت تبدو موحدة في اللون.
- في إطار "الطبقات" ، حدد "ضرب" لعرض الصور تراكب. ينبغي صورتك الفضاء البطين تطابق صورة الضوء المرسل تماما.
- حفظ هذا الملف وكرر عن أي صور أخرى.
نتائج ممثل / نتائج
وتظهر الصور المناسبة حقن البطين في الشكل رقم 1 لوحات م ، في حين ترد على سبيل المثال من الصور الحقن غير صحيحة في EH. الحقن المناسبة لها حواف حادة وصبغ غير منتشر. ويمكن حقن غير صحيحة ، والذي يحدث عندما يتم إدخال الإبرة بعيدا جدا في البطين ويضرب أنسجة المخ أدناه ، ينتج صبغة ما هو خارج مرئية من الفضاء والبطين في صفار البيض.
الشكل 1. وترد البطين حقن 25 أجنة HPF نوع البرية (م) وتصحيح طريقة الحقن (EH) طريقة الحقن غير صحيحة على سبيل المثال. (A ، E) brightfield الظهرية الصور مع صور المقابلة فلوري (B ، F) وتراكب الصور الفلورسنت وbrightfield (C ، G) لطرق الحقن الصحيحة وغير الصحيحة على حد سواء هو مبين. الأسهم تشير إلى المناطق التي تكون فيها صبغة تجاوزت مساحة بطين الدماغ بسبب حقنة البطين غير صحيحة (راجع "أخطاء"). الأمامي وإلى اليسار في جميع الصور.
المشاكل :
| مشكلة | سبب | علاج |
| كنت سحق الجنين مع الإبرة. | إبرة حادة جدا الخاص بك هو الطرف أو كبير جدا. | تبدأ إبرة جديدة وليس كسرها حتى الظهر. شطبة الخاص إبرة لجعلها حادة مثل إبرة المحقنة. |
| الصبغة هي في جميع أنحاء الجنين وصفار (انظر الشكل 1E - H). | ذهب إبرة الخاص من خلال الأنسجة ولم البقاء في الفضاء البطين. | إبرة الخاص بك قد لا تكون حادة بما فيه الكفاية ، لذلك كنت غير قادر على التحكم في سرعة الثقب. |
| صبغة باهتة جدا أو ليس في الدماغ المقدم. | عدم استخدام ضغط مرتفع بما يكفي لحقن أو إبر الخاص لم يكن كافيا حتى الأمامية للوصول إلى الدماغ المقدم عند حقن الصبغة. | زيادة ضغط حقن إبرة أو مكان الأمامي الخاص أكثر قليلا خلال الحقن. يمكنك وضع الإبرة في الدماغ المتوسط ، الدماغ المؤخر الحدود إذا كان المطلوب المزيد من التفاصيل في الدماغ المقدم. يمكنك أيضا ببساطة الانتظار قليلا لصبغ لنشر مزيد من المشاورات قبل التصوير. |
| صورك الفلورسنت مظلمة حول حواف بعد تغيير اللون في Photoshop. | نسيت لتغيير "ضبابي" الإعداد في إطار استبدال اللون. | نقل "ضبابي" وصولا إلى الحق في استبدال لون النافذة. |
| سوف لا ثقب إبرة roofplate الدماغ المؤخر. | لم يتم خفض الإبرة بشكل صحيح. | جعل إبرة جديدة. إذا كنت تفعل الكثير من حقن الابر قد تحتاج عدة لأنها يمكن أن تحصل مملة. |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
نحن في هذا الفيديو لشرح كيفية حقن صبغة الفلورسنت (تكساس الأحمر ديكستران) في الدماغ الزرد النامية البطينين. وتستخدم هذه الطريقة لتصور الفضاء بطين الدماغ على النقيض من الظهارة العصبية المحيطة بها ومفيد للغاية في تحديد شكل مساحة البطين وكذلك على شكل أنسجة المخ المحيطة بها. أنها تسمح لنا أن نفهم بشكل أفضل في عملية تشكيل بطين الدماغ والمخ التشكل على مر الزمن في الأجنة الحية. هذا الأسلوب هو أداة ممتازة لدراسة عيوب الدماغ وتشكيل البطين الأولي لتوصيف ودراسة التشكل المسوخ الدماغ.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
شكر وتقدير
فإن الكتاب أود أن أشكر لورا لوري آن الذين طوروا هذه التقنية في المختبر. معتمد من قبل النظام المنسق NIHMH70926. كان مدعوما من قبل جنيفر Gutzman الزمالة CSBi / ميرك ما بعد الدكتوراه.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات | |
|---|---|---|---|---|
| ملقط (Forceps) | أداة | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| أنابيب شعرية (إبر) | أدوات | Frederick Haer and Co. | 30-30-1 | |
| أطباق مغطاة بالأغاروز | أدوات | أغاروز (Seakem GTG; Lonza) أطباق (Corning) | أغاروز (50027) أطباق (430166) | اجعل عمق الأغاروز في الطبق حوالي 2-3 mm اعتماداً على مرحلة الجنين التي يتم حقنها |
| مجهر تشريحي | مجهر | Carl Zeiss, Inc. | ||
| كاميرا مجهرية ذات قدرات فلورية ومع برنامج لالتقاط الصور | أدوات | |||
| رؤوس ماصات 1-200 μ | أدوات | USA Scientific, Inc. | 1111-0806 | هذا الحجم مثالي لثقب ثقوب في الأغاروز بحيث تستقر الأجنة فيها بشكل مثالي. |
| فوتوشوب (Photoshop) | تحليل الصور | Adobe | ||
| حلقة نقل الأجنة | أدوات | قم بصناعة هذه الحلقة بنفسك باستخدام ماصة زجاجية وشعرة أو خيط صيد، ثم أغلقها بشمع النحل. | ||
| حاقن مجهري | أدوات | Harvard Apparatus | PL1-100 | |
| جهاز سحب الإبر (Needle Puller) | أدوات | Sutter Instrument Co. | الإعدادات (الحرارة 785، السحب 70، السرعة 40، الوقت 70). | |
| المناول المجهري (Micromanipulator) | أدوات | Narishige International | ||
| صبغة فلورية Texas-Red Dextran 70,000MW | كاشف | Molecular Probes, Life Technologies | D1830 | تتوفر أوزان جزيئية أخرى عند الرغبة. |
| تريكاين (3-aminobenzoic acid ethyl ester) | كاشف | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
| وسط نمو الأجنة | كاشف | وفقاً لـ Westerfield (5) |
المراجع
- Gutzman, J. H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech. Dev. 125, 974-983 (2008).
- Lowery, L. A. Characterization and Classification of Zebrafish Brain Morphology Mutants. Anat. Rec. (Hoboken). 292, 94-106 (2009).
- Lowery, L. A., Sive, H. Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products. Development. 132, 2057-2067 (2005).
- Kimmel, C. B. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish. , University of Oregon Press. (1995).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
