يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

إعداد موحدة وحيدة الخلية معلقات من أنسجة الرئة باستخدام الماوس Dissociator gentleMACS

34.9K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/1266

⸱

يوليو 2, 2009

 ,  ,  ,  , 
1Miltenyi Biotec,GmbH

في هذه المقالة

ملخص

الفصل بين أنواع خلايا من نسيج معين يتطلب بارامترات محددة للتحريض الأنسجة للحصول على كميات كبيرة من الخلايا ، قابلة للحياة زروع. وgentleMACS Miltenyi dissociator يحسن هذه المهمة مع بروتوكول بسيطة وعملية. هذا المنشور هو شرح استخدام هذا الجهاز عن نسيج الرئة.

الملخص

إعداد وحيدة الخلية تعليق من الأنسجة شرطا مسبقا هاما لكثير من التجارب في مجال البحوث الخلوية. عملية الفصل بين أجهزة كله يتطلب المعلمات محددة من أجل الحصول على عدد كبير من خلايا قابلة للحياة بطريقة استنساخه. وDissociator gentleMACS يحسن هذه المهمة مع بروتوكول بسيطة وعملية. الأداة مبرمجة مسبقا يحتوي على الإعدادات التي هي الأمثل للكفاءة ولكن لطيف تفارق من مجموعة متنوعة من أنواع الأنسجة ، بما في ذلك الرئتين الماوس. في هذا المنشور ويتجلى استخدام Dissociator gentleMACS على أنسجة الرئة المستمدة من الفئران.

البروتوكول

على العمل تحت ظروف معقمة ، فمن المستحسن لتنفيذ كافة الخطوات في تدفق الصفحي هود.

1. المواد

  1. HEPES العازلة : 10 مم HEPES - هيدروكسيد الصوديوم الهيدروجيني 7.4 ، 150 مم كلوريد الصوديوم ، 5 ملي بوكل ، 1 ملم MgCl 2 و 1.8 ملي CaCl 2)
  2. كولاجيناز D الحل : كولاجيناز D : 100 ملغ / مل (كولاجيناز D> 0.15 U / ملغ) ، في HEPES العازلة
  3. الدناز أنا الحل : 20،000 U / مل أنا الدناز
  4. PBS العازلة عند الرقم الهيدروجيني 7.2
  5. PEB العازلة : 1 ألبوم جيش صرب البوسنة في 20 جزءا الحل أجزاء autoMACS الحل الشطف
  6. نسيج : سرطان الرئة المستمدة من 07/06 الاسبوع القديمة الماوس الكبار BALB / C الإناث ، وخالية من الأجهزة المجاورة.
  7. اختياري : CD11c MicroBeads ، MACS أعمدة MS ، MACS فاصل لعزل الخلايا الجذعية من الايقاف فأر وحيد الخلية الرئة

2. عدم الربط بين أنسجة الرئة

  1. شطف الأنسجة في طبق بتري تحتوي على برنامج تلفزيوني لإزالة كريات الدم الحمراء.
  2. نقل كحد أقصى من 450 ملغ إلى أنسجة الرئة أنبوب C gentleMACS تحتوي على 4.9 مل HEPES العازلة.
  3. إضافة 100 ميكرولتر حل D كولاجيناز إلى تركيز النهائي من 2 دال كولاجيناز ملغ / مل
  4. أضف 10 ميكرولتر الحل الأول الدناز لمدة تصل إلى 150 ملغ الأنسجة (تركيز النهائي من 40 يو / مل الدناز I) أو 20 ميكرولتر الدناز I 150-450 ملغ لأنسجة الرئة (تركيز النهائي من 80 الدناز I U / مل).
  5. إغلاق الأنبوب بإحكام C ونعلق وضعها على Dissociator gentleMACS. ثم تشغيل برنامج "m_lung_01".
  6. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع تناوب الآلي أو يدويا تحول كل 5 دقائق.
  7. عودة إلى عينة Dissociator gentleMACS وتشغيل برنامج "m_lung_02".

3. تصفية

  1. يعد أنبوب 50 مل لجمع الخلايا التي تمت تصفيتها من خلال استبدال الغطاء بمصفاة 70 ميكرومتر شبكة خلية.
  2. مرة واحدة في برنامج gentleMACS الثانية بعد ، اعتمادا على توزيع المواد العينة في الأنبوب ، قد الطرد المركزي في أنبوب لفترة قصيرة لجمع مادة العينة في الجزء السفلي من الأنبوب.
  3. إزالة الخلايا من خلال الغطاء الحاجز مختومة من الأنبوب C باستخدام ماصة مناسبة 1000 غيض ميكرولتر وتطبيقها على مصفاة الخلية.
  4. غسل مصفاة الخلية مع 5 مل HEPES العازلة في RT.
  5. الطرد المركزي الخلايا لبيليه في أنبوب مل 50 في 300xg لمدة 10 دقيقة.
  6. نضح في وطاف resuspend الكرية في حجم الخلية التي تريدها ، PEB العازلة.

الجزء 4 : النتائج الممثل :

figure-protocol-1
الشكل 1. أسفرت الرئة تفارق مع Dissociator ™ gentleMACS في خلايا قابلة للحياة 92 ٪. وكانت ملطخة fluorescently الخلايا الميتة مع يوديد propidium (PI) (الحق مؤامرة نقطة ؛ اليسار مؤامرة نقطة : لا تلطيخ PI).

figure-protocol-2
الشكل 2. تفكك أنسجة الرئة باستخدام الماوس نتائج Dissociator gentleMACS في ارتفاع نسبة الكريات البيض قابلة للحياة والخلايا البطانية. وكانت ملطخة المستمدة حيدة الخلية مع تعليق PE - CD45 و CD146 FITC أو CD31 FITC وتحليلها من قبل التدفق الخلوي.

figure-protocol-3
وكان الرقم 3 الملون. حيدة الخلية تعليق المستمدة من أنسجة الرئة الفأر مع CD11c - FITC ومكافحة mPDCA APC - 1 - لكشف الماوس CD11c منخفضة M - PDCA - 1 + بلازماوية البلدان النامية وكذلك ارتفاع CD11c الخلايا.


figure-protocol-4
الشكل 4. إثراء باستخدام الخلايا الجذعية MicroBeads CD11c ، وهو فاصل MiniMACS واثنين من أعمدة MS.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذا الفيديو ، نقدم طريقة جديدة للتفكك أنسجة الرئة الماوس. نظهر أن الجمع بين المعالجة الميكانيكية والأنزيمية للأنسجة الرئة حققت نسبة عالية من الكريات البيض قابلة للحياة والخلايا البطانية. على وجه التحديد ، وقد تحقق تفكك الميكانيكية للأنسجة التي Dissociator gentleMACS. جيم أنابيب gentleMACS تشمل الدوار -- نظام الموالي ، والتي تنأى الأنسجة بطريقة لطيفة. يتم التحكم في الإجراء إعدادات البرنامج للصك. وكانت الأمثل لتحقيق الضبط عالية الغلة وسلامة الخلايا. وكانت ملطخة المستمدة حيدة الخل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون هم موظفون في شركة Miltenyi Biotec GmbH التي تصنع الجهاز المستخدم في هذا المقال.

شكر وتقدير

الكتاب هم من موظفي شركة محدودة Miltenyi بيوتيك ، ألمانيا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنابيب CMiltenyi Biotecرقم الطلب 130-093-237<أو رابط (a href=)"http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx
gentleMACS™ طقم البدءميلتيني بيوتيك (Miltenyi Biotec)رقم الطلب 130-093-235<أو رابط إلى"http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx
MACSmix™ مُدوِّر الأنابيبMiltenyi Biotecرقم الطلب 130-090-753http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx
autoMACS™ محلول الشطفMiltenyi Biotecرقم الطلب 130-091-222<أضف رابطاً بـ"http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx
MACS® محلول BSA المخزونMiltenyi Biotecرقم الطلب 130-091-376<أضف رابطاً (a href=)"http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx
خرزات CD11c الدقيقة (CD11c MicroBeads)Miltenyi Biotecرقم الطلب 130-052-001<أضف رابطاً (a href=)"http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_93_132_CD11c_MicroBeads.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_93_132_CD11c_MicroBeads.aspx
CD11c-FITC، CD11c-PEMiltenyi Biotecرقم الطلب 130-092-026130-091-830<أضف رابطًا إلى"http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_329_CD11c.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_329_CD11c.aspx
Anti-mPDCA-1-APCMiltenyi Biotecرقم الطلب 130-091-963<أضف رابطاً (a href=)"http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_325_Anti_mPDCA_1.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_325_Anti_mPDCA_1.aspx
CD146-FITCMiltenyi Biotecرقم الطلب 130-092-026<أضف رابطاً (a href=)"http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_417_CD146_LSEC_.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_417_CD146_LSEC_.aspx
CD45-PEMiltenyi Biotecرقم الطلب 610-091-130<أو رابط (href=)"http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_331_CD45.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_331_CD45.aspx
محلول يوديد البروبيديومMiltenyi Biotecرقم الطلب 130-093-233<أضف رابطاً (a href=)"http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx
رؤوس ماصات Art 1000 Reachالمنتجات الحيوية الجزيئيةرقم الطلب 2079http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61<للحفاظ على الظروف المعقمة، يُوصى بتنفيذ جميع الخطوات داخل غطاء تدفق صفائحي (laminar flow hood). 1. المواد محلول HEPES المنظم: (10 ملي مولار HEPES-NaOH بأس هيدروجيني 7.4، 150 ملي مولار NaCl، 5 ملي مولار KCl، 1 ملي مولار MgCl2، 1.8 ملي مولار CaCl2) محلول الكولاجيناز D (Collagenase D): كولاجيناز D بتركيز 100 مجم/مل (Collagenase D > 0.15 وحدة/مجم)، في محلول HEPES المنظم محلول DNase I: بتركيز 20,000 وحدة/مل من DNase I محلول PBS المنظم بأس هيدروجيني 7.2 محلول PEB المنظم: جزء واحد من المحلول المخزون لبروتين BSA في 20 جزءاً من محلول شطف autoMACS النسيج: رئة مستخلصة من أنثى فأر BALB/C بالغة (عمرها 6-7 أسابيع)، خالية من الأعضاء المجاورة. اختياري: حبيبات CD11c MicroBeads، وأعمدة MACS MS، وفاصل MACS Separator لعزل الخلايا التغصنية من معلق الخلايا المفردة للرئة الفأرية. 2. تفكيك نسيج الرئة يُشطف النسيج في طبق بتري يحتوي على PBS لإزالة كريات الدم الحمراء. يُنقل ما لا يزيد عن 450 مجم من نسيج الرئة إلى أنبوب gentleMACS C يحتوي على 4.9 مل من محلول HEPES المنظم. يُضاف 100 ميكرولتر من محلول الكولاجيناز D للوصول إلى تركيز نهائي قدره 2 مجم/مل من الكولاجيناز D. يُضاف 10 ميكرولتر من محلول DNase I للأنسجة التي تصل كتلتها إلى 150 مجم (تركيز نهائي 40 وحدة/مل من DNase I)، أو 20 ميكرولتر من DNase I للأنسجة التي تتراوح كتلتها بين 150-450 مجم (تركيز نهائي 80 وحدة/مل من DNase I). يُغلق أنبوب C بإحكام ويُثبت في جهاز gentleMACS Dissociator، ثم يُشغل البرنامج "m_lung_01". تُحضن العينة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع تدوير آلي أو تدوير يدوي كل 5 دقائق. تُعاد العينة إلى جهاز gentleMACS Dissociator ويُشغل البرنامج "m_lung_02". 3. الترشيح يتم تحضير أنبوب سعة 50 مل لجمع الخلايا المرشحة عن طريق استبدال الغطاء بمصفاة خلايا ذات مسام بحجم 70 ميكرومتر. بمجرد انتهاء برنامج gentleMACS الثاني، وبناءً على توزيع المادة العينية في الأنبوب، يمكن إجراء طرد مركزي سريع للأنبوب لتجميع المادة العينية في قاعه. تُسحب الخلايا من خلال الغطاء المختوم بحاجز لأنبوب C باستخدام طرف ماصة مناسب سعة 1000 ميكرولتر وتوضع على مصفاة الخلايا. تُغسل مصفاة الخلايا بـ 5 مل من محلول HEPES المنظم في درجة حرارة الغرفة. تُجرى عملية طرد مركزي للخلايا لتشكيل كرة مجمعة (pellet) في أنبوب سعة 50 مل عند 300xg لمدة 10 دقائق. يُسحب الراشح (supernatant) ويُعاد تعليق كرة الخلايا في الحجم المطلوب من محلول PEB المنظم. الجزء 4: النتائج التمثيلية: الشكل 1: أدى تفكيك الرئة باستخدام جهاز gentleMACS™ Dissociator إلى الحصول على خلايا حية بنسبة 92%. تم صبغ الخلايا الميتة فلورياً باستخدام يوديد البروبيديوم (PI) (مخطط النقاط الأيمن؛ مخطط النقاط الأيسر: بدون صبغ بـ PI). الشكل 2: يؤدي تفكيك نسيج الرئة الفأرية باستخدام جهاز gentleMACS Dissociator إلى نسبة عالية من الكريات البيضاء والخلايا البطانية الحية. تم صبغ معلقات الخلايا المفردة المستخلصة بـ CD45-PE و CD146-FITC أو CD31-FITC وحُللت بواسطة قياس التدفق الخلوي. الشكل 3: صُبغ معلق الخلايا المفردة المستخلص من نسيج الرئة الفأرية بـ CD11c-FITC و Anti-mPDCA-1-APC للكشف عن الخلايا التغصنية الشبيهة بالبلازمية CD11clow m-PDCA-1+ الفأرية، بالإضافة إلى الخلايا CD11chigh. الشكل 4: إثراء الخلايا التغصنية باستخدام حبيبات CD11c MicroBeads، وفاصل MiniMACS Separator وعمودين من نوع MS Columns.>http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html

المراجع

  1. Swanson, K. Flt3-Ligand, IL-4, GM-CSF, and Adherence-Mediated Isolation of Murine Lung Dendritic Cells: Assessment of Isolation Technique on Phenotype and Function. J. Immunol. 173, 4875-4881 (2004).
  2. Vermaelen, K., Pauwels, R. Accurate and simple discrimination of mouse pulmonary dendritic cell and macrophage populations by flow cytometry: Methodology and new insights. Cytometry Part A. 61A, 170-177 (2004).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

معلق خلوي أحاديمحلول الكولاجيناز Dمحلول DNAse Oneمصفاة خلايا 70 ميكرونتحليل قياس التدفق الخلويخلايا بطانية لكرية بيضاءبروتوكول تفكيك الأنسجةتقييم حيوية الخلايا
إعداد موحدة وحيدة الخلية معلقات من أنسجة الرئة باستخدام الماوس Dissociator gentleMACS
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.