مقالة منهجية

إعداد موحدة وحيدة الخلية معلقات من أنسجة الرئة باستخدام الماوس Dissociator gentleMACS

DOI:

10.3791/1266

⸱

يوليو 2, 2009

 ,  ,  ,  , 
1Miltenyi Biotec,GmbH

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الفصل بين أنواع خلايا من نسيج معين يتطلب بارامترات محددة للتحريض الأنسجة للحصول على كميات كبيرة من الخلايا ، قابلة للحياة زروع. وgentleMACS Miltenyi dissociator يحسن هذه المهمة مع بروتوكول بسيطة وعملية. هذا المنشور هو شرح استخدام هذا الجهاز عن نسيج الرئة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إعداد وحيدة الخلية تعليق من الأنسجة شرطا مسبقا هاما لكثير من التجارب في مجال البحوث الخلوية. عملية الفصل بين أجهزة كله يتطلب المعلمات محددة من أجل الحصول على عدد كبير من خلايا قابلة للحياة بطريقة استنساخه. وDissociator gentleMACS يحسن هذه المهمة مع بروتوكول بسيطة وعملية. الأداة مبرمجة مسبقا يحتوي على الإعدادات التي هي الأمثل للكفاءة ولكن لطيف تفارق من مجموعة متنوعة من أنواع الأنسجة ، بما في ذلك الرئتين الماوس. في هذا المنشور ويتجلى استخدام Dissociator gentleMACS على أنسجة الرئة المستمدة من الفئران.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على العمل تحت ظروف معقمة ، فمن المستحسن لتنفيذ كافة الخطوات في تدفق الصفحي هود.

1. المواد

  1. HEPES العازلة : 10 مم HEPES - هيدروكسيد الصوديوم الهيدروجيني 7.4 ، 150 مم كلوريد الصوديوم ، 5 ملي بوكل ، 1 ملم MgCl 2 و 1.8 ملي CaCl 2)
  2. كولاجيناز D الحل : كولاجيناز D : 100 ملغ / مل (كولاجيناز D> 0.15 U / ملغ) ، في HEPES العازلة
  3. الدناز أنا الحل : 20،000 U / مل أنا الدناز
  4. PBS العازلة عند الرقم الهيدروجيني 7.2
  5. PEB العازلة : 1 ألبوم جيش صرب البوسنة في 20 جزءا الحل أجزاء autoMACS الحل الشطف
  6. نسيج : سرطان الرئة المستمدة من 07/06 الاسبوع القديمة الماوس الكبار BALB / C الإناث ، وخالية من الأجهزة المجاورة.
  7. اختياري : CD11c MicroBeads ، MACS أعمدة MS ، MACS فاصل لعزل الخلايا الجذعية من الايقاف فأر وحيد الخلية الرئة

2. عدم الربط بين أنسجة الرئة

  1. شطف الأنسجة في طبق بتري تحتوي على برنامج تلفزيوني لإزالة كريات الدم الحمراء.
  2. نقل كحد أقصى من 450 ملغ إلى أنسجة الرئة أنبوب C gentleMACS تحتوي على 4.9 مل HEPES العازلة.
  3. إضافة 100 ميكرولتر حل D كولاجيناز إلى تركيز النهائي من 2 دال كولاجيناز ملغ / مل
  4. أضف 10 ميكرولتر الحل الأول الدناز لمدة تصل إلى 150 ملغ الأنسجة (تركيز النهائي من 40 يو / مل الدناز I) أو 20 ميكرولتر الدناز I 150-450 ملغ لأنسجة الرئة (تركيز النهائي من 80 الدناز I U / مل).
  5. إغلاق الأنبوب بإحكام C ونعلق وضعها على Dissociator gentleMACS. ثم تشغيل برنامج "m_lung_01".
  6. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع تناوب الآلي أو يدويا تحول كل 5 دقائق.
  7. عودة إلى عينة Dissociator gentleMACS وتشغيل برنامج "m_lung_02".

3. تصفية

  1. يعد أنبوب 50 مل لجمع الخلايا التي تمت تصفيتها من خلال استبدال الغطاء بمصفاة 70 ميكرومتر شبكة خلية.
  2. مرة واحدة في برنامج gentleMACS الثانية بعد ، اعتمادا على توزيع المواد العينة في الأنبوب ، قد الطرد المركزي في أنبوب لفترة قصيرة لجمع مادة العينة في الجزء السفلي من الأنبوب.
  3. إزالة الخلايا من خلال الغطاء الحاجز مختومة من الأنبوب C باستخدام ماصة مناسبة 1000 غيض ميكرولتر وتطبيقها على مصفاة الخلية.
  4. غسل مصفاة الخلية مع 5 مل HEPES العازلة في RT.
  5. الطرد المركزي الخلايا لبيليه في أنبوب مل 50 في 300xg لمدة 10 دقيقة.
  6. نضح في وطاف resuspend الكرية في حجم الخلية التي تريدها ، PEB العازلة.

الجزء 4 : النتائج الممثل :

figure-protocol-1
الشكل 1. أسفرت الرئة تفارق مع Dissociator ™ gentleMACS في خلايا قابلة للحياة 92 ٪. وكانت ملطخة fluorescently الخلايا الميتة مع يوديد propidium (PI) (الحق مؤامرة نقطة ؛ اليسار مؤامرة نقطة : لا تلطيخ PI).

figure-protocol-2
الشكل 2. تفكك أنسجة الرئة باستخدام الماوس نتائج Dissociator gentleMACS في ارتفاع نسبة الكريات البيض قابلة للحياة والخلايا البطانية. وكانت ملطخة المستمدة حيدة الخلية مع تعليق PE - CD45 و CD146 FITC أو CD31 FITC وتحليلها من قبل التدفق الخلوي.

figure-protocol-3
وكان الرقم 3 الملون. حيدة الخلية تعليق المستمدة من أنسجة الرئة الفأر مع CD11c - FITC ومكافحة mPDCA APC - 1 - لكشف الماوس CD11c منخفضة M - PDCA - 1 + بلازماوية البلدان النامية وكذلك ارتفاع CD11c الخلايا.


figure-protocol-4
الشكل 4. إثراء باستخدام الخلايا الجذعية MicroBeads CD11c ، وهو فاصل MiniMACS واثنين من أعمدة MS.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا الفيديو ، نقدم طريقة جديدة للتفكك أنسجة الرئة الماوس. نظهر أن الجمع بين المعالجة الميكانيكية والأنزيمية للأنسجة الرئة حققت نسبة عالية من الكريات البيض قابلة للحياة والخلايا البطانية. على وجه التحديد ، وقد تحقق تفكك الميكانيكية للأنسجة التي Dissociator gentleMACS. جيم أنابيب gentleMACS تشمل الدوار -- نظام الموالي ، والتي تنأى الأنسجة بطريقة لطيفة. يتم التحكم في الإجراء إعدادات البرنامج للصك. وكانت الأمثل لتحقيق الضبط عالية الغلة وسلامة الخلايا. وكانت ملطخة المستمدة حيدة الخل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون هم موظفون في شركة Miltenyi Biotec GmbH الذين يصنعون الأداة المستخدمة في هذه المقالة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب هم من موظفي شركة محدودة Miltenyi بيوتيك ، ألمانيا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
C TubesMiltenyi Biotecأمر رقم 130-093-237http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx< / a>
gentleMACS&# 8482; طقم بدءMiltenyi Biotecطلب رقم 130-093-235http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx
MACSmix™ الأنبوب المدورMiltenyiBiotec الطلب رقم 130-090-753http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx
autoMACS™ حل الشطفMiltenyiBiotec أمر رقم 130-091-222http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx
MACS® BSA Stock SolutionMiltenyi Biotecأمر رقم 130-091-376http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx< / a>
CD11c MicroBeadsMiltenyi Biotecرقم الطلب 130-052-001http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_93_132_CD11c_MicroBeads.aspx< / a>
CD11c-FITC ، CD11c-PEMiltenyiBiotec أمر رقم 130-092-026130-091-830http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_329_CD11c.aspx< / a>
Anti-mPDCA-1-APCMiltenyi Biotecرقم 130-091-963http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_325_Anti_mPDCA_1.aspx< / a>
CD146-FITCMiltenyiBiotec أمر رقم 130-092-026http:// www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_417_CD146_LSEC_.aspx< / a>
CD45-PEMiltenyiBiotec أمر رقم 130-091-610http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_331_CD45.aspx< / a>
محلول بروبيديوم يوديدMiltenyi Biotecرقم 130-093-233http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx< / a>
المادة 1000 Reach PipetTips للمنتجات الحيوية الجزيئيةرقم 2079http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61< / a>
http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html
أمر

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Swanson, K. Flt3-Ligand, IL-4, GM-CSF, and Adherence-Mediated Isolation of Murine Lung Dendritic Cells: Assessment of Isolation Technique on Phenotype and Function. J. Immunol. 173, 4875-4881 (2004).
  2. Vermaelen, K., Pauwels, R. Accurate and simple discrimination of mouse pulmonary dendritic cell and macrophage populations by flow cytometry: Methodology and new insights. Cytometry Part A. 61A, 170-177 (2004).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

D DNAse One 70

مقالات ذات صلة