الفصل بين أنواع خلايا من نسيج معين يتطلب المعلمات محددة لaggitation الأنسجة للحصول على كميات كبيرة من الخلايا ، قابلة للحياة زروع. وgentleMACS Miltenyi Dissociator يحسن هذه المهمة مع بروتوكول بسيطة وعملية. في هذا الكتاب هو شرح لاستخدام هذا الجهاز على أنسجة nerual.
مقالة منهجية
جيل وحيدة الخلية معلقات من الأنسجة العصبية ماوس
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
داخل الجهاز العصبي ، وقد وصفت المئات من أنواع الخلايا العصبية والدبقية. لكل نوع من أنواع معينة من الخلايا في الدماغ أو النخاع الشوكي لديه ذخيرة من جزيئات سطح الخلية ، أو المحددات الجزيئية ، والتي يمكن من خلالها التعرف عليه ، وتميزت. حاليا ، تحديد الخلية قوية وتقنيات الفصل يتطلب أن تكون ولدت وحيدة الخلية مع الحد في الوقت نفسه الاستعدادات موت الخلايا وتدمير للبروتين سطح مميزة. يمكن للDissociator gentleMACS ، عندما تستخدم في تركيبة مع التربسين أو غراء المستندة مجموعات تفارق وفعالية وبلطف فصل أنسجة المخ مع الحفاظ الحواتم المستضد ، والحد من فقدان الخلية. ويتحقق إعداد موحدة وحيدة الخلية الايقاف باستخدام أنابيب C ، وتحسين برامج gentleMACS مسبقا. ويمكن علاج تولد مرة واحدة ، وحيدة الخلية وحيدة النسيلة تقارن مع تعليق مثل مكافحة Prominin 1 - MicroBeads ، التي تحدد الأسلاف العصبية ، أو تنقيتها باستخدام مزيد من الخرز إزالة الميالين.
البروتوكول
على العمل تحت ظروف معقمة ، فمن المستحسن لتنفيذ كافة الخطوات في تدفق الصفحي هود.
1. المواد
- الأنسجة العصبية التفكك كيت (P) (المكونات : الحل 1،2 و 3 و 4 ، والتخزين الاحتياطي)
- قبل فصل فلاتر
- (اختياري) الخرز إزالة المايلين
- بيتا المركابتويثانول
- gentleMACS Dissociator
- C أنابيب
- MACSmix الأنبوب الدوار
- HBSS (ث / س)
- HBSS (ث)
- إعداد الحلول التالية قبل بداية البروتوكول :
- هانكس "محلول الملح التخزين المؤقت دون كاتيونات الكالسيوم ثنائي التكافؤ 2 + أو Mg 2 + (HBSS (ث / س)
- HBSS ، ومعيار ، أي مع الكالسيوم والمغنيسيوم 2 + 2 + (HBSS (ث)
- اعتمادا على حاتمة مستضد الفائدة في التطبيقات اللاحقة ، إما استخدام غراء المستندة إلى الأنسجة العصبية التفكك كيت (P) أو التربسين المستندة إلى الأنسجة العصبية التفكك كيت (T).
- إعداد الحلول التالية من أدوات الأنسجة العصبية التفكك :
- الحل 2 : إضافة بيتا المركابتويثانول إلى 0.067 ملي
- الحل 4 : مسحوق يذوب في 0.7 مل مخزن تخزين (المقدمة في المجموعة) ، ومزيج بلطف (لا الدوامة)
- ميكس انزيم 1 : 1.9 مل من محلول الماصة 2 و 50 ميكرولتر الحل 1 (كلاهما من المجموعة) في أنبوب جيم واحتضان لمدة 10-15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. هذه هي كافية لفصل 400 ملغ من أنسجة المخ.
2. عدم الربط بين الأنسجة العصبية
- تزن أنسجة المخ في أنبوب يحتوي على 1 مل HBSS (ث / س)
- نقل مخ الفأر في أنبوب C تحتوي على 1950 ميكرولتر من أنزيم ميكس محمى 1. (ملاحظة : كتب هذا البروتوكول ل≤ 400 ملغ ، ولكن يمكن تحجيمها وحدات التخزين حل لتستوعب ما يصل إلى 1600 ملغ من نسيج المخ في الأنبوب C)
- وضع أنبوب C على لDissociator gentleMACS وتشغيل برنامج "m_brain_01".
- احتضان مع التناوب (4 دورة في الدقيقة باستخدام أنبوب MACSmix الدوار) لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- وضع أنبوب C على لDissociator gentleMACS وتشغيل برنامج "m_brain_02".
- خلال الخطوة تعد تفارق 30 ميكرولتر من أنزيم ميكس 2 في 400 ملغ من النسيج من خلال مزج بلطف 20 ميكرولتر من محلول 3 و 10 ميكرولتر من الحل 4.
- إضافة أنزيم ميكس 2 إلى C أنبوب عبر الحاجز كاب مختومة والمزيج بلطف دون vortexing.
- احتضان الانبوب C مع التناوب لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة.
- وضع أنبوب C على لDissociator gentleMACS وتشغيل برنامج "m_brain_03".
- احتضان الانبوب C مع التناوب لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة.
- أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة لجمع عينة في الجزء السفلي من الأنبوب.
3. تصفية
- اختيار مرشح كبيرة بما يكفي للسماح للمرور على خلايا الفائدة. على سبيل المثال ، خلايا بركينيي كبيرة جدا لتمر من خلال تصفية 30 ميكرون ، ولكن سوف Prominin - 1 + الخلايا.
- استخدام ماصة suitable1000 ميكرولتر لإزالة الخلايا تشكل أنبوب C من خلال كاب الحاجز مختومة وتطبيقه على تصفية ما قبل الفصل في أنبوب جمع 15 مل. (ملاحظة : لأحجام أكبر عينة استخدام أنبوب جمع 50 مل).
- غسل فلتر مع 10 مل من HBSS (ث).
- الطرد المركزي الخلايا التي تمت تصفيتها في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في RT.
- Resuspend supernatent والمتوسطة في المخزن الخاص أو في الاختيار للتطبيقات اللاحقة.
- لإزالة الحطام الميلين ، واستخدام الخرز إزالة الميالين.
4. ممثل النتيجة : يرجى الاطلاع على الأرقام 1-3
الرقم. (1) أدى تفكك المخ مع Dissociator gentleMACS في خلايا قابلة للحياة بنسبة 97 ٪ ، كما يظهر تحليل تدفق cytometric.
الرقم. 2 صورة المجهر ضوء تشكيل خلية neurosphere بعد فرز المغناطيسي استخدام الألغام المضادة للProminin MicroBeads - 1 بعد 7 أيام من زراعتها في MACS ® NeuroMedium تستكمل مع PLUS MACS B27 الملحق. وأعدت خلايا من مخ الفأر CD1 (P3) باستخدام الأنسجة العصبية التفكك كيت (P).
الرقم. 3 المايلين في الحطام وحيدة الخلية تعليق يضعف إلى حد كبير بمعزل عن الخلية ، وإزالة الأنقاض التي الخرز إزالة النخاعين المايلين الزيادات فصل الخلايا الكفاءة. لفصل MACS استخدام الألغام المضادة للProminin MicroBeads - 1 ، وكان P22 مخ الفأر فصلها باستخدام الأنسجة العصبية التفكك كيت (P). وكانت الخلايا من التعليق وحيدة الخلية تستخدم إما مباشرة للانفصال ، أو قدمت إلى استنفاد المايلين باستخدام الخرز إزالة الميالين. مقارنة عينات من دون الانفصال عن ومع إزالة النخاعين ، يدل على أن نقاء أعلى للعينات مع إزالة النخاعين السابقة.
المناقشة
وDissociator gentleMACS يسهل إعداد موحدة وحيدة الخلية تعليق من الأنسجة العصبية في نظام مغلق. الأنسجة العصبية هي الأمثل للحفاظ على أطقم التفكك الحواتم المستضد اللازمة لتطبيقات أخرى مثل وimmunostainings immunomagnetic فصل الخلية 1-5. في هذا البروتوكول نظهر التفكك طيف الأنزيمية للدماغ فأر باستخدام Dissociator gentleMACS والأنسجة العصبية التفكك كيت (P) ، مما أسفر في خلايا قابلة للحياة 97 ٪. 100 ملغ من غلة الأنسجة العصبية بين 6 و 5x10 1x10 7 خلايا ، اعتمادا على عمر النسيج المضيف. وقد تم عزل المستهدفة Prominin - 1 + الخلايا باستخدام مضاد للProminin - 1 MicroBeads واقتيد بعد ذلك إلى الثقافة. يظهر بروتوكول لتكون أكثر فعالية مع استخدام إضافية من الخرز إزالة المايلين عند العمل مع الأنسجة العصبية المشتقة من P7> الفئران.
الإفصاحات
الكتاب هم من موظفي شركة محدودة Miltenyi بيوتيك ، ألمانيا.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أنابيب C | Miltenyi Biotec | رقم الطلب 130-093-237 | <نظرًا للعمل في ظروف معقمة، يُوصى بتنفيذ جميع الخطوات داخل غطاء تدفق رقائقي. 1. المواد طقم تفكيك الأنسجة العصبية (P) (المكونات: المحلول 1، 2، 3، و4، ومحلول التخزين المنظم) مرشحات ما قبل الفصل (اختيارية) حبيبات إزالة الميالين جهاز تفكيك الخلايا gentleMACS أنابيب C جهاز تدوير أنابيب MACSmix محلول هانكس الملحى المنظم بدون كاتيونات ثنائية التكافؤ (HBSS (w/o)) محلول هانكس الملحى المنظم القياسي، أي بوجود كاتيونات ثنائية التكافؤ (HBSS (w)) قم بتحضير المحاليل التالية قبل البدء في البروتوكول: محلول هانكس الملحى المنظم بدون كاتيونات ثنائية التكافؤ Ca2+ أو Mg2+ (HBSS (w/o)) محلول هانكس الملحى المنظم القياسي، أي بوجود Ca2+ وMg2+ (HBSS (w)) اعتمادًا على الحاتمة المستضدية المستهدفة في التطبيقات اللاحقة، استخدم إما طقم تفكيك الأنسجة العصبية المعتمد على الباباين (P) أو طقم تفكيك الأنسجة العصبية المعتمد على التريبسين (T). قم بتحضير المحاليل التالية من طقم تفكيك الأنسجة العصبية: المحلول 2: أضف بيتا-مركابتويثانول ليصل التركيز إلى 0.067 ميلي مولار. المحلول 4: أذب المسحوق في 0.7 مل من محلول التخزين المنظم (المرفق في الطقم)، واخلطه برفق (تجنب استخدام جهاز الرج الميكانيكي/vortex). مزيج الإنزيم 1: انقل 1.9 مل من المحلول 2 و50 ميكرولتر من المحلول 1 (كلاهما من الطقم) بواسطة الماصة إلى أنبوب C، ثم حضنهما لمدة 10-15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. هذه الكمية كافية لتفكيك 400 ملجم من أنسجة الدماغ. 2. تفكيك الأنسجة العصبية زن أنسجة الدماغ في أنبوب يحتوي على 1 مل من محلول HBSS (w/o). انقل دماغ الفأر إلى أنبوب C يحتوي على 1950 ميكرولتر من مزيج الإنزيم 1 المسخن مسبقًا. (ملاحظة: هذا البروتوكول مكتوب لـ 400 ملجم أو أقل، ولكن يمكن تغيير أحجام المحاليل لتستوعب ما يصل إلى 1600 ملجم من أنسجة الدماغ لكل أنبوب C). ضع أنبوب C على جهاز تفكيك الخلايا gentleMACS وقم بتشغيل البرنامج "m_brain_01". حضن العينة مع التدوير (بسرعة 4 دورات في الدقيقة باستخدام جهاز تدوير أنابيب MACSmix) لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. ضع أنبوب C على جهاز تفكيك الخلايا gentleMACS وقم بتشغيل البرنامج "m_brain_02". أثناء خطوة التفكيك، قم بتحضير 30 ميكرولتر من مزيج الإنزيم 2 لكل 400 ملجم من الأنسجة عن طريق خلط 20 ميكرولتر من المحلول 3 و10 ميكرولتر من المحلول 4 برفق. أضف مزيج الإنزيم 2 إلى أنبوب C عبر الغطاء المختوم بالحاجز، واخلطه برفق دون استخدام جهاز الرج الميكانيكي. حضن أنبوب C مع التدوير لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية في الحاضنة. ضع أنبوب C على جهاز تفكيك الخلايا gentleMACS وقم بتشغيل البرنامج "m_brain_03". حضن أنبوب C مع التدوير لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية في الحاضنة. استخدم جهاز الطرد المركزي لفترة وجيزة لتجميع العينة في قاع الأنبوب. 3. الترشيح اختر مرشحًا بحجم كبير بما يكفي للسماح بمرور الخلايا المستهدفة. فعلى سبيل المثال، تكون خلايا بوركينجي كبيرة جدًا بحيث لا تمر عبر مرشح 30 ميكرومتر، بينما تمر الخلايا الموجبة لبروتين Prominin-1+. استخدم ماصة 1000 ميكرولتر مناسبة لسحب الخلايا من أنبوب C عبر الغطاء المختوم بالحاجز، ثم ضعها في مرشح ما قبل الفصل الموجود على أنبوب تجميع سعة 15 مل. (ملاحظة: بالنسبة لأحجام العينات الأكبر، استخدم أنبوب تجميع سعة 50 مل). اغسل المرشح بـ 10 مل من محلول HBSS (w). قم بطرد الخلايا المُرشحة مركزياً عند 300 x g لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق الرائق في الوسط أو المحلول المنظم المختار للتطبيقات اللاحقة. لإزالة بقايا الميالين، استخدم حبيبات إزالة الميالين. 4. نتيجة نموذجية: يرجى الاطلاع على الأشكال 1-3 الشكل 1: أدى تفكيك الدماغ باستخدام جهاز تفكيك الخلايا gentleMACS إلى الحصول على خلايا حية بنسبة 97%، كما يظهر تحليل قياس التدفق الخلوي. الشكل 2: صورة بالمجهر الضوئي لتكوين الكرات العصبية بعد فرز الخلايا مغناطيسيًا باستخدام حبيبات Anti-Prominin-1 الدقيقة بعد 7 أيام من الزراعة في وسط MACS® NeuroMedium المدعم بـ MACS Supplement B27 PLUS. تم تحضير الخلايا من دماغ فأر من سلالة CD1 (P3) باستخدام طقم تفكيك الأنسجة العصبية (P). الشكل 3: تؤدي بقايا الميالين في معلقات الخلايا المفردة إلى إعاقة عزل الخلايا بشكل كبير، وتزيد إزالة بقايا الميالين بواسطة حبيبات إزالة الميالين من كفاءة فصل الخلايا. بالنسبة لعمليات فصل MACS باستخدام حبيبات Anti-Prominin-1 الدقيقة، تم تفكيك دماغ فأر P22 باستخدام طقم تفكيك الأنسجة العصبية (P). استُخدمت الخلايا من معلق الخلايا المفردة إما مباشرة للفصل، أو خضعت لعملية استنفاد الميالين باستخدام حبيبات إزالة الميالين. وتظهر مقارنة الفصل بين العينات التي لم تخضع لإزالة الميالين والعينات التي خضعت لها أن النقاوة تكون أعلى في العينات التي تمت إزالة الميالين منها مسبقًا."http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx |
| gentleMACS™ طقم البدء | Miltenyi Biotec | رقم الطلب 130-093-235 | <يرجى ملاحظة أنه من أجل العمل في ظروف معقمة، يُوصى بتنفيذ جميع الخطوات داخل غطاء تدفق صفائحي (laminar flow hood). 1. المواد طقم تفكيك الأنسجة العصبية (P) (المكونات: المحلول 1 و2 و3 و4، ومحلول التخزين المنظم) مرشحات ما قبل الفصل (اختيارية) حبيبات إزالة الميالين (Myelin Removal Beads) جهاز تفكيك gentleMACS أنابيب C جهاز تدوير أنابيب MACSmix محلول هانكس الملح الموقوف (بدون كاتيونات ثنائية التكافؤ) (HBSS (w/o)) محلول هانكس الملح الموقوف (مع كاتيونات ثنائية التكافؤ) (HBSS (w)) قم بتحضير المحاليل التالية قبل بدء البروتوكول: محلول هانكس الملح الموقوف بدون كاتيونات ثنائية التكافؤ Ca2+ أو Mg2+ (HBSS (w/o)) محلول هانكس الملح الموقوف القياسي، أي الذي يحتوي على Ca2+ وMg2+ (HBSS (w)) اعتماداً على الحاتمة المستضدية (antigen epitope) المستهدفة في التطبيقات اللاحقة، استخدم إما طقم تفكيك الأنسجة العصبية القائم على الباباين (P) أو طقم تفكيك الأنسجة العصبية القائم على التربسين (T). قم بتحضير المحاليل التالية من طقم تفكيك الأنسجة العصبية: المحلول 2: أضف بيتا-مركبتو إيثانول ليصل التركيز إلى 0.067 ملي مولار. المحلول 4: أذب المسحوق في 0.7 مل من محلول التخزين المنظم (المتوفر في الطقم)، واخلطه برفق (تجنب استخدام جهاز الرج الميكانيكي vortex). مزيج الإنزيم 1: اسحب 1.9 مل من المحلول 2 و50 ميكرولتر من المحلول 1 (كلاهما من الطقم) باستخدام الماصة في أنبوب C، ثم حضنهما لمدة 10-15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. هذه الكمية كافية لتفكيك 400 ملجم من أنسجة الدماغ. 2. تفكيك الأنسجة العصبية زن أنسجة الدماغ في أنبوب يحتوي على 1 مل من HBSS (w/o). انقل دماغ الفأر إلى أنبوب C يحتوي على 1950 ميكرولتر من مزيج الإنزيم 1 المسخن مسبقاً. (ملاحظة: تمت كتابة هذا البروتوكول لكمية ≤ 400 ملجم، ولكن يمكن زيادة أحجام المحاليل لتستوعب ما يصل إلى 1600 ملجم من أنسجة الدماغ في أنبوب C الواحد). ضع أنبوب C على جهاز تفكيك gentleMACS وقم بتشغيل البرنامج "m_brain_01". قم بالتحضين مع التدوير (4 دورات في الدقيقة باستخدام جهاز تدوير أنابيب MACSmix) لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. ضع أنبوب C على جهاز تفكيك gentleMACS وقم بتشغيل البرنامج "m_brain_02". أثناء خطوة التفكيك، قم بتحضير 30 ميكرولتر من مزيج الإنزيم 2 لكل 400 ملجم من الأنسجة عن طريق خلط 20 ميكرولتر من المحلول 3 و10 ميكرولتر من المحلول 4 برفق. أضف مزيج الإنزيم 2 إلى أنبوب C عبر الغطاء المحكم بالسداد المطاطي (septum-sealed cap) واخلطه برفق دون استخدام جهاز الرج الميكانيكي. حضن أنبوب C مع التدوير لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية في الحاضنة. ضع أنبوب C على جهاز تفكيك gentleMACS وقم بتشغيل البرنامج "m_brain_03". حضن أنبوب C مع التدوير لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية في الحاضنة. قم بإجراء طرد مركزي لفترة وجيزة لتجميع العينة في قاع الأنبوب. 3. الترشيح اختر مرشحاً بحجم كافٍ للسماح بمرور الخلايا المستهدفة. على سبيل المثال، تكون خلايا بوركينجي كبيرة جداً بحيث لا تمر عبر مرشح 30 ميكرومتر، بينما تمر الخلايا الموجبة لبروتين Prominin-1. استخدم ماصة 1000 ميكرولتر مناسبة لسحب الخلايا من أنبوب C عبر الغطاء المحكم بالسداد المطاطي ووضعها على مرشح ما قبل الفصل المثبت على أنبوب تجميع سعة 15 مل. (ملاحظة: بالنسبة لأحجام العينات الأكبر، استخدم أنبوب تجميع سعة 50 مل). اغسل المرشح بـ 10 مل من HBSS (w). قم بإجراء طرد مركزي للخلايا المُرشحة عند 300 x g لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق السائل الطافي في الوسط أو المحلول المنظم الذي تختاره للتطبيقات اللاحقة. لإزالة حطام الميالين، استخدم حبيبات إزالة الميالين (Myelin Removal Beads). 4. نتيجة نموذجية: يرجى الاطلاع على الأشكال 1-3 الشكل 1: أدى تفكيك الدماغ باستخدام جهاز تفكيك gentleMACS إلى الحصول على خلايا حية بنسبة 97%، كما يظهر تحليل قياس التدفق الخلوي. الشكل 2: صورة بالمجهر الضوئي لتكون الكرات العصبية بعد فرز الخلايا مغناطيسياً باستخدام حبيبات Anti-Prominin-1 MicroBeads بعد 7 أيام من الزراعة في وسط MACS® NeuroMedium المدعم بـ MACS Supplement B27 PLUS. تم تحضير الخلايا من دماغ فأر CD1 (P3) باستخدام طقم تفكيك الأنسجة العصبية (P). الشكل 3: يؤدي وجود حطام الميالين في معلقات الخلايا المفردة إلى إضعاف عزل الخلايا بشكل كبير، وتؤدي إزالة حطام الميالين باستخدام حبيبات إزالة الميالين إلى زيادة كفاءة فصل الخلايا. بالنسبة لعمليات فصل MACS باستخدام حبيبات Anti-Prominin-1 MicroBeads، تم تفكيك دماغ فأر P22 باستخدام طقم تفكيك الأنسجة العصبية (P). استُخدمت الخلايا من معلق الخلايا المفردة إما مباشرة للفصل، أو خضعت لعملية استنزاف الميالين باستخدام حبيبات إزالة الميالين. وتظهر مقارنة الفصل بين العينات بدون إزالة الميالين والعينات مع إزالتها أن درجة النقاء أعلى في العينات التي خضعت لإزالة الميالين مسبقاً."http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx |
| MACSmix™ جهاز تدوير الأنابيب | ميلتيني بيوتيك (Miltenyi Biotec) | رقم الطلب 130-090-753 | <أداة الربط التشعبي (href)"http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx |
| طقم تفكيك الأنسجة العصبية (P) | Miltenyi Biotec | رقم الطلب 130-092-628 | <أو صفحة الويب (href=)"http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx |
| مرشحات ما قبل الفصل | Miltenyi Biotec | رقم الطلب 130-041-407 | <نظرًا للعمل في ظروف معقمة، يُوصى بتنفيذ جميع الخطوات داخل غطاء تدفق صفائحي. 1. المواد طقم تفكيك الأنسجة العصبية (P) (المكونات: المحلول 1 و2 و3 و4، ومحلول التخزين المنظم) مرشحات ما قبل الفصل (اختياري) حبيبات إزالة الميالين جهاز التفكيك gentleMACS أنابيب C مُدوِّر أنابيب MACSmix محلول هانكس الملح المنظم الخالي من الكاتيونات ثنائية التكافؤ (HBSS (w/o)) محلول هانكس الملح المنظم القياسي، أي الذي يحتوي على Ca2+ وMg2+ (HBSS (w)) قم بتحضير المحاليل التالية قبل البدء في البروتوكول: محلول هانكس الملح المنظم الخالي من الكاتيونات ثنائية التكافؤ Ca2+ أو Mg2+ (HBSS (w/o)) محلول هانكس الملح المنظم القياسي، أي الذي يحتوي على Ca2+ وMg2+ (HBSS (w)) اعتمادًا على الحاتمة المستضدية المستهدفة في التطبيقات اللاحقة، استخدم إما طقم تفكيك الأنسجة العصبية القائم على الباباين (P) أو طقم تفكيك الأنسجة العصبية القائم على التربسين (T). قم بتحضير المحاليل التالية من طقم تفكيك الأنسجة العصبية: المحلول 2: أضف بيتا-مركابتوإيثانول ليصل التركيز إلى 0.067 ملي مولار. المحلول 4: أذب المسحوق في 0.7 مل من محلول التخزين المنظم (المرفق مع الطقم)، وامزجه برفق (تجنب استخدام جهاز الرج vortex). خليط الإنزيم 1: اسحب 1.9 مل من المحلول 2 و50 ميكرولتر من المحلول 1 (كلاهما من الطقم) بواسطة الماصة في أنبوب C، واحضنه لمدة 10-15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. هذه الكمية كافية لتفكيك 400 مجم من أنسجة الدماغ. 2. تفكيك الأنسجة العصبية زن أنسجة الدماغ في أنبوب يحتوي على 1 مل من HBSS (w/o). انقل دماغ الفأر إلى أنبوب C يحتوي على 1950 ميكرولتر من خليط الإنزيم 1 المسخن مسبقًا. (ملاحظة: كُتب هذا البروتوكول لكتلة ≤ 400 مجم، ولكن يمكن زيادة أحجام المحاليل لاستيعاب ما يصل إلى 1600 مجم من أنسجة الدماغ لكل أنبوب C). ضع أنبوب C على جهاز التفكيك gentleMACS وقم بتشغيل البرنامج "m_brain_01". احضن العينة مع التدوير (بسرعة 4 دورات في الدقيقة باستخدام مُدوِّر أنابيب MACSmix) لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. ضع أنبوب C على جهاز التفكيك gentleMACS وقم بتشغيل البرنامج "m_brain_02". أثناء خطوة التفكيك، قم بتحضير 30 ميكرولتر من خليط الإنزيم 2 لكل 400 مجم من الأنسجة عن طريق خلط 20 ميكرولتر من المحلول 3 و10 ميكرولتر من المحلول 4 برفق. أضف خليط الإنزيم 2 إلى أنبوب C عبر الغطاء المختوم بـ "سيبتم" وامزجه برفق دون استخدام جهاز الرج. احضن أنبوب C مع التدوير لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية في الحاضنة. ضع أنبوب C على جهاز التفكيك gentleMACS وقم بتشغيل البرنامج "m_brain_03". احضن أنبوب C مع التدوير لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية في الحاضنة. قم بإجراء طرد مركزي وجيز لتجميع العينة في قاع الأنبوب. 3. الترشيح اختر مرشحًا بحجم كافٍ للسماح بمرور الخلايا المستهدفة. على سبيل المثال، تكون خلايا بوركينجي كبيرة جدًا بحيث لا تمر عبر مرشح 30 ميكرومتر، بينما تمر الخلايا الموجبة لبروتين Prominin-1. استخدم ماصة 1000 ميكرولتر مناسبة لسحب الخلايا من أنبوب C عبر الغطاء المختوم بـ "سيبتم" ووضعها في مرشح ما قبل الفصل المثبت على أنبوب تجميع سعة 15 مل. (ملاحظة: لأحجام العينات الأكبر، استخدم أنبوب تجميع سعة 50 مل). اغسل المرشح بـ 10 مل من HBSS (w). قم بإجراء طرد مركزي للخلايا المرشحة عند 300 x g لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق الراسب في الوسط أو المحلول المنظم الذي تختاره للتطبيقات اللاحقة. لإزالة حطام الميالين، استخدم حبيبات إزالة الميالين. 4. نتيجة نموذجية: يرجى الاطلاع على الأشكال 1-3 الشكل 1: أدى تفكيك الدماغ باستخدام جهاز التفكيك gentleMACS إلى الحصول على خلايا حية بنسبة 97%، كما يظهر تحليل قياس التدفق الخلوي. الشكل 2: صورة مجهرية ضوئية لتكوين الكرات العصبية بعد فرز الخلايا مغناطيسيًا باستخدام حبيبات MicroBeads المضادة لبروتين Prominin-1 بعد 7 أيام من الزراعة في وسط MACS® NeuroMedium المدعم بـ MACS Supplement B27 PLUS. تم تحضير الخلايا من دماغ فأر CD1 (P3) باستخدام طقم تفكيك الأنسجة العصبية (P). الشكل 3: يؤدي وجود حطام الميالين في معلقات الخلايا المفردة إلى إعاقة عزل الخلايا بشكل كبير، وتؤدي إزالة حطام الميالين بواسطة حبيبات إزالة الميالين إلى زيادة كفاءة فصل الخلايا. لإجراء عمليات فصل MACS باستخدام حبيبات MicroBeads المضادة لبروتين Prominin-1، تم تفكيك دماغ فأر P22 باستخدام طقم تفكيك الأنسجة العصبية (P). استُخدمت الخلايا من معلق الخلايا المفردة إما مباشرة للفصل، أو خضعت لعملية استنزاف الميالين باستخدام حبيبات إزالة الميالين. وتُظهر مقارنة الفصل بين العينات التي خضعت لإزالة الميالين وتلك التي لم تخضع لها أن النقاء يكون أعلى في العينات التي سبق إزالة الميالين منها."http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx |
| خرزات Anti-Prominin-1 الدقيقة | Miltenyi Biotec | رقم الطلب 130-092-333 | <أنا آسف، ولكن يبدو أن النص المصدر الذي قدمته يتكون فقط من وسم HTML غير مكتمل (`a href=`). يرجى تزويدي بالنص العلمي الكامل الذي ترغب في ترجمته لكي أتمكن من تنفيذ المهمة وفقاً للمعايير المهنية المطلوبة."http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_654_524_Anti_Prominin_1_MicroBeads.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_654_524_Anti_Prominin_1_MicroBeads.aspx |
| Anti-Prominin-1-APC | Miltenyi Biotec | رقم الطلب 130-092-335 | <أدوات ومواد العمل: لضمان العمل في ظروف معقمة، يوصى بتنفيذ جميع الخطوات داخل خزانة تدفق هوائي صفائحي. 1. المواد: طقم تفكيك الأنسجة العصبية (P) (المكونات: المحلول 1، و2، و3، و4، ومحلول التخزين المنظم) مرشحات ما قبل الفصل (اختياري) خرزات إزالة الميالين (Myelin Removal Beads) جهاز تفكيك الخلايا gentleMACS Dissociator أنابيب من النوع C جهاز تدوير أنابيب MACSmix محلول هانكس الملح المنظم بدون كاتيونات ثنائية التكافؤ (HBSS (w/o)) محلول هانكس الملح المنظم القياسي، أي الذي يحتوي على Ca2+ وMg2+ (HBSS (w)) قم بتحضير المحاليل التالية قبل بدء البروتوكول: محلول هانكس الملح المنظم بدون كاتيونات ثنائية التكافؤ Ca2+ أو Mg2+ (HBSS (w/o)) محلول هانكس الملح المنظم القياسي، أي الذي يحتوي على Ca2+ وMg2+ (HBSS (w)) بناءً على الحاتمة المستضدية (antigen epitope) المستهدفة في التطبيقات اللاحقة، استخدم إما طقم تفكيك الأنسجة العصبية القائم على الباباين (P) أو طقم تفكيك الأنسجة العصبية القائم على التريبسين (T). قم بتحضير المحاليل التالية من طقم تفكيك الأنسجة العصبية: المحلول 2: أضف بيتا-مركابتويثانول ليصل التركيز إلى 0.067 ملي مولار. المحلول 4: أذب المسحوق في 0.7 مل من محلول التخزين المنظم (المرفق في الطقم)، واخلطه بلطف (تجنب استخدام جهاز الرج الميكانيكي/vortex). مزيج الإنزيم 1: انقل بواسطة الماصة 1.9 مل من المحلول 2 و50 ميكرولتر من المحلول 1 (كلاهما من الطقم) إلى أنبوب C، واحضنه لمدة 10-15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. هذه الكمية كافية لتفكيك 400 مجم من أنسجة الدماغ. 2. تفكيك الأنسجة العصبية: زن أنسجة الدماغ في أنبوب يحتوي على 1 مل من محلول HBSS (w/o). انقل دماغ الفأر إلى أنبوب C يحتوي على 1950 ميكرولتر من مزيج الإنزيم 1 المُسخن مسبقاً. (ملاحظة: هذا البروتوكول مكتوب لكتلة ≤ 400 مجم، ولكن يمكن زيادة أحجام المحاليل لتستوعب ما يصل إلى 1600 مجم من أنسجة الدماغ لكل أنبوب C). ضع أنبوب C على جهاز gentleMACS Dissociator وقم بتشغيل البرنامج "m_brain_01". احضن العينة مع التدوير (بسرعة 4 دورات في الدقيقة باستخدام جهاز تدوير أنابيب MACSmix) لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. ضع أنبوب C على جهاز gentleMACS Dissociator وقم بتشغيل البرنامج "m_brain_02". خلال خطوة التفكيك، قم بتحضير 30 ميكرولتر من مزيج الإنزيم 2 لكل 400 مجم من الأنسجة عن طريق خلط 20 ميكرولتر من المحلول 3 و10 ميكرولتر من المحلول 4 بلطف. أضف مزيج الإنزيم 2 إلى أنبوب C عبر الغطاء المختوم بسدادة (septum)، واخلطه بلطف دون استخدام جهاز الرج الميكانيكي. احضن أنبوب C مع التدوير لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية في الحاضنة. ضع أنبوب C على جهاز gentleMACS Dissociator وقم بتشغيل البرنامج "m_brain_03". احضن أنبوب C مع التدوير لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية في الحاضنة. قم بإجراء طرد مركزي لفترة وجيزة لتجميع العينة في قاع الأنبوب. 3. الترشيح: اختر مرشحاً بحجم يسمح بمرور الخلايا المستهدفة. على سبيل المثال، تعتبر خلايا بوركينجي كبيرة جداً بحيث لا يمكنها المرور عبر مرشح 30 ميكرومتر، بينما تمر خلايا +Prominin-1. استخدم ماصة 1000 ميكرولتر مناسبة لسحب الخلايا من أنبوب C عبر الغطاء المختوم بسدادة، ثم ضعها في مرشح ما قبل الفصل المثبت على أنبوب تجميع سعة 15 مل. (ملاحظة: بالنسبة لأحجام العينات الأكبر، استخدم أنبوب تجميع سعة 50 مل). اغسل المرشح بـ 10 مل من محلول HBSS (w). قم بإجراء طرد مركزي للخلايا المرشحة عند 300 x g لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق الراسب في الوسط أو المحلول المنظم الذي تختاره للتطبيقات اللاحقة. لإزالة حطام الميالين، استخدم خرزات إزالة الميالين (Myelin Removal Beads). 4. نتيجة ممثلة: يرجى الاطلاع على الأشكال 1-3. الشكل 1: أدى تفكيك الدماغ باستخدام جهاز gentleMACS Dissociator إلى الحصول على خلايا حية بنسبة 97%، كما يظهر تحليل قياس التدفق الخلوي. الشكل 2: صورة مجهر ضوئي لتكوين الكرات العصبية بعد فرز الخلايا مغناطيسياً باستخدام MicroBeads المضادة لـ Prominin-1 بعد 7 أيام من الزراعة في وسط MACS® NeuroMedium المدعم بـ MACS Supplement B27 PLUS. تم تحضير الخلايا من دماغ فأر CD1 (P3) باستخدام طقم تفكيك الأنسجة العصبية (P). الشكل 3: يؤدي وجود حطام الميالين في معلقات الخلايا المفردة إلى إعاقة عزل الخلايا بشكل كبير، وتؤدي إزالة حطام الميالين بواسطة خرزات إزالة الميالين إلى زيادة كفاءة فصل الخلايا. بالنسبة لعمليات فصل MACS باستخدام MicroBeads المضادة لـ Prominin-1، تم تفكيك دماغ فأر P22 باستخدام طقم تفكيك الأنسجة العصبية (P). استخدمت الخلايا من معلق الخلايا المفردة إما مباشرة للفصل، أو خضعت لعملية استنفاد الميالين باستخدام خرزات إزالة الميالين. وتظهر مقارنة الفصل بين العينات التي لم تخضع لإزالة الميالين وتلك التي خضعت لها أن النقاوة تكون أعلى في العينات التي تمت إزالة الميالين منها مسبقاً."http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_525_Anti_Prominin_1.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_525_Anti_Prominin_1.aspx |
| خرزات إزالة الميالين | Miltenyi Biotec | رقم الطلب 130-094-544 | <أنا آسف، ولكن النص المصدري المقدم يتكون فقط من وسوم برمجية غير مكتملة (`a href=`) ولا يحتوي على أي محتوى علمي أو نصي لترجمته. يرجى تزويدي بالنص الذي ترغب في ترجمته."http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_688_Myelin_Removal_Beads.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_688_Myelin_Removal_Beads.aspx |
| رؤوس ماصات Art 1000 ذات المدى الطويل | المنتجات البيولوجية الجزيئية | رقم الطلب 2079 | http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61<للعمل في ظروف معقمة، يُوصى بتنفيذ جميع الخطوات داخل غطاء تدفق صفائحي (laminar flow hood). 1. المواد طقم تفكيك الأنسجة العصبية (P) (المكونات: المحلول 1، و2، و3، و4، ومحلول التخزين المنظم) مرشحات ما قبل الفصل (اختيارية) خرزات إزالة الميالين (Myelin Removal Beads) جهاز التفكيك gentleMACS Dissociator أنابيب من النوع C جهاز تدوير الأنابيب MACSmix Tube Rotator محلول هانكس الملح المنظم الخالي من الكاتيونات ثنائية التكافؤ (HBSS (w/o)) محلول هانكس الملح المنظم القياسي، أي المحتوي على Ca2+ وMg2+ (HBSS (w)) قم بتحضير المحاليل التالية قبل البدء في البروتوكول: محلول هانكس الملح المنظم الخالي من الكاتيونات ثنائية التكافؤ Ca2+ أو Mg2+ (HBSS (w/o)) محلول هانكس الملح المنظم القياسي، أي المحتوي على Ca2+ وMg2+ (HBSS (w)) اعتماداً على الحاتمة المستضدية (antigen epitope) المستهدفة في التطبيقات اللاحقة، استخدم إما طقم تفكيك الأنسجة العصبية القائم على الباباين (P) أو طقم تفكيك الأنسجة العصبية القائم على التريبسين (T). قم بتحضير المحاليل التالية من طقم تفكيك الأنسجة العصبية: المحلول 2: أضف بيتا-مركابتويثانول ليصل التركيز إلى 0.067 ملي مولار. المحلول 4: أذب المسحوق في 0.7 مل من محلول التخزين المنظم (المرفق في الطقم)، واخلطه بلطف (تجنب استخدام جهاز الرج vortex). خليط الإنزيم 1: انقُل بواسطة الماصة 1.9 مل من المحلول 2 و50 ميكرولتر من المحلول 1 (كلاهما من الطقم) إلى أنبوب C، وحضنه لمدة 10-15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. هذه الكمية كافية لتفكيك 400 مجم من أنسجة الدماغ. 2. تفكيك الأنسجة العصبية زن أنسجة الدماغ في أنبوب يحتوي على 1 مل من HBSS (w/o). انقُل دماغ الفأر إلى أنبوب C يحتوي على 1950 ميكرولتر من خليط الإنزيم 1 المسخن مسبقاً. (ملاحظة: كُتب هذا البروتوكول لكمية ≤ 400 مجم، ولكن يمكن زيادة أحجام المحاليل لتستوعب ما يصل إلى 1600 مجم من أنسجة الدماغ لكل أنبوب C). ضع أنبوب C على جهاز gentleMACS Dissociator وقم بتشغيل البرنامج "m_brain_01". حضن العينة مع التدوير (4 دورات في الدقيقة باستخدام جهاز MACSmix Tube Rotator) لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. ضع أنبوب C على جهاز gentleMACS Dissociator وقم بتشغيل البرنامج "m_brain_02". خلال خطوة التفكيك، حضر 30 ميكرولتر من خليط الإنزيم 2 لكل 400 مجم من الأنسجة عن طريق خلط 20 ميكرولتر من المحلول 3 و10 ميكرولتر من المحلول 4 بلطف. أضف خليط الإنزيم 2 إلى أنبوب C عبر الغطاء المحكم بالسدادة (septum-sealed cap) واخلطه بلطف دون استخدام جهاز الرج. حضن أنبوب C مع التدوير لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية في الحاضنة. ضع أنبوب C على جهاز gentleMACS Dissociator وقم بتشغيل البرنامج "m_brain_03". حضن أنبوب C مع التدوير لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية في الحاضنة. قم بإجراء طرد مركزي سريع لتجميع العينة في قاع الأنبوب. 3. الترشيح اختر مرشحاً كبيراً بما يكفي للسماح بمرور الخلايا المستهدفة. فعلى سبيل المثال، تكون خلايا بوركينجي (Purkinje cells) كبيرة جداً بحيث لا تمر عبر مرشح 30 ميكرومتر، بينما تمر الخلايا الموجبة لبروتين Prominin-1+. استخدم ماصة 1000 ميكرولتر مناسبة لسحب الخلايا من أنبوب C عبر الغطاء المحكم بالسدادة، ثم ضعها على مرشح ما قبل الفصل المثبت على أنبوب تجميع سعة 15 مل. (ملاحظة: لأحجام العينات الأكبر، استخدم أنبوب تجميع سعة 50 مل). اغسل المرشح بـ 10 مل من HBSS (w). قم بطرد الخلايا المُرشحة مركزياً عند 300 x g لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق الرائق في الوسط أو المحلول المنظم المختار للتطبيقات اللاحقة. لإزالة حطام الميالين، استخدم خرزات إزالة الميالين (Myelin Removal Beads). 4. نتيجة نموذجية: يرجى الاطلاع على الأشكال 1-3 الشكل 1: أدى تفكيك الدماغ باستخدام جهاز gentleMACS Dissociator إلى الحصول على خلايا حيوية بنسبة 97%، كما يظهر تحليل قياس التدفق الخلوي. الشكل 2: صورة بالمجهر الضوئي لتكون الكرات العصبية (neurosphere) بعد فرز الخلايا مغناطيسياً باستخدام خرزات Anti-Prominin-1 MicroBeads بعد 7 أيام من الزراعة في وسط MACS® NeuroMedium المدعم بـ MACS Supplement B27 PLUS. تم تحضير الخلايا من دماغ فأر من سلالة CD1 (P3) باستخدام طقم تفكيك الأنسجة العصبية (P). الشكل 3: يؤدي وجود حطام الميالين في معلقات الخلايا المفردة إلى إعاقة عزل الخلايا بشكل كبير، وتؤدي إزالة حطام الميالين بواسطة خرزات إزالة الميالين إلى زيادة كفاءة فصل الخلايا. بالنسبة لعمليات فصل MACS باستخدام خرزات Anti-Prominin-1 MicroBeads، تم تفكيك دماغ فأر P22 باستخدام طقم تفكيك الأنسجة العصبية (P). استُخدمت الخلايا من معلق الخلايا المفردة إما مباشرة للفصل، أو خضعت لعملية استنفاد الميالين باستخدام خرزات إزالة الميالين. وتظهر مقارنة الفصل بين العينات بدون إزالة الميالين والعينات مع إزالته أن النقاوة تكون أعلى في العينات التي خضعت لإزالة الميالين مسبقاً.><أداة الربط التشعبي (a href=)"http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html">http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html |
| طقم تفكيك الأنسجة العصبية (T) | ميلتيني بيوتك (Miltenyi Biotec) | رقم الطلب 130-093-231 | <رابط تشعبي ="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx |
| محلول يوديد البروبيديوم | ميلتيني بيوتك (Miltenyi Biotec) | رقم الطلب 130-093-233 | <أداة الربط التشعبي (a href=)"http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx |
المراجع
- Hardt, O., Scholz, C., Küsters, D., Yanagawa, Y., Pennartz, S., Cremer, H., Bosio, A. Gene expression analysis defines differences between region-specific GABAergic neurons. Mol Cell Neurosci. 39, 418-428 (2008).
- Lee, J. K., McCoy, M. K., Harms, A. S., Ruhn, K. A., Gold, S. J., Tansey, M. G. Regulator of G-protein signaling 10 promotes dopaminergic neuron survival via regulation of the microglial inflammatory response. J Neurosci. 28, 8517-8528 (2008).
- Környei, Z., Gócza, E., Rühl, R., Orsolits, B., Vörös, E., Szabó, B., Vágovits, B., Madarász, E. Astroglia-derived retinoic acid is a key factor in glia-induced neurogenesis. FASEB J. 21, 2496-2509 (2007).
- Meylan, F., Davidson, T. S., Kahle, E., Kinder, M., Acharya, K., Jankovic, D., Bundoc, V., Hodges, M., Shevach, E. M., Keane-Myers, A., Wang, E. C., Siegel, R. M. The TNF-family receptor DR3 is essential for diverse T cell-mediated inflammatory diseases. Immunity. 29, 79-89 (2008).
- Skog, J., Würdinger, T., van Rijn, S., Meijer, D. H., Gainche, L., Sena-Esteves, M., Curry, W. T. Jr, Carter, B. S., Krichevsky, A. M., Breakefield, X. O. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nat Cell Biol. 10, 1470-1476 (2008).
إعادة الطباعة والأذونات
