حفز Phosphoproteomics الكمية في الأحماض الدهنية السكيراء الجعوية</em

ملخص

وصف إجراء الفسفرة باستخدام كمية cryolysis ، solubilziation اليوريا ، وتجزيء HILIC تخصيب IMAC من الببتيدات فسفرته.

الملخص

يصف هذا البروتوكول في نمو والتحفيز ، مع أوليئات الأحماض الدهنية ، الثقيلة والخفيفة isotopically خلايا خميرة س. هي الأرض الخلايا باستخدام إجراء cryolysis في كرة مطحنة مطحنة وgrindate الناتجة جلبت الى حل عن طريق solubilization اليوريا. هذا الإجراء يسمح للتحلل الخلايا في دولة غير نشطة عملية الأيض ، والحفاظ على الفسفرة ومنع إعادة توجيه phosphoproteome أثناء تحلل الخلية. بعد التخفيض ، ألكلة ، تربسين هضم البروتينات ، والمحلاة العينات على أعمدة C18 وتعقيد العينة بنسبة تجزئة باستخدام ماء التفاعل اللوني (HILIC). أعمدة HILIC الاحتفاظ تفضيلي الجزيئات المائية التي هي مناسبة تماما لphosphoproteomics. الببتيدات فسفرته تميل إلى أزل في وقت لاحق ملف الكروماتوغرافي من نظرائهم من غير فسفرته. بعد التجزيء ، وأثرى به phosphopeptides يجمد اللوني المعادن ، الذي يعتمد على المسؤول القائم على الانتماءات لتخصيب phosphopeptide. في نهاية هذا الإجراء العينات مستعدون ليتم تحليلها كميا بواسطة مطياف الكتلة.

البروتوكول

نمو الخلايا وسائل الإعلام

1. مستعمرة واحدة من خلايا BY4742Δarg4Δlys1 بين عشية وضحاها في وسائل الإعلام 100 مل الغنية إلى OD ₆₀₀ من البذور ثم 1.0 في الثقافات 1 ثنائية لتر من الخميرة المتوسطة الحد الأدنى (0.17 ٪ النيتروجين الخميرة قاعدة دون سلفات الأمونيوم أو الأحماض الأمينية ، و 0.5 ٪ كبريتات الامونيوم) تحتوي على كاملة مكملة من الأحماض الأمينية ، وتستكمل مع L / 20mg من أرجينين isotopically العادي أو الثقيل ⁽¹³ C N _{4 6} ¹⁵ ؛ Isotec) ويسين ⁽¹³ ₆ ¹⁵ C N ₂

المناقشة

وهذه الطريقة تؤدي الى تخصيب phosphopeptides التي يمكن تحليلها كميا. ويمكن تغيير عدد من المعلمات في هذا البروتوكول ، ولكن الجانب الأكثر أهمية هو أن نتذكر للحفاظ على الفسفرة الخاص. لا يمكن أن يتحقق إعداد الخلايا لالكمي في عدد من طرق مختلفة ، على سبيل المثال اذا كنت لا تستطيع تسمية الخلايا الخاصة بك في العلامات ، فيفو مثل ICAT [3] أو ITRAC [4] ويمكن استخدام استخراج آخر لتسمية تفاضليا ثقافتين لالكمي الأغراض.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
Isotec™ L-Arginine-13C6,15N4	Sigma-Aldrich	608033
Isotec™ L-Lysine-15N2	Sigma-Aldrich	609021
محلول GIBCO™ الفوسفاتي المنظم (PBS) 7.4 (10X) سائل	Invitrogen	70011044
أقراص SigmaFAST المثبطة للبروتياز	Sigma-Aldrich	S8820
مزيج Pierce Halt المثبط للفوسفاتاز	Thermo Fisher Scientific, Inc.	78420
مطحنة الكرات Retsch PM100	Retsch	20.540.0001
وعاء طحن من الفولاذ المقاوم للصدأ سعة 125 ml من Retsch	Retsch	01.462.0148
عمود Ultramicrospin C18	The Nest Group	SUM SS10
Sep-Pak Vac 500 mg C18	Waters	WAT043395
عمود تحليل TSK-Gel Amide-80 بمقاس 4.6 mm x 25 cm	Tosoh Corp.	13071	هذا هو عمود الكروماتوغرافيا HILIC.
عمود حماية بمقاس 4.6 mm ID x1 cm	Tosoh Corp.	19021	نوصي باستخدام عمود الحماية هذا لإطالة عمر عمود HILIC الخاص بك.
هلام ألفية الحديد PHOS-Select™	Sigma-Aldrich	P9740	هذا هو راتنج IMAC. قم بتقسيمه إلى حصص وتخزينه.