التجويف البريتوني في الثدييات يحتوي على مجموعات سكانية مختلفة عن الخلايا المناعية حاسمة الاستجابات المناعية الفطرية. مطلوب وسيلة فعالة لعزلة التحليلات الكيميائية الحيوية والوظيفية لهذه الخلايا. هنا نقدم وسيلة شاملة لعزل الخلايا التجويف البريتوني في الماوس.
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
التجويف البريتوني هو غشاء التجويف محدد والسوائل تملأ البطن من الثدييات ، والذي يحتوي على الكبد والطحال ومعظم القناة الهضمية والأحشاء الأخرى. انها تؤوي عددا من الخلايا المناعية بما الضامة ، وخلايا B وخلايا T. وجود عدد كبير من السذاجة الضامة في التجويف البريتوني يجعله الموقع المفضل لجمع المقيم الأنسجة الضامة ساذجة (1). التجويف البريتوني مهم أيضا لدراسة الخلايا البائية بسبب وجود التجويف البريتوني فريدة المقيمة B فرعية الخلية المعروفة باسم خلايا B1 بالإضافة إلى الخلايا B2 التقليدية. وتنقسم الخلايا الى خلايا B1 B1a B1b والتي يمكن تمييزها عن طريق التعبير سطح CD11b وCD5. B1 الخلايا تشكل مصدرا هاما من الغلوبولين المناعي الطبيعي في وقت مبكر وتوفير الحماية من مجموعة متنوعة من العوامل الممرضة (2-4). هذه الخلايا هي autoreactive في الطبيعة (5) ، ولكن لا تزال كيفية السيطرة عليها لمنع المناعة الذاتية غير مفهومة تماما. على العكس من ذلك ، CD5
البروتوكول
- قبل البدء في العملية ، في البنود التالية يجب أن يتم جمعها وإعدادها ل:
- جليد
- 5ml المحاقن مع إبرة 27G
- 5ml المحاقن مع إبرة 25G
- الستايروفوم كتلة ودبابيس لتركيب الماوس
- الدرج الذي يمكن أن توضع كتلة متزايدة
- مقص وملقط
- مجموعة أنابيب
- 70 ٪ من الإيثانول
- برنامج تلفزيوني مع 3 ٪ الجنين مصل العجل (FCS) (ما قبل المبردة ويحرص على الجليد)
- الموت ببطء الماوس ، رش عليه مع الايثانول 70 ٪ وجبل على كتلة الستايروفوم على ظهرها.
- باستخدام مقص وملقط قطع الجلد الخارجي للالصفاق وسحب بلطف مرة أخرى إلى تعريض الجلد الداخلي المبطن للتجويف البريتوني.
- ضخ 5 مل من الجليد الباردة PBS (FCS مع 3 ٪) في التجويف البريتوني باستخدام إبرة 27G. دفع الإبرة ببطء في الصفاق والحرص على عدم ثقب أي الأجهزة.
- بعد الحقن ، والتدليك بلطف البريتوني لإزاحة أي خلايا يعلق في حل برنامج تلفزيوني.
- ادخال ابرة ز 25 ، شطبة الأعلى ، تعلق حقنة 5 مل في الصفاق وجمع السائل أثناء تحريك رأس الإبرة بلطف لتجنب انسداد من الأنسجة الدهنية أو غيرها من الأجهزة. جمع أكبر قدر ممكن من السوائل ودائع تعليق الخلية التي تم جمعها في أنابيب أبقى على الجليد بعد إزالة الإبرة من المحاقن.
اختياري : كرر الخطوة 4-6 - إجراء شق في الجلد الداخلي للالصفاق وبينما جعل من الجلد مع ملقط استخدام البلاستيك باستور ماصة لتجميع السائل المتبقي من التجويف.
- في الخطوة إذا تم الكشف عن 6 أو 7 تلوث دم مرئي ثم ينبغي أن يكون تجاهل عينة ملوثة.
- تدور تعليق الخلية التي تم جمعها في 1500 دورة في الدقيقة لمدة 8 دقائق ، وتجاهل وطاف resuspend الخلايا في وسائل الإعلام المطلوب أو برنامج تلفزيوني عن العد.
أثار بروتوكول بديلة للحصول على thioglycollate الضامة :
وتستخدم هذه الطريقة للحصول على اعلى محصول الضامة.
- ضخ 5 مل من 3 ٪ (W / V) بروير thioglycollate المتوسطة (7) في التجويف البريتوني كل الماوس.
- الانتظار لمدة 3-5 أيام ، والشروع في الخطوة 1 أعلاه لجمع الخلايا.
بالمقارنة مع نهج nonelicited ، يمكن جمع ما يقرب من 10 مرات أكثر الضامة. القلق الوحيد هو أن الضامة التي حصل عليها هذا الإجراء تختلف في بعض خصائصها الفسيولوجية.
ممثل النتائج :
من الماوس unmanipulated ، يمكن الحصول على الخلايا 5-10000000 التجويف البريتوني مع بروتوكول العزل الجيد. بين جميع الخلايا الحية ، 50-60 ٪ من خلايا B ، ~ الضامة 30 ٪ و 5-10 ٪ من خلايا تي (الشكل 1).
الشكل 1. النمط الظاهري من الخلايا المعزولة من التجويف البريتوني. كانت ملطخة بعد العزلة من الخلايا التجويف البريتوني أنها معادية للماوس TCRβ - FITC ، B220 - PE - تكساس أحمر ، أزرق CD11b والمحيط الهادئ ، CD23 - PE - Cy7 وCD5 APC. قطع تدفق ممثل cytometric تظهر النسب المئوية للخلايا B و T (أ) ، الضامة (ب) ، B1 و B2 الخلايا (ج) و B1a وB1b الخلايا (د).
المناقشة
عزل خلايا التجويف البريتوني هو تقنية هامة لدراسة الخلايا المناعية المختلفة ، الضامة في المقام الأول ومجموعات فرعية محددة الخلية باء. على الرغم من أن هذه عملية بسيطة ، وهناك بعض الخطوات الحاسمة المعنية. وينبغي تجنب وجود تلوث الدم في العينة التي تم جمعها للحصول على خلايا نقي التجويف البريتوني السكان. وينبغي أن يتم عن طريق القتل الرحيم خلع عنق الرحم بعناية لتجنب تلوث الدم في التجويف البريتوني. بدلا من ذلك يمكن استخدام ثاني أكسيد الكربون 2. بالإضافة إلى ذلك ، ينبغي خلال الرعاية الإجراء المناسب الواجب اتخاذها لتجنب ثقب في المثانة أو أي أجهزة أخرى في التجويف البريتوني. يتعافى معظم حقن السائل المهم أيضا أن العائد الخلية.
ويستخدم على نطاق واسع هذا الإجراء لدراسة البيولوجيا بلعم منذ أعداد متوسطة من المقيمين ، ويمكن بسهولة الضامة unstimulated يمكن الحصول عليها من التجويف البريتوني ، خلافا لمهمة شاقة للتمييز الخلايا الاصلية في النخاعي الضامة ناضجة في المختبر ، وذلك باستخدام عامل تحفيز مستعمرة البلاعم (8 ، 9). ويمكن تحسين العائد بلعم من التجويف البريتوني باستخدام أسلوب الاستنباط thioglycollate ، على الرغم من استخدام thioglycollate قد يغير الخصائص الفيزيولوجية للالضامة (7).
خلايا B هي جزء مهم من نظام المناعة لدينا تلعب أدوارا حاسمة في كل من الحصانة الفطرية والتكيفية. بين مختلف المجموعات السكانية الفرعية الخلية B ، B1 خلايا تضم مجموعة فرعية فريدة من الخلايا باء المشاركة في الحصانة الفطرية ، والمناعة الذاتية وتنظيم المناعة. وتقع في المقام الأول خلايا B1 في التجويف البريتوني وتجديد الذات. فهي واحدة من المنتجين الأساسي للالغلوبولين المناعي الطبيعي الذي يوفر الخط الأول للحماية ضد عدد من الفيروسات والبكتيريا (10-12). الخلايا B1 هي أيضا مصدرا رئيسيا للIL - 10 (6) ، وهو خلوى هامة تشارك في تنظيم المناعة. وإن كانت قد اتبعت العديد من الدراسات مع الخلايا B1 ، لا يزال هناك مجال لمزيد من التقييم لمهامهم المتناقضة ، وخاصة دورها التنظيمي. البريتوني العزلة تجويف الخلية الأسلوب يوفر فرصة فريدة لدراسة وظائف الخلايا B1.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة منح AI069358 ومؤسسة البحوث BloodCenter.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| وسط الثيوجليكولات، تعديل بروير | BD Biosciences | 211716 |
المراجع
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Current Protocols in Immunology. , (2008).
- Boes, M., Prodeus, A. P., Schmidt, T., Carroll, M. C., Chen, J. A critical role of natural immunoglobulin M in immediate defense against systemic bacterial infection. J. Exp. Med. 188, 2381-2386 (1998).
- Mc Daniel, L. S., Benjamin, W. H., Forman, C., Briles, D. E. Blood clearance by anti-phosphocholine antibodies as a mechanism of protection in experimental pneumococcal bacteremia. J. Immunol. 133, 3308-3312 (1984).
- Paciorkowski, N., Porte, P., Shultz, L. D., Rajan, T. V. B1 B lymphocytes play a critical role in host protection against lymphatic filarial parasites. J. Exp. Med. 191, 731-736 (2000).
- Mercolino, T. J., Arnold, L. W., Hawkins, L. A., Haughton, G. Normal mouse peritoneum contains a large population of Ly-1+ (CD5) B cells that recognize phosphatidyl choline: relationship to cells that secrete hemolytic antibody specific for autologous erythrocytes. J. Exp. Med. 168, 687-698 (1988).
- O'Garra, A., Chang, R., Go, N., Hastings, R., Haughton, G., Howard, M. Ly-1 B (B-1) cells are the main source of B cell derived interleukin 10. Eur. J. Immunol. 22, 711-717 (1992).
- Hoover, D. L., Nacy, C. A. Macrophage activation to kill Leishmania tropica: Defective intracellular killing of amastigotes by macrophages elicited with sterile inflammatory agents. J. Immunol. 132, 1487-1491 (1984).
- Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. J. Cell Physiol. 77, 121-134 (1971).
- Stanley, E. R. The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1. Methods Enzymol. 116, 564-587 (1985).
- Baumgarth, N., Chen, J., Herman, O. C., Jager, G. C., Herzenberg, L. A. The role of B-1 and B-2 cells in immune protection from influenza virus infection. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 252, 163-169 (2000).
- Baumgarth, N., Herman, O. C., Jager, G. C., Brown, L. E., Herzenberg, L. A., Chen, J. B-1 and B-2 cell-derived immunoglobulin M antibodies are nonredundant components of the protective response to influenza virus infection. J. Exp. Med. 192, 271-280 (2000).
- Berland, R., Wortis, H. H. Origins and functions of B-1 cells with notes on the role of CD5. Annu. Rev. Immunol. 20, 253-300 (2002).
إعادة الطباعة والأذونات
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن