Method Article

تصور المجمعات الجزيئية واحدة في فيفو استخدام الميكروسكوب الإسفار متقدم

DOI:

10.3791/1508

September 8th, 2009

In This Article

Summary

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن هنا لشرح البروتوكولات لأداء المفرد جزيء مضان المجهري على الخلايا البكتيرية الحية للتمكن من الكشف عن مجمعات الجزيئية وظيفية ، ومجنزرة كميا.

Abstract

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويمكن تحقيق الرؤية الكاملة في آليات الخلايا الحية فقط من خلال التحقيق في العمليات الرئيسية والمباشرة التي تثير الأحداث على المستوى الخلوي. إلى تاريخ القص تعقيد النظم البيولوجية تسبب دقيقة واحدة جزيء التجارب لتكون بعيدة جدا يطالبون ، والتركيز بدلا من ذلك على دراسة النظم واحد باستخدام معظم الخام نسبيا الفرقة المتوسط ​​القياسات. ومع ذلك ، العديد من العمليات الهامة تحدث في الخلية الحية على مستوى واحد فقط أو جزيئات قليلة ؛ القياسات فرقة القناع عموما الطبيعة العشوائية وغير المتجانسة من هذه الأحداث. هنا ، وذلك باستخدام المجهر الضوئي المتطورة والأدوات التحليلية لتحليل الصور ونحن لشرح كيفية رصد البروتينات داخل الخلية الحية واحد البكتيرية إلى دقة واحدة من الجزيئات ، وكيف يمكننا مراقبة ديناميكية داخل مجمعات الجزيئية في أداء الأجهزة البيولوجية. التقنيات ذات الصلة مباشرة من الناحية الفسيولوجية. فهي طفيفة ، perturbative وغير الغازية لعينة بيولوجية هي قيد الدراسة ومتفهمين تماما عن التحقيقات في المادة الحية ، وميزات لا تتوافر لنهج واحد جزيء آخر من الفيزياء الحيوية. بالإضافة إلى ذلك ، درس جميع العينات البيولوجية إنتاج البروتين fluorescently الموسومة على المستويات التي تكاد تكون متطابقة مع سلالات خلايا معدلة ("ترميز الجينومية") ، على عكس النهج الأكثر شيوعا ولكن أقل مثالية لتوليد البروتين أكثر بكثير مما يمكن أن يحدث بشكل طبيعي ('التعبير البلازميد"). وبالتالي ، فإن العينات البيولوجية الفعلية التي سيتم التحقيق فيها هي أقرب إلى حد كبير في الكائنات الطبيعية ، وبالتالي المزيد من الملاحظات ذات الصلة على العمليات الفيزيولوجية الحقيقية.

Protocol

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. لبدء هذا الإجراء ، يتم إذابة أول 50 ميكرولتر من الأسهم المجمدة للبروتين فلوري معربا عن كولاي ونمت الخلايا البكتيرية هوائيا مع اهتزاز وسائل الاعلام في 5 مل النمو LB بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في الصباح ، ويتم استخراج 50 ميكرولتر من هذه الثقافة المشبعة وشبه مثقف إلى الحد الأدنى من وسائل الاعلام M63 ثقافة الجلوكوز ، ويحتضنها في 30 درجة مئوية لمدة 4 الى 6 ساعات. هنا نظهر باستخدام اثنين من سلالات مختلفة من الخلايا ، واحدة منها يعبر عن نقل الإلكترون السيتوكروم تنصهر لGFP ، والآخر الذي يعبر عن بروتين يشارك في المحرك في سوطي البكتيرية لتنصهر GFP.
  2. ق....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويجب الحرص على عدم "على القص" خلية للنظر في البكتيريا المربوطة ، لأن ذلك قد يضعف من وظيفة المحركات سوطي. من المهم أن استخدام الخلايا لفترة أطول من ساعة مرة واحدة على شريحة المجهر لأنها قد تصبح الأوكسجين المستنفد. قد تكون هناك حاجة كبيرة الأمثل للعثور على أفضل مجهر ظروف التصوير تهتم لنظامك البيولوجي محددة في إطار التحقيق. قد يكون من الحكمة لمحاولة تنقية التصوير باستخدام GFP وحده للتأكد من كثافة الليزر الصحيح الإثارة المطلوبة للنظام الخاص بك مجهر خاص.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نعترف ان التبرعات العينية من سلالات بكتيرية من المجموعات البروفيسور جوديث ارميتاج (جامعة أكسفورد ، المملكة المتحدة) والبروفيسور كونراد Mullineaux (جامعة كوين ماري في لندن ، المملكة المتحدة). ويتم تمويل مشترك من جانب IMD قسم الكيمياء الحيوية (جامعة أكسفورد) وOCISB ؛ وتمول من قبل AR الهندسة والعلوم الفيزيائية مجلس البحوث (EPSRC) DTC دراسية ل؛ يمول ND من التكنولوجيا الحيوية والعلوم البيولوجية مجلس البحوث (BBSRC) ؛ هو MCL بتمويل من زمالة الجمعية الملكية للبحوث الجامعة.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

References

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Leake, M. C., Chandler, J. H., Wadhams, G. H., Bai, F., Berry, R. M., Armitage, J. P. Stoichiometry and turnover in single, functioning membrane protein complexes. Nature. 443, 355-358 (2006).
  2. Leake, M. C., Greene, N. P., Godun, R. M., Granjon, T., Buchanan, G., Chen, S., Berry, R. M., Palmer, T., Berks, B. C.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Molecule FluorescenceAdvanced Fluorescence MicroscopyLiving Bacterial CellsFluorescent Protein TaggingTotal Internal Reflection FluorescenceElectron Multiplying CameraHigh Numerical Aperture ObjectiveFluorescent Spot DetectionPhoto Bleaching AnalysisMolecular Complex Visualization

Related Articles