مراسل RFP رواية للمساعدة في التصور من القرص في العين تخيلي ذبابة الفاكهة</em

ملخص

وصفنا أحمر فلوري رواية البروتين (RFP) المراسل ان يتم التعبير عن وتحديدا في ذبابة الفاكهة العين. نحن بالتفصيل منهجية لتشريح العين تخيلي القرص ، وكيف يمكن استخدام هذا المراسل للمساعدة في تشريح وتحديد أنواع معينة من الخلايا في العين النامية.

البروتوكول

1. المركز الأول انخفاضا من برنامج تلفزيوني على طبق Sylgard تشريح تحت المجهر.
2. إزالة عدة التالي تجول اليرقات طور مرحلي الثالث من قنينة أو زجاجة باستخدام ملعقة ووضعها في برنامج تلفزيوني.
3. للبدء في استخدام الملقط تشريح يدك اليسرى (إذا كنت الحق وسلم) لفهم إن يرقة من ثلثي الطريق نحو الخلفي ومن ثم استخدام هذا الزوج أخرى لعقد الظلام السنانير الفم الملونة في نهاية الأمامي.
4. الآن برفق اليرقة وبصرف النظر عن طريق تحريك كل من أزواج من ملاقط بعيدا عن بعضها البعض. يجب أن يأتي بعيدا من فمها بقية الجسم مع مجمع العين / الدماغ المرفقة.
5. إلى وصمة عار على أقراص لإصلاح العين المناعي الأقراص عند هذه النقطة عن طريق وضعها في بارافورمالدهيد 4 ٪ / برنامج تلفزيوني عن حل 30-45 دقيقة على الجليد. ثم يغسل الأقراص أربع مرات مع وصمة عار PBST ثم مع الأجسام المضادة المناسبة.
6. ومن الأسهل لتشريح العين الأقراص مباشرة على الشريحة. وضع قطرة من برنامج تلفزيوني على شريحة ونقل الأقراص إلى تراجع في برنامج تلفزيوني عن طريق عقد فمها.
7. تخيلي والأنسجة وشفافة وذلك في أول أقراص العين يصعب التعرف عليها. ليسهل التعرف عليهم استخدام المجهر مع القدرة على تشريح مضان. ويمكن استخدام العين مراسل RFP سطر تكون أقراص العين رؤيتها بوضوح في الانسجة أحمر فلوري تتراكب مع فصوص كروية البصري (الشكل 1).
8. إذا كنت تستخدم الألياف البصرية المباشرة الباردة مصدر الضوء ضوء بزاوية مائلة إلى الشريحة ، وهذا سوف يتيح للأقراص أكبر التباين. وترد الأقراص العين / antennal إلى فصوص البصرية عبر السويقة البصرية في الخلفية وعلى فمها عبر السويقة القادمة من القرص antennal في الأمامية.
9. لتشريح العين الأقراص الاستمرار على فمها باستخدام زوج واحد من واستخدام ملاقط الزوج الآخر لفصل أقراص العين من الدماغ اليرقات. فصل المقبل أقراص العين من فمها. أخيرا إزالة الشريحة من فمها وهذه يمكن أن تمنع ساترة من الاستلقاء.
10. عندما يكون لديك كل تشريح العين أقراص مغطاة الشريحة بلطف والجافة قبالة PBS الزائدة. ثم تضاف قطرة من Vectashield ومكان بلطف ساترة على القمة.
11. الأقراص هي الآن جاهزة للتصوير المجهري إما epifluorescence مبائر أو (الشكل 2).

عند تشريح بشكل صحيح يجب على القرص العين / antennal الاستلقاء على الشريحة واضحة من أي نسيج دخيلة مثل الدماغ. مقوسة القطبين الظهرية والبطنية من القرص العين وتميل إلى أضعاف ذلك ، ولكن يمكن تجنب ذلك عن طريق اتخاذ سلسلة Z - مبائر على المجهر وحذف هذه المقاطع من الإسقاط. على الرغم من أن القرص هو ظهارة المونولاير مواقف متغير من نوى يتطلب إسقاط Z - سلسلة للحصول على صورة شاملة للقرص. ويرد الإسقاط من العين العين النموذجية RFP / القرص antennal المتخذة بشأن المجهر مبائر في الشكل 2. نحن نأخذ عادة 1 ميكرون المقاطع من خلال القرص باستخدام عدسة 20X أو 40X. المراسل العين RFP المترجمة النووية وذلك مع النمط الذي شهدناه في الشكل رقم 2 يمثل نواة الخلايا معربا عن RFP.

الشكل 1. الأولي تشريح العين / المعقدة الدماغ من العين الثالثة ، يرقة ذبابة الفاكهة RFP طور مرحلي. العين / القرص تخيلي antennal (المبين) التي تعلق على فمها (MP) ، وتتراكب الفص البصري (ر) في الدماغ. لقد التقطت الصورة باستخدام المجهر مضان تشريح لإظهار التعبير RFP في القرص العين. الأمامي وإلى اليسار. شريط الحجم : 300 ميكرومتر.

الشكل 2. التعبير لمراسل RFP العين في العين القرص تخيلي. طور مرحلي العين الثالثة (ED) / القرص antennal (م) من تشريح العين اليرقة RFP عرض RFP التعبير (الحمراء). وكان القرص مع الملون phalloidin (الأخضر) ، والتي بقع أسطح الخلية قمية ويظهر ثلم التخلق (رأس السهم). وأعرب عن طلب تقديم العروض في الخلايا السليفة حول القوة المتعددة الجنسيات ، في مبصرات 1،6،7 والخلايا المخروطية. الأمامي وإلى اليسار. شريط الحجم : 25 ميكرون.

المناقشة

تشريح العين القرص تخيلي ذبابة الفاكهة واضح ومباشر ، ولكن يمكن أن يستغرق وقتا طويلا لاتقان. الخطوات الحاسمة هي تحديد القرص تشريح العين وبعيدا عن الدماغ اليرقات. يتم تحديد القرص العين أسهل باستخدام خط العين RFP الموصوفة هنا. التعديلات الممكنة لإزالة القرص أو الغشاء antennal peripodial ، أو ترك الفص البصري المرفقة تصور المحاوير PR دخول الدماغ.

تم إنشاء خط العين RFP عن طريق الاستنساخ رواية عنصر العين محددة م...