مقالة منهجية

تصور التعريب في الحمض النووي الريبي القيطم البويضات

DOI:

10.3791/1704

⸱

يناير 14, 2010

 , 
1Department of Molecular Biology, Cell Biology, and Biochemistry, Brown University

في هذه المقالة

إشعار تصحيح

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصور في الجسم الحي RNA النقل microinjection النصوص الحمض النووي الريبي في fluorescently المسمى القيطم البويضات ، تليها المجهري متحد البؤر.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA الترجمة هي آلية الحفظ إنشاء خلية قطبية. Vg1 مرنا يموضع إلى القطب نباتية من البويضات القيطم المورق ويعمل على تقييد مكانيا التعبير الجيني للVg1 البروتين. مطلوب رقابة مشددة من Vg1 التوزيع بهذه الطريقة المناسبة لمواصفات طبقة الجرثومية في الجنين النامية. تسلسل الحمض النووي الريبي العناصر في UTR 3 'من مرنا ، وتوطين عنصر Vg1 (VLE) هي المطلوبة والكافية لنقل المباشر. لدراسة الاعتراف ونقل Vg1 مرنا في الجسم الحي ، قمنا بتطوير تقنية التصوير التي تسمح للتحليل واسعة من العوامل عبر آليات النقل الموجهة عبر قراءات بصرية بسيطة.

الحمض النووي الريبي لتصور التعريب ، ونحن توليف fluorescently المسمى VLE RNA وهذا نص في microinject البويضات الفردية. ثقافة البويضة بعد للسماح بنقل الحمض النووي الريبي حقن ، البويضات يتم إصلاحها والمجففة قبل التصوير بواسطة المجهر مبائر. تصور أنماط توطين مرنا يتيح قراءة لرصد المسار الكامل لنقل الحمض النووي الريبي وتحديد الأدوار في توجيه نقل الحمض النووي الريبي لرابطة الدول المستقلة المفعول عناصر داخل النص ، والعوامل التي تعمل عبر ربط VLE (لويس وآخرون ، 2008 ، Messitt وآخرون ، 2008). لقد قدمنا ​​من خلال هذه التقنية بالتعاون مع التعريب الرناوات إضافية والبروتينات (غانيون وموري ، 2009 ، Messitt وآخرون ، 2008) ، وبالاشتراك مع تعطل المحرك والهيكل الخلوي البروتينات و(Messitt وآخرون ، 2008) إلى التحقيق الآليات الكامنة وراء توطين مرنا.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجزء 1 : النسخ من مرنا fluorescently المسمى.

  1. يصبح خطي DNA البلازميد التي تحتوي على عنصر أو تسلسل الحمض النووي الريبي التعريب الأخرى ذات الصلة وresuspend في 1 ميكروغرام / ميكرولتر مع DEPC المعاملة O. 2 H يجب أن يكون القالب الحمض النووي لديها مواقع المروج المنبع للنسخ التي T7 ، SP6 ، أو T3 بوليميريز الحمض النووي الريبي.
  2. إضافة الكواشف التالية لأنبوب 1.5mL العقيمة :
    أ. 10X تكساس العازلة (انظر M & M) 2 ميكرولتر
    ب. 20X قبعة / مزيج NTP (انظر M & M) 1 ميكرولتر
    ج. 1 ملم اليكسا فلور 546-14 - UTP (Invitrogen) 1 ميكرولتر
    د. UTP ، [α P - 32] (1 μCi / ميكرولتر) (بيركن إلمر) 1 ميكرولتر
    ه. DEPC - H 2 O 11 ميكرولتر
    ف. 0.2 M DTT 1 ميكرولتر
    ز RNasin (Promega) 1 ميكرولتر
    ح. الخطي قالب الحمض النووي 1 ميكرولتر
    ط رنا بوليميريز (Promega) 1 ميكرولتر
  3. المزيج بلطف والكواشف الطرد المركزي لفترة وجيزة (10 ثانية. في microcentrifuge).
  4. احتضان لمدة 2-4 ساعات في 37 درجة مئوية ، وتغطي الأنبوب برقائق الألومنيوم لمنع photobleaching من fluorophore.
  5. إضافة 1 ميكرولتر 1 ملغ / مل ريبونوكلياز خالية الدناز (Promega) للحط من الحمض النووي القالب.
  6. احتضان 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  7. إضافة 79 ميكرولتر 20 ملي EDTA (الرقم الهيدروجيني 8.0) لوقف التفاعل.
  8. 1 ميكرولتر لإزالة أنبوب منفصل ، وصفت بانها "المدخلات" وانقاذ.
  9. رد الفعل من خلال زيادة ونقصان عمود G50 1 مل (انظر المواد والطرق) ، والتي سوف تشمل النيوكليوتيدات الفردية مع استبعاد كامل مرنا طول.
  10. تركيز الحمض النووي الريبي قبل هطول الأمطار الايثانول :
    1. إضافة 250 ميكرولتر الإيثانول بنسبة 100 ٪ ، و 10 ميكرولتر 7M COONH CH 3 4 ، 1 ميكرولتر RNA الناقل (الحمض الريبي النووي النقال الخميرة ، و 10 ميكروغرام / ميكرولتر) أو 1 الجليكوجين ميكرولتر (20 ملغ / مل).
    2. وتخلط جيدا حتى تجميد الصلبة في -80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة> أو على الجليد الجاف لمدة 15 دقيقة.
    3. تدور في أقصى سرعة في microcentrifuge لمدة 15 دقيقة ، وطاف صب.
    4. يغسل مع 150 ميكرولتر من الايثانول 75 ٪.
    5. تدور لمدة 3 دقائق على السرعة القصوى في طاف ، microcentrifuge صب.
    6. تجفيف بيليه في 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ، وضمان أن جميع الايثانول قد تبخرت.
  11. Resuspend في 11 ميكرولتر DEPC O 2 - H وإزالة 1 ميكرولتر لأنبوب منفصل ، وصفت بانها "دمج".
  12. تحديد التأسيس في المئة وتخفيف الحمض النووي الريبي إلى 50 نانومتر (انظر المواد وطرق الحساب).
  13. ينبغي تجميد الحمض النووي الريبي في 5 aliquots ميكرولتر ، لاستخدام مرة واحدة لتجنب تجميد / الذوبان الدورات ويمكن تخزينها لعدة أسابيع في -80 درجة مئوية.

الجزء 2 : التحضير لMicroinjection.

  1. RNA التحضير :
    أذاب an قسامة من الحمض النووي الريبي (50 نانومتر) ، وتفسد الحمض النووي الريبي في 70 دقيقة لمدة 3-5 درجة مئوية. تدور لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة microcentrifuge بأقصى سرعة ممكنة لإزالة أي الجسيمات ، والحفاظ على الجليد.
  2. البويضة التحضير :
    1. إزالة المبيض جراحيا من الإناث المورق القيطم (ناسكو).
    2. تقليم قطعة من المبيض المورق القيطم في أنبوب مخروطي 50 مل تحتوي على 25 مل من محلول كولاجيناز (انظر المواد والطرق).
    3. يهز بلطف عند 18 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، أو حتى يتم فصل واضح البويضات من المبيض. بسبب دفعي لتباين الدفعي ، قد كولاجيناز وقت المعالجة تختلف ، وينبغي رصدها بعناية من خلال الفحص البصري لضمان defoliculation.
    4. السماح لتسوية البويضات في أنبوب ، وإزالة حل ويغسل البويضات مع العازلة MBSH (انظر المواد والطرق).
    5. تكرار غسل مرتين أكثر من أجل ما مجموعه ثلاثة يغسل. هذا البروتوكول العزلة البويضة هي مماثلة لتلك المفصلة في كوهين وآخرون ، 2009.
    6. الفرز يدويا في المرحلة الثالثة / البويضات الرابع (دومون ، 1972) في MBSH العازلة تحت المجهر القياسية تشريح. المرحلة الثالثة هي البويضات مبهمة تماما لكنها بيضاء ، في حين أن المرحلة الرابعة البويضات هي أكبر قليلا ، وتتخللها الصباغ. البويضات تكون شفافة قليلا جدا من الشباب والبويضات التي المصطبغة كليا أو توزيع يحمل صبغة الاستقطاب قديمة جدا.
  3. إبرة التحضير :
    سحب وشطبة الإبر إلى القطر الخارجي من 0.05 ملم ~. (ونحن نستخدم العلم دروموند 3.5 بوصة الشعيرات الدموية (ترتيب # 3 - 000 - 203 - G / X) ، وهو الصك سوتر micropipette مجتذب شركة وشركة beveller WPI).

الجزء 3 : Microinjection

  1. معايرة الإبرة مع O 2 DEPC - H 2 لتسليم NL في الحقن. نحن لدينا تحميل الجبهة باستخدام إبرة microinjector الغاز يحركها (انظر المواد والطرق) ، وانخفاض حجم معايرة باستخدام ميكرومتر.
  2. تحميل RNA في الإبرة.
  3. مكان فرز البويضات في طبق يحتوي على حقن MBSH العازلة. نحن microinject على طبق مع طبقة من المطاط الرغوي السوداء. والبويضات شاحب تبرز بشكل جيد على backgrou الأبيضالثانية.
  4. حقن البويضة مع كل بعناية NL 2 من الحمض النووي الريبي في 50 نانومتر.
  5. طرد الجيش الملكي النيبالي ، وشطف مع إبرة DEPC O 2 - H ، وتحميل RNA المقبل للحقن.

الجزء 4 : ثقافة سيت

  1. البويضات مكان في بئر من 24 لوحة معقمة جيدا (سيغما الدريتش). نحن ثقافة ما يصل الى ألف البويضات لكل بئر.
  2. إزالة العازلة واستبدالها مع 400 ميكرولتر O ocyte C M ulture edium (OCM ، انظر المواد و المناهج) لكل بئر. مكان لوحة الثقافة داخل حاوية بلاستيكية محكمة الغلق مع منشفة ورقية مبللة للحفاظ على بيئة رطبة خلال الثقافة.
  3. احتضان البويضات عند 18 درجة مئوية لمدة تتراوح من النقاط الزمنية ما بين 8 و 48 ساعات.

الجزء 5 : التثبيت والجفاف وتخزين البويضات

  1. فرز البويضات أي ميت على قيد الحياة ومكان البويضات في قوارير زجاجية. نلاحظ بشكل روتيني> البقاء على قيد الحياة 90 ٪.
  2. البويضات في مكان مثبت MEMFA (انظر المواد والطرق) والصخور لمدة 20 دقيقة. حماية البويضات من الضوء من خلال تغطية بورق الألمنيوم.
  3. غسل البويضات عن طريق إزالة تثبيتي ، والاستعاضة عن حجم مساو من MBSH العازلة. كرر هذا مرة أخرى ليغسل ما مجموعه اثنين من يغسل.
  4. غسل البويضات في الميثانول اللامائية :
    1. إزالة نصف الحجم ، مع استبدال الميثانول.
    2. كرر الخطوة "أ" مرتين.
    3. إزالة جميع من الحل ، مع استبدال الميثانول.
    4. تكرار غسل الميثانول.
  5. ويمكن تخزين البويضات في -20 درجة مئوية حتى جاهزة للصورة.

الجزء 6 : التصوير RNA التعريب بواسطة الميكروسكوب متحد البؤر

  1. قبل التصوير ، إضافة ليالي غرفة متوسطة موراي (2:1 بنزيل بنزوات البنزيل الكحول -) إلى أسفل الزجاج FluoroDish (WPI شركة) لتغطية السطح التصوير.
  2. نقل بعناية البويضات من الميثانول إلى FluoroDish ، والتقليل من حجم نقل الميثانول.
  3. الصورة على المجهر an مبائر المقلوب (ونحن قد استخدمت بنجاح LSM510 زايس وTCS SP2 لايكا).

figure-protocol-1
الشكل 1 :.. يقتصر في البداية تصور التعريب بواسطة الحمض النووي الريبي التحت خلوية Microinjection النصوص صفتها Fluorescently ألف microinjection التالية ، RNA المسمى مع فلور اليكسا 546 إلى النواة باء بعد ثماني ساعات من الثقافة ، ويمكن أن ينظر إلى fluorescently المسمى RNA السيطرة بشكل موحد وزعت في سيتوبلازم البويضة. جيم ومع ذلك ، يمكن أن ينظر إلى RNA fluorescently المسمى تحتوي على تسلسل التي تجند أجهزة النقل في عملية توطين التحت خلوية إلى القطب نباتية من البويضة (نحو الأسفل). مقياس بار = 50 ميكرومتر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا قدمنا ​​مشروع بروتوكول لتصور التعريب مرنا في القيطم البويضات. هذا الأسلوب ، وذلك باستخدام الحمض النووي الريبي fluorescently المسمى النصوص وأعلى إشارة إلى نسبة الضوضاء من الحصول مسبقا مع digoxigenin المسمى النصوص وأبسط وأسرع من الوضع الطبيعي في النهج القائمة (موري وميلتون ، 1992 ، Gautreau وآخرون ، 1997). باستخدام هذه الطريقة ، يمكننا مهندس تسلسل الحمض النووي الريبي واختبار الطفرات بسرعة على وظيفة في الجسم الحي. كذلك ، باستخدام إضافية اليكسا - UTP fluorophores...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
وقد أجريت التجارب باستخدام الحيوانات المخبرية وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها جامعة براون.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويدعم عملنا على توطين RNA عن طريق منحة من المعاهد الوطنية للصحة (R01GM071049) لKLM.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

10X تكساس العازلة

  • 60 ملم MgCl 2
  • 400 ملم تريس ، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.5)
  • 20 ملي سبيرمدين - حمض الهيدروكلوريك

20X قبعة / NTP مزيج

  • 10 ملي CTP
  • 10 ملي ATP
  • 9 ملم UTP
  • 2 مم GTP
  • 20 ملي G (PPP) G رسملة تماثلي (نيو إنجلاند Biolabs)

G - 50 عمود

  • منزوع الأيونات هيدرات 5 ز Sephadex G - 50 حبات (سيغما الدريتش) في 100 مل من H 2 O. لمدة 30 دقيقة DEPC علاج. والأوتوكلاف. تخزين الأوراق المالية غير مكتملة في درجة حرارة الغرفة. قبل الاستخدام ، إضافة التالية ريبونوكلياز خالية من الحلول :
  • 0.5 مل 0.2 M EDTA
  • 1 مل 1 تريس M الرقم الهيدروجيني 8.0
  • 0.5 مل SDS 20 ٪
  • مخزن كاملة G - 50 درجة مئوية في حل 4
  • إزالة وتجاهل المكبس من المحاقن مل 3 دينار بحريني (العلوم البيولوجية) ، ومكان للبرميل من الحقنة في أنبوب 15 مل المخروطية (كورنينج). سد المحاقن مع كمية صغيرة من الصوف الزجاجي (قابس حول حجم نصف بنس واحد).
  • دوامة كاملة G - 50 حل لresuspend الخرز.
  • إضافة 2 مل G - 50 حل للعمود فارغ.
  • تدور لمدة 1 دقيقة في ز س 1000 جهاز طرد مركزي في الفوق.
  • إضافة 200 DEPC المعاملة منزوع الأيونات ميكرولتر H 2 O إلى كل عمود. زيادة ونقصان.
  • تكرار غسل مرتين أكثر من أجل ما مجموعه ثلاثة يغسل.
  • حقنة لإزالة برميل أنبوب جديد 15 مل المخروطية.

كولاجيناز الحل

  • 75 ملغ من نسج كلوستريديوم كولاجيناز (سيغما الدريتش)
  • 25 مل 0.1 م 3 + KPO (الرقم الهيدروجيني 7.4)

MBSH العازلة

  • 88 مم كلوريد الصوديوم
  • 1 ملم بوكل
  • 2.4 ملي NaHCO 3
  • 0.82 ملي MgSO 4 X 7H 2 O
  • 0.33 ملي كا (NO 3) 2 X 4H 2 O
  • 0.41 ملي CaCl 2 X 6H 2 O
  • 10 HEPES ملم (7.6 درجة الحموضة)

البويضة مستنبت

  • 50 ٪ L15 المتوسطة
  • 15 HEPES ملم (7.6 درجة الحموضة)
  • 1 ملغ / مل الأنسولين
  • 100 ملغ / مل جنتاميسين
  • 50 U / مل النيستاتين
  • 50 U / مل البنسلين
  • 50 ملغ / مل الستربتوميسين

MEMFA الحل

  • 0.1 اجتماعات الأطراف M (الرقم الهيدروجيني 7.4)
  • 2 مم EGTA
  • 1 ملم MgSO 4
  • 3.7 ٪ الفورمالدهيد

الحوسبة RNA العائد

  • الاجتماع التحضيري للمؤتمر في تحديد "الإدخال" و "دمج" العينات باستخدام عداد التلألؤ القياسية.
  • التأسيس = ("دمج") / (10 س "الإدخال")
  • إدماج القيم النموذجية تتراوح ما بين 0.03 و 0.10 ~.
  • نظرية الحد الأقصى للغلة polymerases مختلفة :
    T7 ، T3 ، SP6 -- 2.64 ميكروغرام
  • رد الفعل في ميكروغرام العائد = (الغلة القصوى من بوليميريز المستخدمة) X (التأسيس)
  • تمييع RNA إلى 50 نانومتر = (RNA ميكروغرام) / 320 / (طول الحمض النووي الريبي في قواعد) / (5X10 -8)
  • رد الفعل عادة غلات ~ 5-10 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي في 50 نانومتر.

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cohen, S., Au, S., Pant, N. Microinjection of Xenopus laevis oocytes. JoVE. 24, (2009).
  2. Dumont, J. N. Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals. J. Morphol. 136, 153-179 (1972).
  3. Gagnon, J. A., Mowry, K. L. RNA transport in ovo: Simultaneous visualization of two RNAs. Mol Reprod Dev. 76, 1115-1115 (2009).
  4. Gautreau, D., Cote, C. A., Mowry, K. L. Two copies of a subelement from the Vg1 RNA localization sequence are sufficient to direct vegetal localization in Xenopus oocytes. Development. 124, 5013-5020 (1997).
  5. Lewis, R. A., Gagnon, J. A., Mowry, K. L. PTB/hnRNP I is required for RNP remodeling during RNA localization in Xenopus oocytes. Mol Cell Biol. 28, 678-6786 (2008).
  6. Messitt, T. J., Gagnon, J. A., Kreiling, J. A., Pratt, C. A., Yoon, Y. J., Mowry, K. L. Multiple kinesin motors coordinate cytoplasmic RNA transport on a subpopulation of microtubules in Xenopus oocytes. Dev Cell. 15, 426-436 (2008).
  7. Mowry, K. L., Melton, D. A. Vegetal messenger RNA localization directed by a 340-nt RNA sequence element in Xenopus oocytes. Science. 255, 991-994 (1992).
  8. Yoon, Y. J., Mowry, K. L. Xenopus Staufen is a component of a ribonucleoprotein complex containing Vg1 RNA and kinesin. Development. 131, 3035-3045 (2004).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

تصحيح

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes
Posted by JoVE Editors on 6/10/2011. Citeable Link.

null

الوسوم

Vg1 VLE

مقالات ذات صلة