وكانت الفئران المعزولة من اللجان الدائمة وfemurs tibias وإثراء ثم فرز الخلايا المغناطيسية. وتأكدت الخلايا فرز للتعبير عن السطح علامات التدفق الخلوي. وكانت أيضا هذه الخلايا المستزرعة في كثافة نسيلي لتشكيل المستعمرات واحدة ثم تم فصل هذه المستعمرات التي اسطوانات الاستنساخ.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
العزلة والإثراء من خلايا فأر الجذعية الوسيطة (MSCS) والفصل بين مستعمرة واحدة مشتقة اللجان الدائمة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
اللجان الدائمة هي مجموعة من الخلايا الجذعية البالغة التي هي مصدر واعد للتطبيقات علاجية. يمكن عزل هذه الخلايا من نخاع العظم ويمكن فصلها بسهولة من الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) بسبب تمسكهم البلاستيك. هذا البروتوكول يصف كيفية عزل من اللجان الدائمة وtibias femurs الفئران. وإثراء للخلايا معزولة ضد اثنين من علامات سطح اللجان الدائمة CD54 CD90 والفرز من قبل خلية المغناطيسي. ثم تأكدت من علامات التعبير والسطحية CD54 CD90 عن طريق تحليل التدفق الخلوي. كما تم تضمين علامة HSC CD45 للتحقق مما إذا كانت اللجان الدائمة استنزاف فرزها من HSCs. اللجان الدائمة هي بطبيعة الحال غير متجانسة تماما. هناك مجموعات سكانية فرعية من الخلايا التي تحتوي على أشكال مختلفة ، وقدرات الانتشار التمايز. هذه المجموعات السكانية الفرعية تعبر عن جميع اللجان الدائمة وعلامات معروفة لم تكن هناك علامة فريدة لتحديد الشرائح السكانية المختلفة. لذلك ، نهجا بديلا لفصل المجموعات السكانية الفرعية المختلفة باستخدام اسطوانات استنساخ لفصل واحد مستعمرة الخلايا المشتقة. ويمكن عندئذ الخلايا المشتقة من المستعمرات واحد يكون مثقف وتقييمها بشكل منفصل.
البروتوكول
1. بمعزل عن اللجان الدائمة الجرذ
تم عزل الخلايا الجذعية الوسيطة 6-8 الاسبوع الفئران سبراغ داولي الإناث القديمة كما هو موضح سابقا 1 و 2. يمكن عزل اللجان الدائمة التمسك سطح البلاستيك وتوسيع بسهولة في المختبر خلال الثقافة.
- وضعت الحيوان الى غرفة التخدير والخدر لنحو خمس دقائق. أثناء التخدير ، ومراقبة معدل التنفس ، وامض والنشاط الحركي. إزالة الحيوان من الغرفة على الفور بعد أن توقف عن النشاط الحركي ومعدل وامض أصبحت نادرة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هذا البروتوكول يصف كيفية عزل وإثراء MSCS. وهو مدرج أيضا طريقة لفصل الخلايا مستعمرة واحدة مشتقة. هناك العديد من الخطوات التي تعتبر مهمة للفصل العزلة ، والإثراء ، ومستعمرة ناجحة. أثناء القيام العزلة خلية من الفئران ، فمن المستحسن لتصفية من خلال مصفاة خلية أو شبكة النايلون العقيمة مشابهة من حيث الحجم للتخلص من جلطات الدم والحطام العظام. بعد طلاء الخلايا بين عشية وضحاها ، وسوف يكون العديد من الخلايا الميتة طافية في الأجلين المتوسط وتتم إزالة الخلايا الميتة عن طريق استبدال الطازجة مع.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
شكر وتقدير
وأيد العمل في جزء من المعهد الوطني للصحة (R01GM079688 ، R21RR024439 وR21GM075838) ، المؤسسة الوطنية للعلوم (CBET 0941055) ، ومؤسسة جامعة ولاية ميشيغان.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1X محلول D-PBS | Invitrogen | 14040-133 | |
| وسط ميرلاند مينيمل إسنسيال (DMEM) | Invitrogen | 11885-084 | |
| مصفاة الخلايا | BD Biosciences | 352350 | |
| مصل جنين البقر | Invitrogen | 26140-079 | |
| بنسلين-ستربتومايسين | Invitrogen | 15140 | |
| تريبسين-إيديتات الكالسيوم ثنائي الصوديوم (Trypsin-EDTA) | Invitrogen | 25200-056 | |
| BD Imagnet | BD Biosciences | 552311 | |
| Biotin mouse IgG2a | BD Biosciences | 555572 | |
| Biotin mouse IgG1 | BD Biosciences | 555747 | |
| مضاد CD54 للجرذ الموصوم بالبيوتين | Cedarlane Labs | CL054B | |
| Biotin anti-rat CD90 | Cedarlane Labs | CL005B | |
| بيوتين مضاد لـ CD45 الجرذان | Cedarlane Labs | CL001B | |
| محلول BD Imag المنظم | BD Biosciences | 552362 | |
| أنبوب مستدير القاعدة | BD Biosciences | 352063 | |
| جسيمات الستريبتفيدين | BD Biosciences | 557812 | |
| SA-PE | R&D Systems | F0040 | |
| أسطوانة الاستنساخ | Sigma-Aldrich | C2059 |
المراجع
- de Hemptinne, I., Vermeiren, C., Maloteaux, J. M., Hermans, E. Induction of glial glutamate transporters in adult mesenchymal stem cells. J Neurochem. 91, 155-166 (2004).
- Porter, R. M., Huckle, W. R., Goldstein, A. S. Effect of dexamethasone withdr....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
