تشريح المنظم وExplants القطب الحيواني من أجنة القيطم المورق وجمعية خلية الفحص الالتصاق

ملخص

هذا الفيديو يوضح التقنية المستخدمة لإعداد منظم وexplants قطب من أجنة الحيوانات القيطم المورق ، بما في ذلك استخدام السكين الحاجب -- أداة تشريح المتخصصة مصنوعة من الحاجب واحد. ويرد أيضا على بروتوكول لتجميع an مقايسة الالتصاق ، والتي تحقيقات عن وجود جزيئات الالتصاق الرئيسية موجودة على سطح منظم أو خلايا القطب الحيوانية التي تعتبر بالغة الأهمية لتحقيق التنمية السليمة.

البروتوكول

تستعد الدوائر الالتصاق (قبل يوم من الحقن / تشريح)

غرف الفحص التصاق

إذا كان لديك مجهر مركب تقليدي (بصري يقع فوق خشبة المسرح) ، فمن ncecessary لجعل منخفضة الارتفاع التصاق الغرفة على النحو التالي. إذا باستخدام المجهر المقلوب البصرية ، ثم "نونك ساترة يحتل هيئة تشريعية لاب تيك" يمكن أن يكون مجرد استخدامها ، وتخطي الخطوات # 1 -- 2.

1. تعلق واحدة من "الصحافة لختم عازل السيليكون" على تغطية زلة × 40 24MM. اضغط بقوة عازل للتغطية على زلة الفوق نظيفة وتبدو من الجانب الآخر للتأكد من أن يتم إرفاق عازل تماما دون أي فقاعات الهواء.
   
   
2. اختياري : ضع الدوائر التصاق في طبق بتري الزجاج مع الورق Whatman تصفية وتعقيم في دورة جافة لتعقيم. تبريدها وصولا الى RT.

طلاء الغرفة

1. وضع قطرات 200ml العمل حل كادهيرين (10mg/ml) أو فبرونيكتين (20mg/ml) على مركز للغرفة التصاق تعقيمها ، وذلك باستخدام نصائح sigmacoated الصفراء. RT في احتضان لمدة 4 ساعات.
   
   
2. إخراج الحل كادهيرين أو فبرونيكتين ونقل إلى أنبوب 1.5ml. ويمكن استخدامها لهذا الحل خلال الاسبوعين المقبلين.
   
   
3. 500ml من الاستغناء عن 4 ٪ في جيش صرب البوسنة 1X MBS - H لعرقلة الغرفة. RT في احتضان لمدة 1 ساعة.
   
   
4. نضح حل جيش صرب البوسنة. غسل الغرفة مع 500ml من 1X H - MBS مرتين. بعد غسل الثاني ، نضح معظم H - MBS (ليس تماما) ، وتخزينها في حاوية مغلقة عند 4 درجة مئوية. التصاق هذه القاعة هو جيد لل2 التالي -- 3 أيام.

تشريح وتفكك Explants رسملة الحيوان

1. احتضان هذه الأجنة المحقونة في 0.1x H - MBS ، مخففة من 1X تعقيمها MBS - H ، وعدم تعقيمها المتوسطة يحمل الجراثيم في وقت ما القليل الذي يمكن ان يؤثر على الغطاء الحيواني فصل الخلايا.
   
   
2. جعل 1X بارت في لوحات وagarose CMF - MBS وحات agarose مع أطباق 60mm ، على الأقل فيما يصل عدد العينات الخاصة بك. صب تعقيمها 1X MBS - H لوحات 1X لبارت. لوحات CMF - MBS ، صب 10ML من CMF - MBS.
   
   
3. عندما تصبح أجنة المرحلة 8.5 ، بدء تشريح الحيوانات في مباراة صحن 1X لبارت. 10-15 explants في عينات وعادة ما تكون كافية للتجربة.
   
   
4. نقل الحيوانات explants غطاء لوحة CMF - MBS. لاحتضان explants لمدة 45 -- 60 دقيقة حتى يتم فصلها تماما explants. والثورات لطيف في كل 15 دقيقة تساعد التفكك.

خلية التصاق الفحص

1. بذر الخلايا : الاستغناء 500ml من 1X MBS - H إلى غرفة التصاق أعد الخطوات في المقاطع المذكورة أعلاه ، وغرف الفحص والتصاق طلاء الغرفة. نقل سقف فصل الخلايا الحيوانية من لوحة CMF - MBS إلى غرفة الالتصاق به P200 مع نصائح أصفر sigmacoated وقطعوا.
   
   
2. اختياري : إذا كان ممكنا ، تمتص بعناية والمتوسطة حتى ما يقرب من 2 / 3 في منتصف الطريق ، من دون تعريض الخلايا إلى الهواء. إضافة ما يقرب من نفس الكمية من جديد MBS - H ، للتأكد من أنه يحتوي على الكالسيوم وسيلة كافية ^{2 + 2 +} والمغنيسيوم.
   
   
3. في لاحتضان RT 45-90 دقيقة. فحص الخلايا في بعض الأحيان لمعرفة ما اذا كانوا المترتبة على السطح السفلي.
   
   
4. الآن يمكنك أن تأخذ صورة من الخلايا تحت المجهر.
   
   
5. وضعت الغرفة على شبكة التصاق الزجاج الشريحة. محاذاة واحدة من زوايا الغرفة الانضمام الى ركلة ركنية من الشريحة الشبكة. عد وتسجيل عدد من الخلايا في شبكات المرفقة مختلفة.
   
   
6. صب 1L من H - MBS في دلو من البلاستيك كبيرة (على سبيل المثال ، تثبرور ، الخ). وضعت الغرفة الشريحة بلطف الانضمام إلى الجزء السفلي من دلو. تناوب عليها على مدار شاكر لمدة خمس دقائق على سرعة منخفضة (50 -- 60rpm).
   
   
7. وضعت الغرفة التصاق الظهر على الشريحة الشبكة ، محاذاة الزاوية نفسها من الغرفة إلى الزاوية نفسها من الشريحة الشبكة ، كما فعل في الخطوة # 5 من هذا الباب ، خلية التصاق الفحص. حساب عدد الخلايا التي لا تزال تعلق على الشبكة نفسها التي لديك حساب قبل الغسيل. حساب النسبة المئوية من الخلايا التي لا تزال تعلق بعد الغسيل.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
1x MBS-H	محلول منظم			مقياس بارث المعدل’وسط: وصفة لـ 1 لتر: 5.14 جم NaCl، 5 مجم KCl، 0.2 جم NaHCO3 ٠.٢ جم من MgSO₄4•7H260 ملجم من CaCl22•2H280 مجم من Ca(NO3)2•4 ساعات2أو238 جم من HEPES، الحمض الحر. يتم ضبط الأس الهيدروجيني (pH) إلى 7.4 باستخدام NaOH. ثم يُعقم بجهاز الموصدة (Autoclave).
CMF-MBS	محلول منظم			هذا هو الكالسيوم (Ca)2+/ملغم2+نسخة خالية من MBS-H. وصفة تحضير 500 مل: 2.57 جم NaCl، و37.5 مجم KCl، و0.1 جم NaHCO3/sub> 1.19 جم من HEPES، حمض حر. اضبط الرقم الهيدروجيني (pH) إلى 7.4 باستخدام NaOH. عقم باستخدام الموصدة (Autoclave).
1% أغاروز/1x بارث’أطباق السحب (S plates)				بعدد مساوٍ لعدد العينات
أطباق أغاروز 1%/CMF-MBS				بعدد مساوٍ لعدد العينات
خيمر E-Cadherin/Fc	كاشف	Sigma-Aldrich	E-2278	أذب 0.1 ملجم من مادة E-cadherin الصلبة في 100 ميكرولتر من محلول 1x MBS-H يحتوي على 40% جليسرول لتحضير مخزون رئيسي بتركيز 100x (1.0 ملجم/مل). تُخزن في –20 °ج. قم بإجراء تخفيف بنسبة 1/100 باستخدام محلول MBS-H بتركيز 1x لتحضير محلول عمل بتركيز 10 ميكروغرام/مل مباشرة قبل الاستخدام. ستحتاج إلى 200 ميكرولتر من محلول العمل هذا لكل عينة.
فيبرونيكتين، محلول بتركيز 0.1%	كاشف	Sigma-Aldrich	F-1141	يمكن استخدام هذا المحلول الجاهز كمخزون بتركيز 50x. قم بإجراء تخفيف بنسبة 1/50 باستخدام MBS-H بتركيز 1x لتحضير 20 مل. μجم/مل من المحلول العامل مباشرة قبل الاستخدام. تحتاج إلى 200 μلـ (L) لكل عينة من هذا المحلول التشغيلي. أنا لا أوصي باستخدام الفبرونكتين (Fibronectin) الصلب، لأن إذابته بتركيز 0.1% لتحضير المحلول المخزون تكون صعبة. ورغم أنه أعلى تكلفة، إلا أن هذا المحلول الجاهز بتركيز 0.1% أفضل للحصول على نتائج متسقة.
4% BSA /MBS-H	محلول منظم			BSA: درجة البيولوجيا الجزيئية، الجزء V
رؤوس ماصات صفراء مطلية بـ Sigmacote	أداة
شرائح تغطية رقم 1				40 ملم × 24 ملم أو 60 ملم × 24 ملم
عازل سيليكوني يتم إغلاقه بالضغط	أداة	Glace Bio-Labs	JTR20-2.5	عمق 2.5 مم × قطر 20 مم
غطاء زجاجي ذو غرف من NUNC Lab-Tek	أداة	Fisher Scientific	12-565-471	بئران/شريحتان
شريحة زجاجية شبكية	أداة			أو شبكة تحديد المواقع (Finder graticule) لعد الخلايا