مقالة منهجية

التوليد الكروي من خطوط الخلايا: طريقة زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد)

أبريل 30, 2023

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_content" >المصدر: Dillard، P.، et al. A Spheroid Killing Assay بواسطة CAR T Cells. J. Vis. Exp. (2018).

Spheroids هي نوع من نماذج زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد المستخدمة لتمثيل بيئة الخلية بدقة أكبر مقارنة بنماذج أحادية الطبقة لزراعة الخلايا ثنائية الأبعاد. في مثال البروتوكول ، سنرى العلماء يولدون كرويات من خط خلايا سرطان القولون والمستقيم ويطبقون تصوير الخلايا الحية لتتبع نمو الكرويات.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
فئة

1. توليد الكرات من خط خلايا سرطان القولون والمستقيم

  1. اغسل HCT 116 (يتم تحويله بثبات للتعبير عن مجموعة التمايز 19 (CD19) والبروتين الفلوري الأخضر (GFP)) أحادية الخلايا مع محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS ؛ 5 مل ل 25 سم2 أو 10 مل لقارورة 75 سم2). أضف التربسين (0.5 مل لقارورة 2 2 أو 1 مل لقارورة 75 سم2) واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  2. تحقق من انفصال الخلية تحت المجهر وقم بتحييد إنزيم تفكك الخلايا باستخدام معهد روزويل بارك التذكاري الكامل 160 وسيط (RPMI 1640) (RPMI 1640 + 10٪ FCS + Gentamycin ؛ 10 مل ل 25 سم2 أو 20 مل لقارورة 75 سم2).
  3. تعليق خلية الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة وإعادة تعليقها عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل عدة مرات باستخدام 5 مل من وسط RPM1 1640 الكامل.
  4. عد الخلايا باستخدام استبعاد Trypan blue على عداد خلايا متوافق.
  5. تعليق خلية الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة وإعادة تعليقها في وسط RPMI للحصول على 5 × 103خلايا / مل.
  6. قم بتغطية صفيحة قاعية مستديرة مكونة من 96 بئرا ب 100 ميكرولتر / بئر من 100 ميكروغرام / مل من بولي إل ليسين (PLL) في PBS خلال ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. اغسل مرتين باستخدام PBS واترك الطبق يجف.
  7. انقل معلق الخلية إلى خزان معقم وقم بتوزيع 200 ميكرولتر/بئر في الألواح السفلية المستديرة المطلية ب PLL سعة 96 بئرا باستخدام ماصة متعددة القنوات.
  8. انقل اللوحة إلى جهاز التصوير الآلي داخل الحاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، 95٪ رطوبة).
  9. قم بتسجيل الدخول إلى برنامج الاستحواذ ، وحدد جدولة للحصول على | تشغيل إضافة سفينة | مسح ضوئي في الموعد المحدد | إنشاء سفينة: جديد.
  10. حدد نوع المسح: كروي. حدد القنوات التي تهمك: المرحلة + Brightfield (لمتابعة نمو الكرويات) ، الأخضر (لمتابعة إشارة الورم ، وقت الاستحواذ 300 مللي ثانية) والأحمر (لمتابعة موت الخلايا المبرمج ، وقت الاستحواذ 400 مللي ثانية).
    1. حدد التكبير المطلوب: 10x.
    2. اختر طراز اللوحة وموضعها في الدرج. حدد موضع الآبار المراد تصويرها. أدخل وصف التجربة: الاسم ونوع الخلايا وعدد الخلايا.
  11. لإعداد التحليل، حدد تأجيل التحليل حتى وقت لاحق. انقر بزر الماوس الأيمن على المخطط الزمني وحدد خيار تعيين الفاصل الزمني لمجموعة المسحالمحدد وقم بتعيين إضافة عمليات مسح كل 4 ساعات ولمدة تصل إلى 24 ساعة. اضبط وقت البدء المطلوب (بعد ساعة واحدة على الأقل من الحضانة في جهاز التصوير الآلي).
  12. تحقق كل يومين من نمو الكرات عن طريق تسجيل الدخول إلى برنامج التصوير.
    1. اختر خيار عرض عمليات المسح الحديثة وانقر نقرا مزدوجا فوق التجربة المطلوبة. حدد Brightfield في لوحة قنوات الصورة ثم استخدم أداة قياس ميزات الصورة لقياس قطر الكرات الكروية. يستغرق الكروي 6 أيام للوصول إلى الحجم المطلوب: 0.5 مم من القطر. أضف 50 ميكرولتر من وسط RPMI الكامل لكل بئر في اليوم 4 للحد من تأثير التبخر المتوسط.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات Dulbecco's Phosphate Buffered Saline < td style="العرض:233px;">SIGMA-ALDRICH < نمط td = "العرض: 255 بكسل ؛" > D8537-500ML < td style="العرض:305px;">رقم القطعة: RNBG7037 <ارتفاع TD = "19" النمط = "الارتفاع: 20 بكسل ؛" > 75 سم² قوارير منطقة النمو VWR 430639 رقم الدفعة: 2218002 <ارتفاع TD = "19" النمط = "الارتفاع: 20 بكسل ؛" > 75 سم² قوارير منطقة النمو VWR 734-2705 رقم الدفعة: 3718006 التربسين EDTA سيغم ألدريتش T3924-100 مل رقم الدفعة: SLBTO777 RPMI 1640 med L-glutamin ، 10 × 500 مل لايف تكنولوجي (جيبكو) هاتف: 21875-091 رقم الدفعة: 1926384 Gentamicin ثيرمو فيشر 15750060 رقم القطعة: 1904924A محلول Trypan Blue ، 0.4٪ ثيرمو فيشر 15250061 رقم الدفعة: 1886513 < ارتفاع TD = "19" النمط = "الارتفاع: 20 بكسل ؛" > 96 لوحة بئر ، قاع دائري VWR 734-1797 رقم الدفعة: 33117036 X-VIVO 15 مع Gentamicin L-Gln ، أحمر الفينول ، 1 لتر بيونورديكا BE02-060Q رقم الدفعة: 8MB036 خزان الكاشف VWR 89094-672 رقم الدفعة: 89094-672 < ارتفاع TD = "19" النمط = "الارتفاع: 20 بكسل ؛" أنابيب >15 مل VWR 734-1867 رقم الدفعة: 19317044 < td height = "19" النمط = "الارتفاع: 20 بكسل ؛" >مصل الأبقار الجنيني جيبكو 10500064 رقم الدفعة: 08Q3066K <ارتفاع TD = "19" النمط = "الارتفاع: 20 بكسل ؛" >HCT 116 خط سرطان القولون والمستقيم ATCC سي سي إل -247 - < td height = "19" النمط = "الارتفاع: 20 بكسل ؛ ">Incucyte S3 إيسن بيوساينس

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة