إنتاج المعدلة وراثيا القيطم المورق عن طريق تقييد أنزيم التكامل وساطة وزرع النووية

ملخص

هذا البروتوكول الفيديو يوضح طريقة لتوليد المعدلة وراثيا القيطم المورق عن طريق إدخال الجينات المحورة إلى نواة الحيوان المنوي تليها النووية الى زرع بويضة غير مخصبة.

الملخص

التكامل مستقرة من المنتجات الجينات المستنسخة في جينوم القيطم هو ضروري للتحكم في الزمان والمكان والتعبير ، والتعبير عن الجينات في مراحل لاحقة من التطور الجنيني ، وتحديد مدى القدرة على تنظيم والمروجين التعبير الجيني داخل الجنين. ويمكن استخدام بروتوكول تظاهر هنا لتنتج بكفاءة الأجنة وراثيا القيطم المورق. هذا النهج ينطوي على transgenesis ثلاثة أجزاء : 1. يتم عزل الحيوانات المنوية من نوى عاشرا الكبار خصية المورق عن طريق العلاج مع lysolecithin التي permeabilizes غشاء البلازما المنوية. 2. مستعدة استخراج البيض بواسطة الطرد المركزي بسرعة منخفضة ، إضافة إلى الكالسيوم يؤدي إلى التقدم إلى استخراج الطور البيني من دورة الخلية ، والطرد المركزي بسرعة عالية لعزل الطور البيني العصارة الخلوية. 3. يتم الجمع بين النواة واستخراج الحمض النووي مع البلازميد الخطي لتكون كما قدم التحوير وكمية صغيرة من انزيم التقييد : زرع النووية. خلال رد فعل قصير ، استخراج البيض decondenses جزئيا لونين الحيوانات المنوية وانزيم يكسر قيود يولد الكروموسومات التي تشجع على إعادة التركيب من التحوير في جينوم. ثم يتم زرع نواة الحيوان المنوي في علاج بويضة غير مخصبة. التكامل بين التحوير وعادة ما يحدث قبل الانقسام والجنينية الأولى من نوعها أن الأجنة الناتجة ليست خيالية. ويمكن تحليل هذه الأجنة دون أي حاجة لتربية للجيل القادم ، والسماح لجيل فعال وسريع من الأجنة وراثيا للتحليلات المروج وظيفة الجين. عاشرا الكبار المورق الناتجة عن هذا الإجراء نشر أيضا عن طريق التحوير germline ويمكن استخدامها لتوليد حيوانات معدلة وراثيا خطوط لأغراض متعددة.

البروتوكول

وقد وصفت في البداية نسخ معدلة من هذا النهج transgenesis في ¹ و ^2.

A. إعداد الحيوانات المنوية النوى

ويتم تكييف هذا الأسلوب من إعداد نواة موراي ³ ، ولكن تم حذف مثبطات الأنزيم البروتيني لأنها تتداخل مع التطور اللاحق للزرع البويضات مع الحيوانات المنوية النوى. وتجمد Aliquots عند درجة -80 ويمكن أن تستخدم لزرع ما يقرب من 6 أشهر.

وينبغي إعداد جميع الحلول ووضعها على الجليد قبل بدء التحضير.

المناقشة

ليتم اختبارها كل بناء المعدلة وراثيا ، ونحن عموما زرع النوى في 500-1000 البيض ، وفي هذا النطاق ، ونحن يمكن أن تولد الأجنة وراثيا التعبير عن ما يصل الى 10 بنيات مختلفة في اليوم الواحد ، اعتمادا على كيفية العديد من الإناث التي يسببها لوضع البيض. هذه زرع حوالي ثلث يلتصق البيض و60-80 ٪ من هذه الأجنة المضي قدما من خلال الشق عادة تكون المعيدة. تبعا للظروف التفاعل المستخدمة ، وبين 10-50 ٪ من هذه الأجنة تعبر عن والتحوير في المصالح. لذلك ، بمجرد إنشاء هذا الإجراء في المختبر ، فمن الممكن لع.......

المواد

A. إعداد الحيوانات المنوية النوى

الكواشف :

1. 1X MMR (2mm وCaCl ₂ ، HEPES 5mm ، و pH7.5 ، 2mm وبوكل ، 1MM MgCl ₂ ، كلوريد الصوديوم 100mM).
2. 0.1 ٪ Tricaine Methanesulfonate (MS222 ، إيثيل استر حمض أمينوبنزويك ، سيغما A - 5040) ، 0.1 ٪ بيكربونات الصوديوم. تذوب في الماء.
3. 2X زبدة التحضير النووية (NPB). في اليوم من إعداد نواة الحيوان المنوي ، يشكلون ما نسبته 30 مل من NPB 2X من aliquots للحلول تخزين الأوراق المالية المجمدة : 500 ملي السكروز (1.5 M الأسهم) ، و 30 HEPES ملم (1M الأسهم ؛ عاير مع KOH بحيث الرقم الهيدروجيني 7.7 هو في 15 ملم) ، 1 trihydrochloride سبيرمدين ملم (سيغما S - 2501 ، و 10 سهم ملم) ، 0.4 tetrahydrochloride السبيرمين ملم (سيغما S - 1141 ، و 10 سهم ملم) ، 2 مم dithiothreitol (سيغما D - 0632 و 100 سهم ملم) ، 2 مم EDTA (500 ملي EDTA ، ودرجة الحموضة 8.0).
4. استخدام 2XNPB لجعل أ 1X 30ml NPB ، B. 10ML 1XNPB +3 ٪ BSA (V كسر ، سيغما A - 7906) ، ج. 5ml 1XNPB BSA +0.3 ٪.
5. Lysolecithin : 100 ميكرولتر من 10 ملغ / مل - L - α - lyso الليسيثين ، صفار البيض (Calbiochem ، 440154) ؛ تذوب في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. تخزين صلبة الأسهم عند 20 درجة مئوية. تجاهل مسحوق الأوراق المالية إذا أصبح لزجة.
6. ألبومين المصل البقري (BSA) : 10 ٪ (W / V) BSA (V كسر ، سيغما A - 7906) يشكلون 5 مل في الماء في اليوم من إعداد نواة الحيوان المنوي.
7. تخزين الحيوانات المنوية العازلة (1ml) 1X NPB ، الجلسرين 30 ٪ ، 0.3 ٪ BSA.
8. الحيوانات المنوية تخفيف العازلة : 250 السكروز مم ، 75 مم بوكل ، 0.5 trihydrochloride سبيرمدين مم ، 0.2 tetrahydrochloride السبيرمين ملم. يعاير إلى الرقم الهيدروجيني 7،3-7،5 وتخزين 0،5-1 aliquots مل عند 20 درجة مئوية.
9. هويشت رقم 33342 (سيغما B - 2261) : 10 ملغ / مل الأسهم في DH ₂ O ، وتخزينها في ضوء ضيق سفينة عند 20 درجة مئوية.

المعدات :

• يتأرجح الدوار دلو وأجهزة الطرد المركزي
• القماش الجبني
• أدوات تشريح (مقص وملقط)
• مضان المجهر
• قمع
• قفازات
• عدادة الكريات
• الإبر (26 مقياس)
• ورقة المناشف
• أطباق بتري (60 ملم)
• ماصات
• البلاستيك (5 و 10 مل)
• Pipetman نصائح (1 مل و200μl)
• محاقن (1 مل)
• أنابيب (14 مل ؛ فالكون 2059)
• أنابيب
• microcentrifuge (1.5 مل)

باء إعداد مستخلصات سرعة عالية

الكواشف :

1. 1X مارك والتعديل رينغر (MMR) : 100 مم كلوريد الصوديوم ، 2 مم بوكل ، 1 ملم MgCl ₂ ، 2 مم CaCl ₂ ، 5 ملي HEPES ، ودرجة الحموضة 7.5. إعداد المخزون 10X ، وضبط درجة الحموضة مع هيدروكسيد الصوديوم إلى 7.5.
2. 20X العازلة استخراج (الميزانية) الأسهم الملح : 2 م بوكل ، 20 ملي MgCl ₂ ، 2 مم CaCl ₂ ، فلتر تعقيم وتخزينها في 4 درجات مئوية.
3. استخراج العازلة (الخارجة ؛ الطازجة وتخزينها على الجليد) : 1X الأملاح الخارجة ، 50 ملي السكروز ، HEPES 10MM (1 M الأسهم ، مع معاير KOH بحيث الرقم الهيدروجيني هو 7.7 عندما تضعف إلى 15 مم ؛ فلتر تعقيم ، وتخزينها في aliquots عند 20 درجة مئوية). تعد حوالي 100 مل.
4. تتكون في 1X الأملاح الخارجة قبل الاستخدام ومعاير لدرجة الحموضة 7.8 مع هيدروكسيد الصوديوم : 2 ٪ (W / V) L - 1 - سيستين هيدروكلوريد هيدرات. تعد حوالي 300 مل.
5. CSF - الخارجة : 1X الأملاح الخارجة ، 1 ملم MgCl ₂ (بالإضافة إلى MgCl ₂ موجودة في الأملاح الخارجة ؛ التركيز النهائي 2 مم) ، HEPES 10 مم ، ودرجة الحموضة 7.7 ، 50 السكروز ملم ، 5 ملم EGTA ، ودرجة الحموضة 7.7. تجهيز 50 مل.
6. مثبطات الأنزيم البروتيني : خليط من leupeptin ، chymostatin وpepstatin ، كل حل لتركيز النهائي من 10 ملغ / مل في سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO). في مخزن صغير في aliquots 20 درجة مئوية.
7. 1 م ₂ CaCl.
8. مزيج الطاقة : 150 ملي فوسفات الكرياتين ، 20 ملي ATP ، 20 ملي MgCl _2.
9. فرس حامل المصل موجهة الغدد التناسلية (PMSG) : 100 U / مل PMSG (PG600 ® ، إنترفيت ، شركة ، 021825). تذوب في المياه وتخزينها على 20 درجة مئوية.
10. الإنسان gonadotropin المشيمي (HCG) : 1000 U / مل HCG (CHORULON ® ، إنترفيت ، شركة ، 057176). تذوب في المياه وتخزينها في 4 درجة مئوية.

المعدات :

• القيطم المورق الإناث
• الإبر (18 و قياس 26)
• ماصة باستير
• تتحمل واسعة
• محاقن (1 مل)
• مواسير microcentrifuge (0.5 مل)
• أنابيب البولي جدار سميك (بيكمان ، 349622)
• مواسير ultraclear (14 × 95 مم ؛ بيكمان ، 344060)
• نابذة فائقة السرعة والدوارات (على سبيل المثال ، بيكمان TL - 100 مع تي الدوارات 40 SW وTLA 100.3)
• الأكواب لجمع البيض
• الدلاء أو حاويات لعقد الضفادع الإناث (على سبيل المثال ، 4 - L الأكواب البلاستيكية مع أغطية عيون).

جيم النووية الزرع.

الكواشف :

1. 2.5 ٪ في agarose 0.1XMMR (لصنع أطباق الحقن)
2. 2.5 ٪ سيستين في 1XMMR، pH8.0 ، الذي أعد في اليوم للاستخدام
3. Ficoll
4. 10 ملغ / مل الجنتاميسين (الأسهم 1000X)
5. ارتفاع سرعة استخراج البيض (انظر أعلاه)
6. 100 MgCl ₂
7. 10X MMR (انظر أعلاه)
8. انزيم التقييد (مثل NOTI من نيو انغلاند Biolabs)
9. الحيوانات المنوية تخفيف العازلة (SDB ، انظر أعلاه) ، ونواة الحيوان المنوي (انظر أعلاه)
10. الإنسان gonadotropin المشيمي (HCG) على النحو الوارد أعلاه
11. الزيوت المعدنية (سيغما ، M8410)
12. خطي البلازميد أن قدم مثل التحوير : إعداد خطي البلازميد بتركيز حوالي 100 نانوغرام / ميكرولتر في العقيمة ، nuclease خالية من المياه (تريس ونتجنب EDTA تحتوي على مخازن ، والتي هي سامة إلى حد ما إلى الأجنة). الانزيم تقييد استخدامها ليصبح خطي على البلازميد ليس من الضروري أن يكون هو نفسه واحد المستخدمة في نقل ردود الفعل النووية. نستخدم عادة NOTI لجميع ردود الفعل ، بغض النظر عن ما هو خطي مع البلازميد. بعض معايرة الإنزيم المستخدم في تخفيف رد فعل قد يكون من الضروري ، كما يمكن للانزيم يسبب الكثير من الآثار السلبية على التنمية في مرحلة ما بعد المعيدة. يمكن تنقية البلازميد في عدة طرق مختلفة : نحن عادة استخدام تنقية Qiagen PCR Qiaquick عدة وفقا لتوجيهات مصنعين ؛ تنقية فرقة واحدة من مادة هلامية ليست ضرورية. إذا تتم تنقيته البلازميد باستخدام الفينول / كلوروفورم الاستخراج وهطول الأمطار الإيثانول ، تكون معينة لإزالة جميع آثار المواد العضوية والايثانول.

المعدات :

أطباق Agarose للحقن : في طبق بتري البلاستيك 60 ملم ، وإرساء 35mmX35mm صغيرة تزن قارب على المنصهر agarose 2.5 ٪ في 0.1XMMR المياه لإنشاء الاكتئاب مع القاع agarose المغلفة لملء مع البيض. مرة واحدة agarose وشددت ، في التفاف parafilm وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. جعل الأطباق 2-3 مقدما عن كل ردود الفعل المعدلة وراثيا كنت تخطط للقيام به.

مضخة التسريب : نحن نستخدم مضخة حقن حقنة واحدة من جهاز هارفارد ، ومجهزة حقنة سم 3 / إبرة مليئة الزيوت المعدنية (سيغما M - 8410). كليلة رأس إبرة حقنة (لمنعها من ثقب الأنبوب) وإرفاق أنابيب tygon الغرامة. تشغيل المضخة في 10nl/sec ~ ، وهذا يفترض أن الوقت الإبرة في كل واحدة منها لن يكون هناك أكثر من 1 ثانية. وينبغي تشغيل المضخة قبل لعدة دقائق قبل انطلاق لtransgenesis اليوم لأؤكد أن المكبس لتدفق الحقنة مع مكبس وهذا التدفق المطرد إيجابية من النفط من الأنبوب يحدث.

الإبر لنقل المواد النووية. باستخدام مجتذب micropipette ، وتوليد الإبر مع نصائح وطويلة المنحدرة. هذه القصاصة مع forcep تحت المجهر تشريح مجهزة ميكرومتر العين للحصول على 80 ميكرون ~ فتح مع شكل مشطوف.

معدات أخرى : القيطم المورق الإناث ، stereomicroscope ، حاضنة ، micromanipulator ، microinjection مجتذب الإبرة (على سبيل المثال النموذجي P - 87 ، سوتر) ، والإبر محقنة (26 مقياس) ، والإبر microinjection الزجاج ، والعين لقطة ميكرومتر معايرة من النصائح إبرة microinjection 80μm إلى قطرها ، أطباق بتري ، وزن الزوارق 35mm ، Tygon أنابيب (ID = 1 / 32 بوصة ، OD = 3 / 32 بوصة)