فحص التقاط الفريسة: طريقة لدراسة سلوك التقاط الفريسة ليرقة الزرد

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Muto, A., et al. استئصال مجموعة عصبية باستخدام ليزر ثنائي الفوتون وتقييمه باستخدام تصوير الكالسيوم والتسجيل السلوكي في يرقات الزرد. J. Vis. Exp.(2018)

يصف هذا الفيديو مقايسة التقاط الفريسة. يناقش الفيديو طريقة دراسة سلوك التقاط الفريسة ليرقات الزرد بعد الاستئصال بالليزر لخلايا عصبية معينة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

< p class = "jove_title" >1. تقييم العواقب السلوكية بعد الاستئصال بالليزر

قم بإعداد نظام تسجيل سلوكي يتكون من مجسم مزود بكاميرا فيديو. استخدم كاميرا مزودة ببرنامج مناسب للحصول على الصور ، تجاريا أو مخصصا (الشكل 1 أ).
قم بتحسين حالة الإضاءة بحيث يمكن اكتشاف البارامسيوم عن طريق معالجة الصور. على سبيل المثال ، استخدم مصباح LED أبيض حلقي مع فاصل (الشكل 1 ب).
ملاحظة: تؤثر المسافة من مؤشر LED وزاويته على مظهر العينة (أي ساطعة في الخلفية الداكنة أو الداكنة في الخلفية الساطعة) وبالتالي فهي ضرورية لمعالجة الصور بنجاح. حدد أفضل ارتفاع للفاصل (الشكل 1 ج).
ضع يرقة الزرد (المستردة من تجربة الاستئصال بالليزر الموضحة في القسم 1) في غرفة تسجيل سلوكية (تم توصيلها بشريحة زجاجية) مع إزالة الختم العلوي الأصلي (الشكل 1 د).
اجمع 50 باراميسيا معلقة في الماء من الدورق باستخدام ماصة دقيقة وضعها في غرفة التسجيل.
ضع زلة غطاء أعلى حجرة التسجيل. ضع قطرة صغيرة من الماء على زلة الغطاء قبل وضعها على سطح الماء في غرفة التسجيل لتجنب إدخال الهواء في الغرفة.
ملاحظة: في هذه الخطوة ، سوف يفيض بعض الماء مع paramecia من غرفة التسجيل. سيكون العدد المتبقي من الباراميسيا في غرفة التسجيل حوالي 30-40.
ضع غرفة التسجيل (التي تحتوي على يرقة وباراميسيا) في نظام الإضاءة (الشكل 1 د).
ابدأ التسجيل بفاصل زمني بمعدل 10 إطارات في الثانية لمدة 11 دقيقة (6,600 إطار).
(اختياري) لكل يرقة تم اختبارها من حيث السلوك ، لاحظ تألق المناطق المفصولة بالليزر بواسطة الفحص المجهري الفلوري لتأكيد فعالية الاستئصال بالليزر (أي الغياب ، أو انخفاض عدد الخلايا الفلورية بشكل كبير في المنطقة المشعة بالليزر).
ملاحظة: حتى بعد التشعيع ، لا يزال من الممكن ملاحظة بعض الخلايا الفلورية بسبب ظهور التعبير الجيني Gal4 في الخلايا التي تمايزت بعد الاستئصال.
بعد تسجيل سلوك اليرقة ، للتعويض عن عدم التوحيد في الخلفية ، قم بإجراء تقسيم بكسل لكل إطار بواسطة صورة متوسطة في فيجي: انقر فوق "معالجة" و "حاسبة الصورة" و "العملية: قسمة" و "نتيجة 32 بت (تعويم)" و "موافق". لإنشاء صورة متوسطة ، انقر فوق "صورة" و "مكدس" و "Z-Project" و "متوسط الكثافة" و "موافق" (الشكل 1E ، F).
احسب عدد الباراميسيا المتبقية في الغرفة بالنقر فوق "تحليل" ، "تحليل الجسيمات" ، وتعيين نطاق منطقة يغطي جميع الباراميسيا ، وتحديد مربع الاختيار "إظهار: أقنعة" ، والنقر فوق "موافق". سيوفر خيار "Show: Masks" صورة paramecia مستخرجة (الشكل 1G) ، مع قائمة بعدد الجسيمات (paramecia) في كل إطار.
ارسم عدد الباراميسيا المتبقية في غرفة التسجيل بمرور الوقت. نظرا لأن تقديرات عدد الباراميسيا صاخبة، فإننا نوصي بإجراء متوسط متحرك لكل نقطة في نطاق 600 إطار (1 دقيقة) في جدول البيانات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content" > figure-results-1
الشكل 1. فحص التقاط الفريسة والبيانات التمثيلية في يرقات الزرد المفصولة بالليزر.(أ) نظام التسجيل السلوكي. تم تجهيز المجهر المجسم بكاميرا CMOS. تم الحصول على الصور باستخدام نص مخصص. (ب) مكونات نظام الإضاءة. ورق رمادي اللون ، وموزع زجاجي ، ومصباح حلقة LED أبيض ، وموزع ، وفاصل مصنوع حسب الطلب (من الورق المقوى) ، وموزع مع ثقب في المنتصف. (ج) نظام الإضاءة المجمع من ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات غرف التصوير جريس بيو لابز غرف التصوير CoverWell PCIA-2.5 تستخدم كغرفة تسجيل سلوكية أوركا فلاش 4.0 هاماماتسو الضوئيات الموديل: C11440-22CU كاميرا CMOS علمية SZX7 أوليمبوس مجسم حلقة ضوء LED احتجاز الكربون وتخزينه الموديل: LDR2-100SW2-LA LED أبيض حشية غرفة التهجين الآمنة ، 8 غرف ، قطر 9 مم × عمق 0.8 مم المجسات الجزيئية كتالوج # S-24732 تستخدم كغرفة تسجيل في تصوير الكالسيوم

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

فحص التقاط الفريسة: طريقة لدراسة سلوك التقاط الفريسة ليرقة الزرد

في هذه المقالة

الملخص

البروتوكول

النتائج

المواد

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة