Method Article

فحص السمية الكيميائية القائمة على الجنين: تقييم التأثيرات على نمو أجنة أسماك الزرد

April 30th, 2023

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Hao J. et al. ، شاشة جزيئية صغيرة كبيرة الحجم تعتمد على أسماك الزرد في الجسم الحي. J. Vis. Exp. (2010)

في هذه المقالة ، يتم استخدام أجنة الزرد لفحص السمية الكيميائية. ترتبط السمية الكيميائية بقراءات النمط الظاهري. يوضح بروتوكول العينة نهجا منهجيا لإجراء فحص السمية الكيميائية.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. نقل مكتبة الجزيئات الصغيرة

بينما يمكن أتمتة النقل المركب باستخدام طرق النقل الآلي ، سنصف طريقة النقل اليدوي.

  1. عادة ما يتم توفير مكتبات الجزيئات الصغيرة بتنسيق 96 بئرا ، مع تخزين كل مركب في DMSO كمخزون 10 مليمتر. قبل حوالي 60 دقيقة من وصول الأجنة إلى المرحلة التي سيتم فيها إضافة المركبات ، قم بإذابة العدد المطلوب من ألواح 96 بئرا تحتوي على حصصات من جزيئات صغيرة (لوحة المصدر). لاحظ رقم التعريف التسلسلي أو غيره من الأرقام التعريفية للوحات المصدر. لتقليل التكثيف على الألواح ، يمكن أن يحدث الذوبان في غرفة الجفاف التي تحتوي على Drierite (W.A. HAMMOND DRIERITE CO ، Xenia ، OH).
  2. قم بتدوير الألواح لفترة وجيزة في جهاز طرد مركزي منضدي مزود بمحول لوحة متعدد الآبار.
  3. قم بإزالة شريط الختم المصنوع من الألومنيوم من لوحة المصدر. باستخدام ماصة ذات 12 قناة ، قم بتخفيف المركبات الموجودة في لوحة المصدر إلى تركيز 0.5 ملي مولار (على سبيل المثال ، إذا بدأت ب 250 nL من مخزون 10 ملي مولار ، أضف 4.75 ميكرولتر من DMSO إلى كل بئر).
  4. عندما تصل الأجنة الموجودة في الصفيحة المكونة من 96 بئرا (الصفيحة المتلقية) إلى المرحلة المرغوبة ، استخدم ماصة من 12 قناة (2-20 ميكرولتر) لنقل 2.5 ميكرولتر من المركبات (0.5 ملليمتر) من صفائح المصدر إلى الصفائح المستقبلة التي تحتوي على الأجنة.
  5. سجل رقم تعريف لوحات المصدر على لوحات الجنين المتلقي. قم بتغطية الألواح المتلقية التي تحتوي الآن على الأجنة والمركبات بأغطية ، واخلط الألواح برفق عن طريق التدوير برفق ، وضعها في حاضنة 28.5 درجة مئوية.
  6. قم بتغطية كل لوحة مصدر تحتوي على جزيئات صغيرة غير مستخدمة (0.5 ملم) بشريط مانع للتسرب من الألومنيوم وضعها في فريزر -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل.
< p class = "jove_title" >2. فحص تأثيرات الجزيئات الصغيرة عن طريق الفحص البصري للأنماط الظاهرية

  1. قبل إجراء الشاشة ، قم بصياغة معيار محدد لما يمكن أن يشكل "ضربة".
  2. في الأوقات المرغوبة في التطوير ، قم بإزالة الألواح المكونة من 96 بئرا التي تحتوي على أجنة معالجة بالمركبات من الحاضنة وفحص كل بئر تحت مجهر مجسم. للحصول على تصور أفضل للتغيرات الطفيفة ، مثل التغيرات في نمط الدورة الدموية ، يمكن استخدام مجهر مقلوب بتباين الطور. يمكن استخدام الفحص المجهري الفلوري لفحص اضطراب التعبير عن بروتينات GFP أو DsRed تحت محفز خاص بالأنسجة.
  3. امسح بسرعة الألواح المكونة من 96 بئرا بحثا عن أي بئر يظهر فيه ما لا يقل عن 3 من كل 5 أجنة النمط الظاهري "الضارب" الموصوف. سجل هوية اللوحة وموقع البئر لكل ضربة محتملة.
  4. أعد تأكيد الضربة المحتملة عن طريق إعادة اختبار تأثيرات المركب بعدة جرعات (1 ميكرومتر ، 5 ميكرومتر ، 10 ميكرومتر و 50 ميكرومتر). لكل جرعة ، يتم اختبار 10 أجنة في 0.5 مل من وسائط E3 في شكل لوحة 48 بئرا. يجب أن يكون توقيت الإضافة المركبة لإعادة الاختبار مطابقا لتوقيت الفحص الأصلي. يتم تأكيد الضربة عندما يتم استنساخ النمط الظاهري المستحث عند إعادة اختبار المركب
  5. حدد المركب الضار من قاعدة بيانات الجزيئات الصغيرة في المكتبة الكيميائية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article Name Company Catalog Number Comments مكتبة جزيئات صغيرة من المركبات المتنوعة هيكليا مصفوفة بتنسيق 96 wll بمخزون 10 ملي مولار في DMSO. يتم تقسيم كل لوحة رئيسية إلى ألواح تخزين من مادة البولي بروبيلين سعة 96 بئرا (Corning) ، ويتم تخزينها عند درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى
استخدام. دريريت شركة دبليو إيه هاموند دريرايت ، زينيا ، أوهايو ماصات ذات 12 قناة، 2-20 ميكرولتر إيبندورف شريط ختم من الألومنيوم لألواح 96 بئر نونك ، روتشستر ، نيويورك DMSO سيجما ، سانت لويس ، ميزوري حاضنة أساسية ، 28.5 درجة مئوية فيشر ساينتيك ألواح فحص البوليسترين 96 بئر مستديرة القاع كورنينج كوستار. لويل ، ماساتشوستس مجهر مجسم مع قاعدة ضوئية مرسلة لايكا مايكروسيستمز ، بانوكبورن ، إلينوي وسط الجنين E3: 5 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.17 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.33 ملي كاستمر الكالسيوم 2 ، 0.33 ملي ملي مجم سولات 4 ، يحتوي على 0.003٪ PTU (فينيلثيوكارباميد ، سيجما ؛ سانت لويس ، ميزوري). يمكن تحضير PTU كمحلول 10x عن طريق إذابة 0.3 جم PTU في 1 لتر من وسائط الجنين E3. يجب حماية المحاليل التي تحتوي على PTU من الضوء عن طريق تغطيتها بورق الألمنيوم.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Zebrafish EmbryosChemical Toxicity ScreenSmall Molecule LibraryForebrain DevelopmentPhenotype Readout96 Well PlateDMSO DilutionMicroscope ExaminationHit ConfirmationDose Response

Related Articles