حقن المورفولينو: طريقة لضربة قاضية للتعبير الجيني المستهدف لدراسة الوظيفة في أسماك الزرد

الملخص

المصدر: Hyde D.R., et al. في الجسم الحي التثقيب الكهربائي للمورفولينوس في زعنفة ذيل الزرد البالغة المتجددة. J. Vis. Exp. (2012)

يصف البروتوكول الضربة القاضية المستهدفة للتعبير الجيني في أسماك الزرد عن طريق حقن مورفولينو في الذيل.

البروتوكول

< ص الفئة = "jove_title" >1. حقن مورفولينو

1. في اليوم السابق لحقن المورفولينو ، قم بعمل لوحة حقن (الشكل 1). تأكد من قطع شق في أحد طرفي البئر ، مما يساعد على استقرار الأسماك لإجراء الحقن المجهري.
2. خفف المورفولينو الموسوم بالفلورسين إلى التركيز المناسب (يوصى بالبدء ب 1.2 ملليمتر) وضعه في حمام مائي 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
3. قم بتحميل الإبرة بالمورفولينو (ملاحظة: اعتمادا على ما إذا كنت تقوم بالملء الخلفي أو التحميل الأمامي ، ستحدد إبرتك ما إذا كنت تقوم بتحميل الإبرة أولا ، أو قص الطرف أولا).
4. قطع طرف الإبرة بزاوية.
5. اتبع إرشادات نظام الحقن الدقيق الخاص بك لحقن ما يقرب من 5 فقاعة من المورفولينو لكل حقنة. يمكن أن تؤدي الكميات الأكبر من المورفولينو إلى تعطيل الأنسجة.
6. قم بتخدير السمك ووضعه على طبق الحقن. قم بإزالة كل السوائل الزائدة وتوجيه الإبرة إلى المكان المناسب ، فقط بعيدا عن الشعاع العظمي (الشكل 2). باستخدام المجهر وجهاز الحقن المجهري المناسب لحقن المورفولينو (انظر جدول الكواشف المحددة) ، قم بحقن المورفولينو في الزعنفة من الأمام إلى الخلفي ، كما هو موضح في الشكل 2. يؤدي الحقن من الخلف إلى الأمامي إلى تدحرج أنسجة الزعنفة أثناء الحقن وهو أمر صعب للغاية.
7. أدخل الإبرة برفق في الأنسجة المتجددة ، فقط بعيدا عن كل شعاع عظمي (يحمل علامة "1" في الشكل 2) وادفع بعيدا حتى تقع في الأريمية (المشار إليها ب "2" في الشكل 2). احرص على عدم دفع الإبرة عبر الزعنفة بأكملها. عندما يتم تحديد موقع الإبرة بشكل صحيح ، قم بحقن المورفولينو (أي انقر مرة واحدة). عند 1.2 ملي مولار ، يظهر محلول مورفولينو الموسوم بالفلورسين أصفر-أخضر ، حتى في ظروف الإضاءة العادية. مع كل حقنة ، يمكن تصور "نفخة" صفراء من محلول مورفولينو ، مما يساعد على توطين الحقن في الأريمة. يجب حقن ما يقرب من 75 nl (10-15 نقرة) من محلول مورفولينو لكل شعاع عظمي. توقف مؤقتا ~ 1 ثانية بين النقرات. نقوم فقط بحقن الجانب الظهري ، باستخدام البطني كتحكم في التثقيب الكهربائي فقط.

النتائج

الشكل 1. أ. تخطيطي للوحة الحقن ، وهي مصنوعة من الاغاروز وتحتوي على بئر صغير لحمل الأسماك أثناء الحقن المجهري للمورفولينو.

الشكل 2. تخطيطي للحقن المجهري مورفولينو. أ. ضع السمكة في الطبق مع رأس السمكة في الشق المقطوع من البئر ، مما يساعد الأسماك على البقاء مستقرة. ب. عند التكبير ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مورفولينو GeneTools، ذ م م يجب أن يكون Morpholino مصمما خصيصا للبروتين الذي يثير اهتمامك مضخة الحقن الدقيقة شركة World Precision Instruments، Inc. PV830 مضخة بيكو الهوائية يمكن استخدام العديد من أنظمة الحقن المجهري المختلفة مناور دقيق شركة World Precision Instruments، Inc. MMJR اليد اليمنى (MMJL لليد اليسرى) إبر الحقن الدقيقة ، قطر خارجي 1.0 مم شركة World Precision Instruments، Inc. 1ب 100 إف -4 هذه هي الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات ، المسحوبة في إبرة حامل إبرة شركة World Precision Instruments، Inc. 5430-الكل طقم فوهة بيكو؛ تأكد من إدخال حشية الماصة مقاس 1.0 مم مجتذب إبرة شركة سوتر للأدوات ف-97 يجب أن تعمل أيضا مجحبات الماصات الدقيقة / الإبرة الأخرى مجهر لايكا ، نيكون ، زايس يختلف العدد حسب الشركة المصنعة أي مجهر مجسم مع بصريات 20X والقدرة على العمل مع أجهزة المعالجة الدقيقة 2-الفينوكسي إيثانول سيجما ألدريتش 77861-1 لتر التخدير ؛ تخفيف 1: 1000 في ماء نظام السمك للإجراء ، 1: 500 للقتل الرحيم